Name: Bromodeoxyuridine (BrdU) Etiketleme ve Çözünmüş Organik Kültür bağımsız Kimlik sonraki Floresan Aktive Hücre Sıralama Karbon-aşağılayıcı Bacterioplankton (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 46 s
Description: Öğrenin, BrdU etiketleme ve FACS kullanarak sucul ortamlarda DOC parçalayan bakteriyoplanktonları izole etme yöntemini. Bu teknik, aktif bakterileri tanımlayarak karbon döngüsü araştırmalarını destekler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu projenin finansmanı Ulusal Bilim Vakfı hibe OCE1029607 (XM) ve MCB0702125 (MAM) ve Gordon ve Betty Moore Vakfı (MAM) tarafından sağlandı.

1. Su örneği işleme <ol><li> Filtre 1 mikron gözenek boyutlu membran filtreler aracılığıyla 10L çevre su büyük parçacıklar ve bacteriovores kaldırın. Bir damacana su süzüntü toplayın. </li><li> Transferi 3 4 ml taze hazırlanmış paraformaldehid çözüm (% 10 PFA) içeren steril Eppendorf tüpleri (50 ml) içine 36 ml süzüntü her. Hücreleri korumak için 2 saat oda sıcaklığında inkübe edin. Vakum filtrasyon ile 0.22 mikron-gözenek boyutlu beyaz membran filtreler üzerine hücreleri toplayın. Vakum filtrasyonu filtre üzerinden geçen 10 ml salin (PBS) ve fosfat tamponlu filtre yıkayın. Negatif kontrol olarak filtreleri Etiket ve -20 ° C'de saklayın </li></ol> Adımlar 1,3-1,4 DOC sınırlı koşullar oluşturulması için isteğe bağlıdır. <ol start="3"><li> (5 mcM NH 4 Cl, 5 mcM NaNO 3, ve 1 mikrona NaH 2 PO 4 final konsantrasyon) damacana inorganik azot ve fosfor karışımı ekleyin. </li><li> Zaman zaman ajitasyon ile 48 saat boyunca yerinde sıcaklığında karanlıkta inkübe edin. </li></ol> 2. Microcosm kurulması ve inkübasyon <ol><li> Her altı 1-L cam şişe, microcosms kurmak için adım 1.4 damacana 800 ml su numunesi ile doldurun. Her mikrokozmosu BrdU (10 mcM, nihai konsantrasyonu) ekleyin. İyice karıştırın. </li><li> Microcosms üç gruba 1 ml modeli DOC bileşik çözüm, bu DOC değişiklikler olarak görev yapacak. Kalan üç microcosms içine 1 ml steril PBS, bu ek kontrol olarak hizmet verecek. </li><li> Bir kuluçka çalkalayıcı microcosms inkübe ve 100 rpm'de sallayarak sırasında in situ sıcaklığında karanlıkta inkübe edin . </li><li> Her mikrokozmosu ve transfer süresi 0 puan, 8, 16, ve 24 saat için 50 ml steril Eppendorf tüpleri içine 36 ml su numunesi toplayın. Hemen taze PFA toplama tüpleri 4 ml (% 10) ve hücreleri korumak için 2 saat oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 0.22-mikron gözenek boyut polikarbonat membran filtreler aracılığıyla Filtre hücreleri korunmuş. Filtreleri 10 ml PBS ile yıkayın. Hemen bir sonraki adıma geçin veya -20 ° C'de filtreleri saklamak </li></ol> 3 BrdU Ortaklığı yerinde İmmuno <ol><li> Oda sıcaklığında filtreler (DOC değiştirilmiştir numuneleri, herhangi bir ek kontrol ve negatif kontrol) Çözülme. </li><li> 1 ml lizozim çözümü uygulayın [10 mg / ml lizozim yumurta beyazı 100 mM Tris, 50 nM EDTA (pH = 8)] filtre bakteri hücreleri kapsayacak şekilde 4. 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Emme altında 10 ml PBS üzerinden geçerek filtre yıkayın. </li><li> 1 ml proteinaz K çözüm [2 mg / ml proteinaz K 100 mM Tris, 50 nM EDTA (pH = 8)] filtre bakteri hücreleri kapsayacak şekilde 4. 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Emme altında 10 ml PBS üzerinden geçerek filtre yıkayın. </li><li> 1 ml eksonükleaz çözüm [eksonükleaz III (50 U / ml) 5 mM MgCl 2 ve 50 mM Tris-HCl] 5 filtre bakteri hücreleri kapsayacak şekilde ekleyin. 37 ° C'de 30 dakika. Emme altında 10 ml PBS üzerinden geçerek filtre yıkayın. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre çerçeve mühür inkübasyon odaları (Bio-Rad) birleştirin. </li><li> Alkol-kuru temizleme yüzey steril bir bıçak kullanarak sekizde içine filtre dilimleyin. </li><li> Forseps kullanarak, bir monte çerçeve mühür inkübasyon odası (sekiz çerçeve mühür odaları, her filtre örnek için gerekli olan) bir filtre sekizinci bölümüne yerleştirin. Hücreleri içeren filtre bölümü tarafında yukarıya doğru bakmalıdır. Filtrenin arka kısmında nem filtresi sopa slayt sağlayacaktır. Filtre kuru olursa, slayttaki filtre bölümüne yerleştirmeden önce, odanın merkezinde dih 2 O küçük bir damla (2 ul) geçerlidir . </li></ol> Adımlar 3,8-3,20 üreticinin talimatlarına modifiye prosedürler izlenerek, Situ Hücre Çoğalması Kit ROCHE reaktifler FLUOS kullanabilirsiniz. PBS için hariç, tüm reaktifler kit içinde sağlanır. <ol start="8"><li> Mühür uygulandıktan sonra taşma neden olmaksızın eşit kuluçka odasının tüm filtre bölümünde karşılamak için yeterli inkübasyon tampon (% 0.5 sığır serum albümin, PBS içinde% 0.1 Tween20,) uygulayın. </li><li> Kuluçka odasının çerçeve üzerinde polyester çerçeve kapak yerleştirin. Kuluçka odasının mühür için sıkıca bastırın. Filtre üzerindeki hava kabarcıkları kaçının. Kapalı odaları karanlıkta, oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. </li><li> Polyester mühür çıkarın ve inkübasyon odaları açmak. (Not: odaları açılması bazen slayt çerçeve mühür yukarı çekin Bu durumda, aşağıdaki adımları için yeni bir oda hazırlamak.) </li><li> Odanın bir köşesinde, kuluçka tampon dışarı pipetleyin. Filtresi ile temasından kaçının. </li><li> Hafifçe 100 ul PBS pipetleme filtreyi yıkayın ve3 kez odasından dışarı. </li><li> Kullanımdan hemen önce, üretici tarafından önerilen adımları izleyerek anti-BrdU-FLUOS çalışma çözeltisi hazırlayın. </li><li> Pipetleyin 120 ul anti-BrdU-FLUOS, filtre üzerine çözüm eşit olarak tüm yüzeyini kaplayan özen gösterin. </li><li> Odasına yeni bir polyester kapağını kapatın. Filtrenin üstünde hava kabarcıkları kaçının. 