Bromodeoxyuridine (BrdU) Etiketleme ve Çözünmüş Organik Kültür bağımsız Kimlik sonraki Floresan Aktive Hücre Sıralama Karbon-aşağılayıcı Bacterioplankton

Mikroplar, sucul ortamlar gibi alanlarda, çok sayıda çözünmüş organik karbon substratının veya DOC bileşiklerinin bozunmasını yönetirler. Mikropların DOC dönüşümündeki rolünü tam olarak anlamak için, taksonomilerinin ve işlevlerinin eş zamanlı olarak tanımlanması gereklidir. Bu video, sucul ortamlarda spesifik DOC havuzlarını dönüştüren serbest yaşayan bakterilerin veya bakteriyel planktonların taksonomik tanımlamasına yönelik bir prosedürü göstermektedir.

Bir test ortamından toplanan su örnekleri işlenir ve ilgilenilen bir bileşik ile yeni sentezlenen DNA'ya ve aktif olarak büyüyen hücrelere dahil olan bromo deoksiüridin, BRDU ile inkübe edilir. Ardından BRDU işaretli bakteri planktonları, ZI konjuge anti-BRDU antikorları ile işaretlenir. Yüksek düzeyde BRDU işaretlemesi olan bakteri planktonları, floresanla aktive edilmiş hücre ayırma yöntemiyle izole edilir.

Ardından, ayrıştırılmış hücrelerden DNA ekstraksiyonu yapılır ve PCR tabanlı 16 s ribozomal RNA geni analizi sonuçlarına dayanarak taksonomik tanımlama gerçekleştirilir. Merhaba, ben Kent State Üniversitesi Biyolojik Bilimler Bölümü'nden Dr. Chen Mao'nun laboratuvarından Steven Robbins. Bugün size, sucul ortamlardaki DOC degrade eden bakteriyel planktonların tanımlanması için kültürden bağımsız bir yöntemi göstereceğim.

Bu tekniğin, besin maddesi takviyeleri ve ardından bakteriyel topluluk DNA analizi gibi mevcut yöntemlere karşı temel avantajı, analizi yüksek derecede aktif bakterilere odaklaması ve uyuyan ile yavaş büyüyen hücreleri hariç tutmasıdır. Burada, belirli bir DOC bileşiğini kullanan bakteri planktonlarının tanımlanmasını gösteriyoruz. Ancak bu yöntem, diğer tekil DOC bileşiklerini veya alg eksüdaları gibi DLC gruplarını kullanan bakteri planktonlarını incelemek için de uygulanabilir.

Öyleyse birkaç su örneği alalım ve başlayalım. DOC degrade eden bakteriyel planktonlar için su örnekleri analiz edilmeden önce, su örnekleri uygun şekilde işlenmelidir. Burada gösterilen örnekler, büyük partikülleri ve ER VRE'leri su örneğinden uzaklaştırmak için Georgia kıyısından toplanmıştır.

Toplama karboyundaki suyu, 1 mikrometre gözenek boyutuna sahip bir filtre içeren filtrasyon ünitesine aktarmak için peristaltik bir pompa kullanın. Ardından, süzüntünün 36 mililitrelik alıkotlarını, her biri taze hazırlanmış %10'luk Paraformaldehit çözeltisinin 4 mililitresini içeren üç adet steril 50 mililitrelik polipropilen tüpe aktarın. İnkübasyon sonrası hücreleri korumak için oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin.

Suyu, 0,22 µm gözenek boyutuna sahip beyaz membran filtreli cam vakumlu filtrasyon ünitesinin filtrasyon kulesine dökün ve çözeltiyi çekmek için vakumu uygulayın. Vakumlu filtreden 10 mL PBS geçirerek filtreyi yıkayın. Filtreleri negatif kontrol olarak etiketleyin ve -20 °C'de saklayın.

Deneysel bir ekosistem veya mikrokozmos oluşturmak için, önceden durulanmış altı adet bir litrelik cam erleni 800 mililitre ön filtrelenmiş su örneği ile doldurarak başlayın. Her bir mikrokozmosa, final konsantrasyonu 10 micromolar olacak şekilde BRDU ekleyin. Karıştırmak için erleni elinizle hızla döndürün.

