Gelişmekte olan Fare Retina in vivo Elektroporasyon olarak

Kazanç ya da fonksiyon çalışmalar kaybı ya da yerine bir amaç için fare retina hücreleri içine plazmid DNA eklenmesi için bir yöntem

Bu prosedürün genel amacı, genetik materyali retina hücrelerine stabil bir şekilde sokmak için yenidoğan fareler üzerinde in vivo bir elektroporasyon deneyi yapmaktır. Bu, yaklaşık beş ila 10 dakika boyunca buz üzerinde bir yenidoğan faresi olan ilk anestezi ile gerçekleştirilir. İşlemin ikinci adımı, kaynamış göz kapaklarının birleşim yerinin belirlenmesi ve bu bağlantı noktası boyunca kesilerek gözün açılmasıdır.

Daha sonra mikroenjeksiyon şırıngasının yerleştirilmesini kolaylaştırmak için gözde bir kesi yapılır. Mikro enjeksiyon şırıngası daha sonra kesiden sokulur ve DNA çözeltisi subretinal boşluğa enjekte edilir. Son olarak, popun kafasına bir cımbız elektrodu yerleştirilir ve bir dizi elektrik darbesi verilir.

Bu tekniğin retroviral transdüksiyon gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, in vivo elektroporasyonun, gen iletimi için araçlar olarak biyolojik ajanların üretilmesini ve işlenmesini gerektirmemesidir. Sonuç olarak, teknik daha az emek, daha az reaktif gerektirir ve hayvan prosedürleri için onaylanmış herhangi bir iş istasyonunda gerçekleştirilebilir. Genel olarak, tekniğe yeni olan kişiler, mikroenjeksiyon şırıngasının subretinal boşluğa yerleştirilmesi için bir his geliştirmek zaman ve tekrar gerektirdiğinden mücadele edecektir.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımda doktora sonrası bir araştırmacı olan Jimmy DeMilo olacak. Elektroporasyon için gerekli DNA konsantrasyonu nispeten yüksek olduğundan, istenen plazmit DNA önce bir maxi prep kullanılarak ekstrakte edilen yetersiz hücreler amplifiye edilir, daha sonra saflaştırılır ve mikrolitre başına yaklaşık beş mikrograma konsantre edilir. Hızlı yeşil FCF boyası, enjeksiyon izleyici olarak eklenir.

Plazmid DNA'sı hazırlandıktan sonra, anestezi uygulanmış yenidoğan fare yavruları yaklaşık beş dakika boyunca buz üzerinde, bilinç kaybı ayak pedi kompresyonuyla doğrulanana kadar onları izler. Enjekte edilecek göz bölgesini %70 isop profil alkol ile değiştirin ve göz kapaklarının bir araya geldiği FUS bağlantı epitelini belirlemek için bir diseksiyon mikroskobu kullanın. 30 gauge keskin bir iğne kullanarak, aşırı aşağı doğru basınç uygulamadan veya göz kapağı aralığının ötesinde kesmeden, kaynaşmış bağlantı epiteli boyunca keserek gözü dikkatlice açın.

Göz kapağı açıldıktan ve göz açığa çıktıktan sonra, iğnenin ucunu kullanarak sklerada kornea ile birleşim noktasına yakın küçük bir kesi yapın, çok derine nüfuz etmemeye ve lensi delmemeye dikkat edin. Künt uçlu enjeksiyon iğnesini insizyona sokun. Karşıt skleral duvarın direnci hissedilene kadar, yavaşça 0.3 mikrolitre viskoz DNA solüsyonunu subretinal boşluğa enjekte edin.

Skleral duvara çok sıkı bastırmamaya dikkat ederek, DNA çözeltisinin retina içinde eşit bir şekilde yayılıp yayılmadığını kontrol etmek için hayvanı döndürün. İlk olarak, elektrik iletkenliğini en üst düzeye çıkarmak için cımbız elektrodunu PBS'ye batırın. Daha sonra enjekte edilen yavrunun başını, enjekte edilen göz pozitif kutup elektroduna bitişik ve enjekte edilmemiş göz negatif kutup elektroduna bitişik olacak şekilde elektrotlar arasına yerleştirin.

Her darbenin 80 volt ve süresi 50 milisaniye olan ve darbeler arasında 950 milisaniyelik bir aralıkla bir darbe üreteci kullanarak beş kare darbe uygulayın. Son olarak, yavruları buz anestezisinden kurtulana kadar bir ısıtma lambası altında ısıtın. İyileştikten sonra, elektroporasyonlu yavruları doğum sonrası üçüncü günde annelerine geri verin.

EGFP elektroporasyonlu hücrelerin çoğu retinal nöroplastik tabakada bulunur ve retinanın farklılaşmış nöral glial hücrelerinin hiçbirinin belirgin morfolojik özelliklerini göstermez. Doğum sonrası 14. günde, elektroporatlı hücreler retinanın dış nükleer tabakasında ve iç nükleer tabakasında ve çeşitli etiketli hücrelerde bulunabilir. Şimdi farklılaşmış nöronların karakteristik morfolojik özelliklerini gösterin.

Bu prosedürü denerken, tüm adımları sorunsuz ve eşit bir şekilde gerçekleştirmek önemlidir. Mikroenjeksiyon sırasında retinalara zarar vermek çok kolaydır ve doku hasarını önlemek için gereken el becerisini geliştirmek için gerekli uygulamalardır. Bu prosedürü takiben.

İmmünohistokimya veya in situ hibridizasyon gibi diğer yöntemler, ilgilenilen genlerin ekspresyonunun elektro retinalarda yukarı veya aşağı regüle edilip edilmediğini belirlemek için gerçekleştirilebilir.