37 karanlık oda ° C'de 3 saat. Bu adım, floresein izotiyosiyanat (FITC) ile in situ BrdU dahil DNA etiket. </li><li> Polyester kapağını çıkarın ve kuluçka odasının açık. Anti-BrdU-FLUOS çözüm pipetleyin. PBS ile filtre 3 kere yıkayın. </li><li> Kuluçka odasının steril bir yüzey için filtre aktarın. Steril bir bıçak kullanarak filtre bölümüne küçük parçalar halinde dilimleyin. </li><li> 2 ml mikrosantrifüj tüpler, 1 ml PBS içeren her filtre parçaları aktarın. Sıkıca parafilm ve mühür ile tüp kap. 37 ° ° C'de ve 10 dakika için 200 rpm. </li><li> 5 dakika maksimum hızda vortexer ve girdap üzerine tüpleri sabitleyin. 15 ml steril Eppendorf tüp içine pipetleyin süpernatantı. 5 kez daha inkübasyon ve vorteks adımları tekrarlayın. Her numune için aynı 15 ml Eppendorf tüp süpernatant birleştirin. Tipik olarak,% 80 hücre süspansiyonu telafi edilebilir. </li><li> Süpernatant Mağaza yeniden süspanse hücreleri ile 4 ° C 2 gün içinde sıralayın. </li></ol> 4. FACS analizi BD FACSAria akış sitometresinin ve ilgili yazılım için bir prosedür burada tanımlanmıştır. <ol><li> Üretici tarafından önerilen akış sitometresi aşağıdaki adımları ayarı optimize edin. Bu ısrar ediyor: gerekli kopmasına parametreleri ve tatlı nokta ayarlamak için amplifikasyon kontrolü ayarlayarak; deneme kılıf basınç için lazer gecikme ve alan ölçekleme faktörleri optimize edilmesi ve FSC ve SSC gerilimler, FSC eşik, FSC floresan ölçekleme, floresan kompansasyonunu ayarlarını optimize , vb. </li><li> FITC ve yan dağılım (SSC) floresan yoğunluğuna göre akış sitometresi (FCM) negatif kontrol örnekleri çalıştırın. FITC eşik negatif kontroller hiçbir hücre FITC SSC satın ekran görüntülenebilmekte kadar artırın. </li><li> Herhangi bir ek kontrol numunelerinin çalışılabilmesi ve FITC ve SSC satın alma dayalı 10.000 hücrelerinin dağılımı desen inceleyin. Tüm hücrelerin içine ve "düşük yoğunluklu hücreleri" (Lis) olarak belirlemek için bir kapı tanımlayın. </li><li> DOC-tadil örnekleri çalıştırın ve FITC ve SSC dayalı 10.000 hücrelerinin dağılım paterni incelemek. Bazı hücreler, önceden belirlenmiş LI kapısında belirir. Lis daha yüksek floresan (HIS) hücrelerin içine başka bir kapı tanımlayın. Kapılı hücrelerin göreceli bolluk görüntülemek istatistiklerini edinin. </li><li> "Arındırır 1 damla" modunda 500 ul PBS içeren toplama tüpleri içine sırala HI hücreleri. Onun sayısı 500.000 sayar ulaştığında sıralama sonlandırın. </li></ol> 5. Filtre PCR 16S rRNA genleri Filtre PCR işlemleri Kirchman ark değiştirilmiş 6 <ol><li> Filtre beyaz üzerine sıralanmış hücreleri, 0.22 mikron gözenek boyutu, 25 mm çap, polikarbonat membran filtreden. Steril bir bıçak kullanarak herhangi bir bakteri hücreleri içeren filtre kenarından kesin. Filtre 8 eşit büyüklükte parçalar halinde dilimleyin. </li><li> Hücreleri tüp içe bakan, bir PCR reaksiyonu tüp içine tek bir filtre parçası yerleştirin. PCR reaksiyonu tüpe 45 ul PCR sınıf su ekleyin. Tamamen su filtre Submerge. </li><li> 2 ROCHE versiyonu gösterime PuReTaq okuyun-To-Go, PCR reaksiyonu tüpe PCR Boncuk kısaca vorteks ekleyin. PCR reaksiyon tüpleri her birine 2 ul 27F ve 1492R 7 olarak ileri ve geri 16S rRNA gen primerleri (0.4 mcM her astar için son konsantrasyon), her ekleyin. </li><li> (Isteğe bağlı) adsorbe amplifikasyon inhibitörlerinin yardımcı olmak için PCR reaksiyon karışımının 1μl sığır serum albumin solüsyonu (BSA, nihai konsantrasyonu 30μg/100 ul) ekleyin. BSA eklemek seçerse, bunun yerine su 1μl eklemek. </li><li> Termal cycler PCR gerçekleştirin. PCR programı aşağı bir dokunuş tavsiye edilir, hangi sırayla 62 ve 52 azalan tavlama sıcaklığına sahiptir ° C 1 ° C 11 52 tavlama sıcaklığı 15 döngüleri takip döngüleri, ° C için çevrim başına Tüm döngüleri, denatüre (95 ° C), (62 52 ° C) tavlama ve uzatma (72 ° C'de) 50'li süresi adımlarla içerir. Bir ilk 3 dakika denatürasyon ve son 10 dakikalık uzatma adım PCR programı da dahil. </li><li> Etidyum bromür lekeli% 1 agaroz jel elektroforezi ile PCR onaylayın. Vergi PCR jel amplikonlarının ve QIAGEN QIAquick jel ekstraksiyon kiti temiz. </li><li> Her numune için iki ek PCR gerçekleştirin, her zaman yeni bir filtre bölümünü kullanabilirsiniz. PCR jel purificati sonraüzerinde, birlikte aynı örnek amplikonlarının havuzu. Saf 16S rDNA amplikonlarının klon kütüphane yapım ve sıralama olarak taksonomik tanımlama, izin veren bir dizi moleküler analizler için hazır. </li></ol> 6. Temsilcisi sonuçları: Temsilcisi sonuçlar bir örnek olarak putrescine aşağılayıcı bakteri bir çalışma ile açıklanmıştır. Gürcistan sahil kesiminde yer alan su örnekleri alınan ve yukarıda açıklanan prosedürleri takip işlendi. FACS analizi putrescine Ayrıca yüksek BrdU birleşme oranı (Şekil 1) gösteren, yüksek FITC floresan bir grup bakteri gelişimi neden olduğu saptandı. Bu hücreler yüksek BrdU dahil hücreleri (HIS) olarak belirlenmiş ve çoğunlukla putrescine-aşağılayıcı bakteri içermesi bekleniyor. Onun sadece düşük düzeyde BrdU dahil (LIS) ile hücreler içeren herhangi ek kontroller, eksikti. Lis esas eklendi putrescine kullanmak için koyamadık bacterioplankton içeren bekleniyor. Onun ayrı tüpler içine sıralanır ve sonra membran filtreleri üzerine toplandı. 16S rRNA gen amplikonlarının filtre PCR kullanarak yüksek HI hücreler için elde edilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/2855/2855fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. ek kontrolü ve inkübasyon 24 saat sonra toplanan, (Burada bir örnek olarak putrescine) model bileşik-tadil örnek Akış sitometrik analizi . Hücre dağılımı analizi (1) olumlu BrdU dahil düzeyi ile ilgili FITC etiketleme (x-ekseni), floresan dayalı, ve (2) yan dağılım (SSC, y-ekseni), olumlu bir hücre ile ilgili olduğu boyutu. Kapısı gösterimde BrdU dahil, (LI, düşük BrdU-birleşme HI yüksek BrdU dahil) düzeyi dayanmaktadır. HI ve LI hücrelerin göreli yüzdesi ilgili kapıları gösterilmiştir.