Her bir örnek üç paralel şeklinde analiz edilecektir. Bu nedenle üç mikrokosma model DOC bileşiği ekleyin. Burada, mikrokosmalara final konsantrasyonu 100 nanomolar olacak şekilde reine eklenir.

Ardından, diğer üç mikrokozma steril PBS ekleyin. Bunlar DOC içermeyen kontroller olarak hizmet edecektir; tüm mikrokozmaları karanlıkta, in situ sıcaklık olan 25 °C'de, 100 RPM'lik çalkalamalı bir inkübatöre yerleştirin. Buradaki zaman noktaları 0, 8, 16 ve 24 saattir.

Her bir mikrokozmostan 36 mililitre örneği, içinde dört mililitre taze %10 paraformaldehit bulunan 50 mililitrelik steril polipropilen tüplere toplayın ve hücreleri sabitlemek için oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. Ardından, korunan hücreleri 0,22 mikrometre gözenek boyutundaki beyaz membran filtrelerden süzün. PFA kalıntılarını yıkamak için vakum filtresinden 10 mililitre PBS uygulayın.

Hemen IN situ immüno tespitine geçin veya bakteriyel planktonlardaki BRDU inklüzyonunu analiz etmek için filtreleri -20 °C'de saklayın. Bakteriyel hücre duvarını bozmak için örnek filtreleri oda sıcaklığında hazırlayarak başlayın. Filtreyi bir filtrasyon ünitesine yerleştirin, ardından hücreleri kaplayacak şekilde filtre üzerine 1 mL lizozim çözeltisi pipetleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, çözeltiyi uzaklaştırmak için vakum uygulayın. Çözelti filtreden geçtikten sonra, 10 mililitre PBS ekleyerek hücreleri yıkayın ve vakum uygulayın. Daha sonra, hücre duvarını daha fazla bozmak için hücrelerin üzerini kaplayacak şekilde filtreye bir mililitre proteinaz K çözeltisi ekleyin.

Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Tek tabakalı DNA elde etmek için PBS ile yıkayın. Filtredeki hücreleri kaplayacak şekilde bir mililitre eksonükleaz solüsyonu ekleyin.

37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, vakum filtresinden 10 mL PBS geçirerek filtreyi yıkayın. Ardından, hücre içermeyen kısmı uzaklaştırmak için filtrenin kenarlarını kesin.

Ardından, alkolle temizlenmiş kuru bir yüzey üzerinde, steril bir bıçak kullanarak filtreyi sekiz eşit parçaya bölün. Her örnek için sekiz adet çerçeve sızdırmaz inkübasyon odası gereklidir; filtrenin sekizde birini, örnek yüzeyi yukarı gelecek şekilde monte edilmiş çerçeve sızdırmaz inkübasyon odasına yerleştirin. Odalar monte edildikten sonra, A-B-R-D-U işaretli hücreleri in situ tespit etmek için Roche Intu hücre proliferasyon kiti flus kullanın.

Bekleme prosedürleri tamamlandıktan sonra, filtre bölümünü inkübasyon odasından çıkarın ve steril bir yüzeye yerleştirin; steril bir bıçak kullanarak filtre bölümünü küçük parçalara ayırın. Filtre parçalarını, bir mililitre PBS içeren iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın, tüpü sıkıca kapatın ve parafilm ile mühürleyin. Ardından tüpü, sarsıntılı bir inkübatörde 37 °C ve 200 RPM'de 10 dakika boyunca inkübe edin.

İnkübasyonun ardından tüpü sabitleyin ve maksimum hızda vorteksleyin. Beş dakika boyunca, SUP süpernatantını steril 15 mililitrelik bir polipropilen tüpe pipetleyin. Ardından filtreyi PBS içinde yeniden süspande edin ve her örnek için süpernatantı aynı 15 mililitrelik tüpe ekleyerek vorteksleme ve inkübasyon adımlarını iki kez daha tekrarlayın.

Yeniden süspande edilen hücreleri dört degrees Celsius'te saklayın. Örnek, iki gün içinde analiz edilmelidir. Son olarak, yüksek düzeyde BRDU inklüzyonuna sahip popülasyonu elde etmek için hücreleri ayıklayın.