<ol><li>Pernthaler, A., Pernthaler, J., Schattenhofer, M., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+DNA-synthesizing+bacterial+cells+in+coastal+North+Sea+plankton%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of DNA-synthesizing bacterial cells in coastal North Sea plankton.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 5728-5728 (2002).</li>
<li>Urbach, E., Vergin, K. L., Giovannoni, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemical+detection+and+isolation+of+DNA+from+metabolically+active+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Immunochemical detection and isolation of DNA from metabolically active bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 65, 1207-12 (1999).</li>
<li>Mou, X. Z., Hodson, R. E., Moran, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterioplankton+assemblages+transforming+dissolved+organic+compounds+in+coastal+seawater%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterioplankton assemblages transforming dissolved organic compounds in coastal seawater.</a> Environ. Microbiol. 9, 2025-2025 (2007).</li>
<li>Hodson, R. E., Dustman, W. A., Garg, R. P., Moran, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+PCR+for+visualization+of+microscale+distribution+of+specific+genes+and+gene+products+in+prokaryotic+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">In situ PCR for visualization of microscale distribution of specific genes and gene products in prokaryotic communities.</a> Appl. Environ. Microbiol. 61, 4074-4074 (1995).</li>
<li>Dinjens, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bromodeoxyuridine+%28BrdU%29+immunocytochemistry+by+exonuclease+III+%28Exo+III%29+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Bromodeoxyuridine (BrdU) immunocytochemistry by exonuclease III (Exo III) digestion.</a> Histochemistry. 98, 199-199 (1992).</li>
<li>Kirchman, D. L., Yu, L. Y., Fuchs, B. M., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+bacterial+communities+in+aquatic+systems+as+revealed+by+filter+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat.+Microb.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Structure of bacterial communities in aquatic systems as revealed by filter PCR.</a> Aquat. Microb. Ecol. 26, 13-13 (2001).</li>
<li>Delong, E. F., Wickham, G. S., Pace, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+stains%3A+ribosomal+RNA-based+probes+for+the+identification+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic stains: ribosomal RNA-based probes for the identification of single cells.</a> Science. 243, 1360-1360 (1989).</li>
<li>Artursson, V., Jansson, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bromodeoxyuridine+immunocapture+to+identify+active+bacteria+associated+with+arbuscular+mycorrhizal+hyphae%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of bromodeoxyuridine immunocapture to identify active bacteria associated with arbuscular mycorrhizal hyphae.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 6208-6208 (2003).</li>
<li>Mou, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+carbon+processing+by+generalist+species+in+the+coastal+ocean%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bacterial carbon processing by generalist species in the coastal ocean.</a> Nature. 451, 708-708 (2008).</li>
<li>Mou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-cytometric+cell+sorting+and+subsequent+molecular+analyses+for+culture-independent+identification+of+bacterioplankton+involved+in+dimethylsulfoniopropionate+transformations%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Flow-cytometric cell sorting and subsequent molecular analyses for culture-independent identification of bacterioplankton involved in dimethylsulfoniopropionate transformations.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 1405-1405 (2005).</li>
<li>Dean, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+human+genome+amplification+using+multiple+displacement+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5261-5261 (2002).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bizim yaklaşımımız çiftler BrdU bir FACS ve 16S rDNA analiz sucul ortamlarda bireysel DOC bileşenleri metabolize bacterioplankton tür düzeyinde kimlik izin vermek. BrdU dahil tahlil bakteri hücrelerinin metabolik faaliyetleri, sadece aktif bakteri analizi sağlar ve böylece uyuyan hücreleri içermez dayalı etiketler. Bizim yaklaşımımız, BrdU dahil, sonradan görselleştirildiği BrdU esas farklı düzeylerde immunodetected yerinde ve bakteri FACS kullanarak gruplandırılmış ve sıralanmış. BrdU dahil hücrelerin analizi,...

<table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Tip </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> BrdU </td><td> Reaktif </td><td> Sigma </td><td> B5002-5G </td><td></td></tr><tr><td> Lizozim </td><td> Reaktif </td><td> Sigma </td><td> L6876-5G </td><td></td></tr><tr><td> Proteinaz K </td><td> Reaktif </td><td> Sigma </td><td> P2308-25mg </td><td></td></tr><tr><td> Situ Hücre Çoğalması Takımı, FLUOS </td><td> Seti </td><td> Roche </td><td> 11810740001 </td><td> Anti-BrdU-FLUOS ve üretici tarafından önerilen daha reaksiyon başına Kuluçka tampon daha fazla tüketin. </td></tr><tr><td> Çerçeve-Seal Kuluçka Odaları </td><td> Malzeme </td><td> Bio-Rad </td><td> SLF-1201 </td><td></td></tr><tr><td> Polikarbonat Membran Filtreler (142 mm çap, 1,0 mikron gözenek boyutu) </td><td> Malzeme </td><td> Millipore </td><td> FALP14250 </td><td></td></tr><tr><td> Polikarbonat Membran Filtreler (25 mm çap, 0,2 mikron gözenek boyutu) </td><td> Malzeme </td><td> Millipore </td><td> FGLP02500 </td><td></td></tr><tr><td> versiyonu gösterime PuReTaq Ready-To-Go PCR boncuklar </td><td> Seti </td><td> GE Healthcare </td><td> 27-9559-01 </td><td></td></tr><tr><td> QIAquick jel ekstraksiyon kiti </td><td> Seti </td><td> QIAGEN </td><td> 28704 </td><td></td></tr><tr><td> FailSafe PCR Sistemi </td><td> Seti </td><td> Epicentre </td><td> FS99060 </td><td></td></tr></tbody></table>

bromodeoxyuridine (brdu) etiketleme ve Çözünmüş organik kültür bağımsız kimlik sonraki floresan aktive hücre sıralama karbon-aşağılayıcı bacterioplankton