Burada, bir BD facs area akış sitometresi ve ilgili yazılım kullanılmıştır. Hücreler ayrıştırıldıktan sonra, BRDU ile zenginleştirilmiş popülasyonun taksonomik kimliğini belirlemek için analiz yapılabilir. Ayrıştırılan bakterilerin 16 s ribozomal RNA genlerini çoğaltmak için PCR'lar gerçekleştirilir; ayrıştırılan hücreleri beyaz 0.22 gözenek boyutlu bir polikarbonat membran filtreye pipetleyin ve vakum pompasını çalıştırın, ardından steril bir bıçak kullanarak filtrenin hücre içermeyen kenarlarını kesin.

Filtreyi her bir koşul için dört eşit parçaya bölün, hücreler tüpün iç kısmına bakacak şekilde üç PCR reaksiyon tüpünün her birine bir adet filtre parçası yerleştirin. 45 µL PCR grade su ekleyin. Filtre bölümünün suyun içinde tamamen batmasını sağlayın.

Ardından, iki adet Roche illustra pure T ready to go PCR boncuğu ekleyin ve boncukların çözünmesine yardımcı olmak için kısa süreli vorteksleyin. Daha sonra, ikişer mikrolitre ileri ve geri 16 s ribosomal RNA geni primeri ekleyin.

Amplifikasyon inhibitörlerinin absorbe edilmesine yardımcı olmak için ya bir mikrolitre BSA ya da bir mikrolitre su ekleyin. PCR amplifikasyonunu bir termal döngüleyici cihazda gerçekleştirin. Tavsiye edilen touchdown PCR programında, tavlama sıcaklığı her döngüde bir derece santigrat azalacak şekilde 62'den 52 derece santigrata kadar düşürülür ve ardından 52 derece santigratta 15 döngü uygulanır.

PCR amplifikasyonunu bromür ile boyanmış %1'lik Agros jeller üzerinde elektroforez yoluyla doğrulayın; PCR amplikonlarını jelden kesin ve bir KaiGen cayo quick gel extraction kiti ile temizleyin. PCR jel saflaştırmasının ardından, aynı örneğe ait amplikonları bir araya getirin. Saflaştırılmış 16 s ribozomal DNA amplikonları artık bir dizi moleküler analiz için hazırdır.

Örnekler, Georgia'nın kıyı bölgelerinden toplanmış ve bu videoda açıklanan prosedürler takip edilerek Racine parçalayan bakterileri incelemek üzere işlenmiştir. Racine, deniz ortamlarında yaygın olarak bulunabilen poliamor bir bileşiktir. Burada gösterildiği üzere, deniz bakterileri için bir besin ve enerji kaynağı olarak hizmet edebilir.

Numunelerin gerçek analizleri, 24 saatlik inkübasyonun ardından Racine katkılı mikrokozmoslarda, BRDU inkorporasyon düzeyi ile pozitif ilişkili olan ve daha yüksek FXI floresan yoğunluğuna sahip bir bakteri grubunun geliştiğini ortaya koymuştur. Bu hücreler, yüksek BRDU inkorporasyonlu hücreler veya HI olarak adlandırılmış ve çoğunlukla Racine degrade eden bakteriler içermelerinin beklendiği belirtilmiştir. Hi yok.

Hiçbir ekleme yapılmayan kontrollerde, sadece daha düşük BRDU inklüzyon seviyelerine sahip ve lii hücreleri olarak adlandırılan hücreler bulunmuştur; bunların esas olarak kullanımı mümkün olmayan bakteriyel planktonları içermesi bekleniyordu. Eklenen Racine HI hücreleri ayrı tüplere ayrılmış ve ardından membran filtrelere toplanmıştır. Filtre PCR sonrası kısmi 16 ribosomal RNA geni amplikonları elde edilmiş ve jel elektroforezi ile doğrulanmıştır.

Sıralama filtresinin ardından, sıralanmış hücreler arasındaki fonksiyonel çeşitliliği incelemek için fonksiyonel genlerin PCR amplifikasyonu da gerçekleştirilebilir. Floresan aktivasyonlu hücre sıralaması ile BrdUleleme yöntemlerini birleştiren bir yaklaşımla, sucul ortamdaki fonksiyonel bakteriyel hücrelerin fiziksel olarak nasıl ayrıştırılacağını ve tanımlanacağını gösterdik. BrdU'nun tehlikeli olduğunu unutmayın; bu prosedür gerçekleştirilirken her zaman bir laboratuvar önlüğü ve eldiven giyilmelidir.

İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.