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Mikroplar sucul ortamlarda pek çok çözünmüş organik karbon (DOC) yüzeylerde bozulması aracılık önemli ajanlardır. Ancak, doğada DOC özel havuzları dönüştürmek bakteri taksonların belirlenmesi teknik bir sorun teşkil etmektedir. Burada bir yaklaşım tarif çiftler bromodeoxyuridine (BrdU) dahil, floresan aktif hücre sıralama (FACS) ve 16S rRNA gen tabanlı sucul ortamlarda aşağılayıcı belirli bir DOC bileşik yetenekli bacterioplankton kültür-bağımsız bir kimlik sağlar moleküler analizler. Üç kat bacterioplankton microcosms BrdU ve bir model DOC bileşik (DOC değişiklikler), ya da sadece BrdU (no ek kontrol) almak için ayarlanır. Yeni sentezlenmiş bakteriyel DNA ve BrdU-işaretli DNA timidin BrdU yerine pozisyonları kolayca immunodetected 1,2 olabilir. Katma DOC bileşik seçici aktive olması beklenen ve bu nedenle hiçbir BrdU esas DOC değişiklikler ve hücre dışı duyarlı hücreler daha yüksek seviyelerde (HI hücreleri) vardır kullanabilmek 24 saat inkübasyon, bacterioplankton sayesinde Ayrıca kontroller (düşük BrdU dahil hücreleri LI hücreleri). Floresan İmmuno sonra, HI hücreleri ayırt edilirler ve fiziksel floresan aktive hücre sıralama (FACS) 3 LI hücreleri ayrılır. Sıralama DOC-duyarlı hücreleri (HI hücreleri) DNA ayıklanır ve taksonomik rRNA gen-temelli analiz PCR, klon kütüphane yapım ve sıralama da dahil olmak üzere sonraki 16S ile tanımlanır.

Çevre bacterioplankton bir model ile çözünmüş organik karbon (DOC) bileşik ve bir DNA etiketleme reaktif bromodeoxyuridine (BrdU) inkübe edilir. Daha sonra floresan aktif hücre sıralama (FACS) kullanarak kendi yükseltilmiş BrdU dahil dayalı toplu topluluk, DOC-aşağılayıcı hücreleri ayrılır. Bu hücreler daha sonra sonraki moleküler analizleri ile tespit edilir.

Bromodeoxyuridine (BrdU) Etiketleme ve Çözünmüş Organik Kültür bağımsız Kimlik sonraki Floresan Aktive Hücre Sıralama Karbon-aşağılayıcı Bacterioplankton

Mikroplar, sucul ortamlardaki çok sayıda çözünmüş organik karbon (ÇOK) substratının bozunmasını yöneten temel ajanlardır. Ancak, tanımlama...

Mikroplar, Racine ve sucul ortamlar gibi birçok çözünmüş organik karbon substratının veya DOC bileşiğinin bozunmasını gerçekleştirir. Mikropların DOC dönüşümündeki rolünü tam olarak anlamak için, taksonomilerinin ve fonksiyonlarının eş zamanlı olarak tanımlanması gereklidir. Bu video, sucul ortamlarda belirli DOC havuzlarını dönüştüren serbest yaşayan bakterilerin veya bakteriyel planktonların taksonomik tanımlamasına yönelik bir prosedürü göstermektedir.Bir test ortamından toplanan su örnekleri işlenir ve ilgilenilen bir bileşik ile yeni sentezlenen DNA'ya ve aktif olarak büyüyen hücrelere dahil olan bromo deoksiüridin, BRDU ile inkübe edilir. Ardından, BRDU işaretli bakteri planktonları, ZI konjuge anti-BRDU antikorları ile işaretlenir. Yüksek düzeyde BRDU işaretlemesine sahip bakteri planktonları, floresanla aktive edilen hücre ayıklama yöntemiyle izole edilir.Ardından, ayrıştırılan hücrelerden DNA ekstre edilir ve PCR tabanlı 16 s ribozomal RNA gen analizi sonuçlarına dayanarak taksonomik tanımlama gerçekleştirilir. Merhaba, ben Kent State Üniversitesi Biyolojik Bilimler Bölümü'ndeki Dr. Chen Mao'nun laboratuvarından Steven Robbins. Bugün size sucul ortamlardaki DOC degrade eden bakteriyel planktonların tanımlanması için kültürden bağımsız bir yöntem göstereceğiz.Bu tekniğin, besin takviyeleri ve ardından bakteriyel topluluk DNA'sı analizi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, analizi yüksek derecede aktif bakterilere odaklaması ve uyku halindeki veya yavaş büyüyen hücreleri hariç tutmasıdır. Burada, belirli bir DOC bileşiğini kullanan bakteri planktonlarının tanımlanmasını gösteriyoruz. Ancak bu yöntem, diğer tekil DOC bileşiklerini veya alg eksudaları gibi DOC gruplarını kullanan bakteri planktonlarını incelemek için de uygulanabilir.Öyleyse bazı su örnekleri alalım ve başlayalım. DOC degrade eden bakteriyel planktonlar için su örneklerini analiz etmeden önce, su örnekleri uygun şekilde işlenmelidir. Burada gösterilen örnekler, sudaki büyük partikülleri ve ER VRE'leri uzaklaştırmak amacıyla Georgia kıyılarından toplanmıştır.Toplama karboyundaki suyu, bir mikrometre gözenek boyutuna sahip bir filtre içeren filtrasyon ünitesine aktarmak için peristaltik bir pompa kullanın. Ardından, filtrattan 36 mililitrelik alikotları, her biri taze hazırlanmış %10 Paraform aldehit çözeltisinin dört mililitresini içeren üç adet steril 50 mililitrelik polipropilen tüpe aktarın. İnkübasyon sonrası hücreleri korumak için oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin.Suyu, 0,22 mikrometre gözenek boyutuna sahip beyaz membran filtreli bir cam vakum filtrasyon ünitesinin filtrasyon kulesine dökün ve çözeltiyi çekmek için vakumu uygulayın. Vakum filtresinden 10 mililitre PBS geçirerek filtreyi yıkayın. Filtreleri negatif kontrol olarak etiketleyin ve minus 20 degrees Celsius sıcaklıkta saklayın.Deneysel bir ekosistem veya mikrokozmos oluşturmak için, önceden durulanmış altı adet bir litrelik cam erleni 800 mililitre önceden filtrelenmiş su örneği ile doldurarak başlayın. Her bir mikrokozmosa, final konsantrasyonu 10 micromolar olacak şekilde BRDU ekleyin. Karıştırmak için erleni elinizle hızla döndürün.Her bir örnek üç paralel şeklinde analiz edilecektir. Bu nedenle, mikrokozmoslardan üçüne model DOC bileşiği ekleyin. Burada, mikrokozmoslara 100 nanomolar final konsantrasyonda reine eklenmektedir.Ardından diğer üç mikrokozmosa steril PBS ekleyin. Bunlar DOC içermeyen kontroller olarak hizmet edecektir; tüm mikrokozmosları, in situ sıcaklığı olan 25 °C'de, karanlıkta, 100 RPM hızında çalışan bir çalkalamalı inkübatöre yerleştirin. Burada 0, 8, 16 ve 24. saatlerdeki zaman noktalarında ölçümler yapın.Her bir mikrokozmostan 36 mililitre örneği, dört mililitre taze %10 paraformaldehit içeren 50 mililitrelik steril polipropilen tüplere toplayın ve hücreleri sabitlemek için oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin. Ardından, korunan hücreleri 0.22 mikrometre gözenek boyutuna sahip beyaz membran filtrelerden süzün. PFA kalıntılarını temizlemek için vakumlu filtre üzerinden 10 mililitre PBS uygulayın.Hemen INS situ immün saptamaya geçin veya bakteriyel planktonlardaki BRDU inkorporasyonunu analiz etmek için filtreleri -20 °C'de saklayın. Bakteriyel hücre duvarını bozmak için örnek filtrelerini oda sıcaklığında muamele ederek başlayın. Filtreyi bir filtrasyon ünitesine yerleştirin, ardından hücrelerin üzerini kapatacak şekilde filtre üzerine 1 mL lizozim çözeltisi pipetleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.İnkübasyonun ardından, çözeltiyi uzaklaştırmak için vakum uygulayın. Çözelti filtreden geçtikten sonra, 10 mililitre PBS ekleyerek hücreleri yıkayın ve vakum uygulayın. Daha sonra, hücre duvarını daha fazla zayıflatmak için filtre üzerindeki hücreleri kaplayacak şekilde bir mililitre proteinaz K çözeltisi ekleyin.Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Tek katmanlı DNA elde etmek için PBS ile yıkayın. Filtre üzerindeki hücreleri kaplayacak şekilde bir mililitre ekzonükleaz çözeltisi ekleyin.37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, vakum filtresinden 10 mL PBS geçirerek filtreyi yıkayın. Ardından, hücre içermeyen kısımları temizlemek için filtrenin kenarlarını kesin.Ardından alkolle temizlenmiş kuru bir yüzey üzerinde, steril bir bıçak kullanarak filtreyi sekiz eşit parçaya bölün. Her örnek için sekiz adet çerçeve sızdırmaz inkübasyon odası gereklidir; filtrenin sekizde birini, örnek tarafı yukarı gelecek şekilde monte edilmiş çerçeve sızdırmaz inkübasyon odasına yerleştirin. Odalar monte edildikten sonra, in situ A-B-R-D-U etiketli hücreleri saptamak için Roche Intu hücre proliferasyon kiti florları kullanın.Bekleme prosedürleri tamamlandığında, filtre bölümünü inkübasyon odasından çıkarın ve steril bir yüzeye yerleştirin; steril bir bıçak kullanarak filtre bölümünü küçük parçalara ayırın. Filtre parçalarını, içinde 1 mL PBS bulunan iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın, tüpü sıkıca kapatın ve parafilm ile mühürleyin. Ardından tüpü, sarsıntılı bir inkübatörde 37 °C'de ve 200 RPM'de 10 dakika boyunca inkübe edin.İnkübasyonun ardından tüpü sabitleyin ve maksimum hızda vorteksleyin. Beş dakika boyunca, SUP süpernatanını steril 15 mililitrelik bir polipropilen tüpe pipetleyin. Daha sonra filtreyi PBS içinde yeniden süspanse edin ve her örnek için süpernatantı aynı 15 mililitrelik tüpe ekleyerek vorteksleme ve inkübasyon adımlarını iki kez daha tekrarlayın.Yeniden süspanse edilen hücreleri dört derece Celsius'ta saklayın. Örnek, iki gün içinde analiz edilmelidir. Son olarak, yüksek düzeyde BRDU inklüzyonuna sahip popülasyonu elde etmek için hücreleri ayırın.Burada, bir BD FACS Aria akış sitometresi ve ilgili yazılım kullanılmaktadır. Hücreler ayrıştırıldıktan sonra, BRDU ile zenginleştirilmiş popülasyonun taksonomik kimliğini belirlemek için analiz yapılabilir. Ayrıştırılan bakterilerin 16S ribozomal RNA genlerini çoğaltmak amacıyla filtre PCR'lar gerçekleştirmek için, ayrıştırılmış hücreleri beyaz 0.22 gözenek boyutuna sahip bir polikarbonat membran filtreye pipetleyin ve vakum pompasını çalıştırın; ardından steril bir bıçak kullanarak filtrenin hücre içermeyen kenarlarını kesin.Filtreyi her bir koşul için dört eşit parçaya bölün, hücrelerin tüpün içine bakacak şekilde tek bir filtre parçasını üç PCR reaksiyon tüpünün her birine yerleştirin. 45 µL PCR sınıfı su ekleyin. Filtre kesitinin suyun içinde tamamen batmasını sağlayın.Ardından, iki adet Roche illustra pure T ready to go PCR boncuğu ekleyin ve boncukların çözünmesine yardımcı olmak için kısa süreliğine vorteksleyin. Daha sonra, ikişer mikrolitre ileri ve geri 16 s ribozomal RNA geni primeri ekleyin.Amplifikasyon inhibitörlerinin absorbe edilmesine yardımcı olmak için bir mikrolitre BSA veya bir mikrolitre su ekleyin. PCR amplifikasyonunu bir termal döngüleyici cihazda gerçekleştirin. Bağlanma sıcaklığının her döngüde 62'den 52 derece Celsius'a birer derece Celsius azaldığı ve ardından 52 derece Celsius'ta 15 döngü ile devam ettiği bir touchdown PCR programı önerilir.PCR amplifikasyonunu, bromür boyalı %1 Agros jelleri üzerinde elektroforez ile doğrulayın; PCR amplikonlarını jelden kesin ve bir KaiGen cayo quick gel extraction kiti ile temizleyin. PCR jel saflaştırmasından sonra, aynı örneğe ait amplikonları bir araya getirin. Saflaştırılmış 16 s ribozomal DNA amplikonları artık bir dizi moleküler analiz için hazırdır.Örnekler, Georgia'nın kıyı şeridinden toplanmış ve bu videoda açıklanan prosedürler izlenerek Racine degrade eden bakterileri incelemek üzere işlenmiştir. Racine, deniz ortamlarında yaygın olarak bulunabilen poliamor bir bileşiktir. Burada gösterildiği gibi, deniz bakterileri için bir besin ve enerji kaynağı görevi görebilir.Numunelerin gerçek analizleri, 24 saatlik inkübasyonun ardından Racine katkılı mikrokozmlarda, BRDU inklüzyon derecesiyle pozitif ilişkili olan daha yüksek FXI floresan yoğunluğuna sahip bir bakteri grubunun geliştiğini ortaya koymuştur. Bu hücreler, yüksek BRDU inklüzyonlu hücreler veya HI olarak adlandırılmış olup, çoğunlukla Racine degrade eden bakteriler içermelerinin beklendiği saptanmıştır. HI tespit edilmemiştir.Herhangi bir ekleme yapılmayan kontrol gruplarında, BRDU inklüzyon seviyeleri daha düşük olan ve lii hücreleri olarak adlandırılan hücreler tespit edilmiştir; bu hücrelerin temel olarak kullanımı mümkün olmayan bakteriyel planktonlar içermesi beklenmekteydi. Eklenen Racine HI hücreleri ayrı tüplere ayrılmış ve ardından membran filtrelere toplanmıştır. Filtre PCR işlemi sonrası kısmi 16 ribosomal RNA geni amplikonları elde edilmiş ve jel elektroforezi ile doğrulanmıştır.Ayıklama filtresinin ardından, ayıklanan hücreler arasındaki fonksiyonel çeşitliliği incelemek için fonksiyonel genlerin PCR amplifikasyonu da gerçekleştirilebilir. Floresan aktivasyonlu hücre ayıklama ve BrDU inkorporasyonunu birleştiren bir yaklaşım kullanarak, su ortamındaki fonksiyonel bakteri hücrelerinin fiziksel olarak nasıl ayrıştırılacağını ve tanımlanacağını size göstermiş olduk. BrDU'nun sağlık açısından riskli olduğunu unutmayın; bu prosedür uygulanırken her zaman laboratuvar önlüğü ve eldiven giyilmelidir.Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

bromodeoxyuridine-brdu-labeling-subsequent-fluorescence-activated

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Damlacık tabanlı mikroakışkan platformları kHz oranları ucuza pikolitrelik, kendi kendine bölümlere damarları oluşturmak mümkün olduğundan yüksek kapasiteli deney için umut vaat eden adaylardır. Hızlı, hassas ve yüksek çözünürlüklü floresans spektroskopik yöntemleri ile entegrasyon sayesinde, bu sistemler içinde üretilen bilgilerin büyük miktarda verimli, ayıklanır, harnessed ve kullanılan olabilir.

Mikroakışkan damlacık platformları için Floresan algılama yöntemleri

Hücre döngüsü aşamaları ilerleme ve kinetikleri izleme ince değişiklikler Propidium iyodid ile BrdU ve toplam genomik DNA boyama yöntemi ile, nükleik asit metabolik etiketlenmesi bir kombinasyonu kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bu yöntem, dolayısıyla da hücre siklus progresyonu etkileyen non-spesifik DNA hasarına, geliştirilmesinin önlenmesi, bisiklet hücrelerin kimyasal senkronizasyonu ihtiyacını ortadan kaldırır.

Metabolik Etiketleme ve Flow Sitometri ile Hücre Döngüsü İlerleme Kinetik Ölçüm

Kromozom replikasyonu zamanlama analizi için nicel bir yöntem tarif edilmektedir. Yöntem floresan ile kombinasyon halinde BrdU eklenmesi...

Floresan ile birlikte Kromozom çoğaltılıyor Zamanlama<em&gt; Yerinde</em&gt; Hibridizasyon

Video, hücre proliferasyonunu ölçmek için bromodeoksiüridin (BrdU) ile memeli hücrelerinin aşamalı darbe etiketleme testini açıklar. BrdU alımı, hücrelerin senkronize edilmesini gerektirmeden, belirli bir zamanda sentez aşamasında olan hücrelerin zamansal olarak izlenmesine izin verir.

Bromodeoksiüridin Nabız Etiketleme Testi: Hücre Proliferasyonunu Ölçmek İçin Bir Teknik

Bu videoda BrdU immünofloresan boyama protokolü açıklanmaktadır. Teknik, hücre döngüsünün farklı aşamalarındaki hücrelerin tanımlanmasına izin verir. DNA boyalarının ve antikor etiketlemesinin eklenmesi, daha sonraki zamanlarda S fazı hücrelerinin kaderinin ayrıntılı analizine izin verir.

BrdU İmmünofloresan Boyama: Hücre Döngüsünün Farklı Aşamalarındaki Hücreleri Tanımlamak İçin Bir Teknik

Bu protokol, zaman içinde belirli bir noktada S fazında olan hücrelerin zamansal izleme izin vermek için bromodeoksiüridin (BrdU) alımından kullanımını tarif eder. DNA boyalar ve antikor etiketleme eklenmesi daha sonraki zamanlarda S fazı hücrelerinin kaderi detaylı analizini kolaylaştırır.

Senkronizasyon Need for olmadan Akım Sitometri Kullanımı Hücre Döngüsü ilerleme zamansal İzleme

Lazerler sıklıkla DNA hasarına hücre tepkisinin çalışmada kullanılır. Bununla birlikte, normal koşullar altında, aralık, sıklık, ve çarpışmalar çoğaltma çatal nadiren karakterize lezyonlar üretir. Burada, lazer lokalize kol içi çapraz bağlar ile bu parametrelerin belirlenmesini sağlayan bir yaklaşım açıklar.

Lazer Lokalize Psoralen adüktlerinin Tek Molekül Analizi

Burada sunulan yüksek hassasiyet ve taksonomik çözünürlük ile sucul yırtıcı ökaryotlar otlatma oranları ölçmek için tek hücreli, epifloresan mikroskobik tabanlı teknik için bir protokoldür.

Floresan Etiketli Bakteriler Sucul Ekosistemlerde Organik Karbon Akışının Yeni Yollarını Ortaya Çıkaracak Bir İzleyici Olarak

Bu protokol, D 2O metabolizmasının tek hücreli uyarılmış Raman saçılma görüntülemesi ile 2.5 saat içinde hızlı antimikrobiyal duyarlılık testi (AST) testi sunar. Bu yöntem, klinikte hızlı tek hücreli fenotipik AST için dönüştürücü olan idrar veya tam kan ortamındaki bakteriler için geçerlidir.

Tek Bir Bakteride Döteryum Birleşmesinin Uyarılmış Raman Saçılma Görüntülemesi ile Hızlı Antimikrobiyal Duyarlılık Testi

Mevcut protokolde, immünofluoresans bazlı bir yöntem kullanarak hücre döngüsünün S/G2 aşamasında DNA çift iplik ucu rezeksiyonunun nasıl görselleştirilerek görselleştirilmeyi gösteriyoruz.

BrdU-DNA Etiketlemesi Kullanılarak Küresel DNA Çift Telli Uç Rezeksiyonunun Değerlendirilmesi Hücre Döngüsü Ayrımcılığı Görüntüleme ile birleştiğinde

Burada, tek hücrelerde çoklu yaşlanma ile ilişkili belirteçlerin görselleştirilmesi ve nicelleştirilmesi için akış sitometrisine dayalı bir yöntem sunuyoruz.

Tedaviye Bağlı Yaşlanan Kanser Hücrelerinde Çoklu Floresan Yaşlanma Belirteçlerinin Eşzamanlı Görüntüleme ve Akış Sitometrisine Dayalı Tespiti

Öğrenin, BrdU etiketleme ve FACS kullanarak sucul ortamlarda DOC parçalayan bakteriyoplanktonları izole etme yöntemini. Bu teknik, aktif bakterileri tanımlayarak karbon döngüsü araştırmalarını destekler.

Bromodeoxyuridine (BrdU) Etiketleme ve Çözünmüş Organik Kültür bağımsız Kimlik sonraki Floresan Aktive Hücre Sıralama Karbon-aşağılayıcı Bacterioplankton (Video) | JoVE Journal

Bromodeoxyuridine (BrdU) Etiketleme ve Çözünmüş Organik Kültür bağımsız Kimlik sonraki Floresan Aktive Hücre Sıralama Karbon-aşağılayıcı Bacterioplankton

Daha fazla video keşfet