Bromodeoxyuridine (BrdU) Etiketleme ve Çözünmüş Organik Kültür bağımsız Kimlik sonraki Floresan Aktive Hücre Sıralama Karbon-aşağılayıcı Bacterioplankton

Mikroplar, Racine ve su ortamları gibi çok sayıda çözünmüş organik karbon substratının veya DOC bileşiklerinin bozulmasına aracılık eder. Mikropların DOC dönüşümündeki rolünü tam olarak anlamak için, taksonomilerinin ve işlevlerinin aynı anda tanımlanması gereklidir. Bu video, belirli DOC havuzlarını ve su ortamlarını dönüştüren serbest yaşayan bakterilerin veya bakteriyel planktonların taksonomik olarak tanımlanması için bir prosedürü göstermektedir.

Bir test ortamından toplanan su örnekleri, yeni sentezlenen DNA'ya ve aktif olarak büyüyen hücrelere dahil olan bir ilgi ve bromo deoksi üridin (BRDU) bileşiği ile işlenir ve inkübe edilir. Daha sonra, BRDU işaretli bakteri planktonları, ZI konjuge anti BRDU antikorları ile etiketlenir. Yüksek düzeyde BRDU etiketlemesine sahip bakteriyel planktonlar, floresanla aktive edilmiş hücre sınıflandırması ile izole edilir.

Daha sonra sıralanan hücrelerden DNA ekstrakte edilir ve PCR tabanlı 16 s ribozomal RNA gen analizi sonuçlarına dayalı olarak taksonomik tanımlama yapılır. Merhaba, benim adım Steven Robbins, Kent State Üniversitesi Biyolojik Bilimler Bölümü'nde Dr.Chen Mao'nun laboratuvarından. Bugün s lu ve ben size su ortamlarında DOC bozunan bakteriyel planktonların tanımlanması için kültürden bağımsız bir yöntem göstereceğiz.

Bu tekniğin, besin değişiklikleri gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, ardından bakteri topluluğu DNA'sı üzerinde analiz, analizi yüksek derecede aktif bakterilere odaklaması ve uykuda olan ve yavaş büyüyen hücreleri dışlamasıdır. Burada, belirli bir DOC bileşiği kullanan muz bakterilerinin tanımlanmasını gösteriyoruz. Ancak bu yöntem, diğer tek DOC bileşiği veya alg eksüdaları gibi DLC grubunu kullanan bakteri planktonlarını incelemek için de uygulanabilir.

Öyleyse biraz su örneği alalım ve başlayalım. DOC parçalayıcı bakteriyel plankton için tahlil suyu numunelerinden önce, su numuneleri uygun şekilde işlenmelidir. Burada gösterilen numuneler, su numunesinden büyük partikülleri ve ER VRE'leri uzaklaştırmak için Gürcistan kıyılarından toplanmıştır.

Toplama damacanasından suyu bir mikrometre gözenek boyutunda filtreye sahip bir filtreleme ünitesine aktarmak için peristaltik bir pompa kullanın. Daha sonra, filtratın 36 mililitrelik alikotlarını üç steril 50 mililitrelik polipropilen tüpe aktarın. Her biri dört mililitre taze hazırlanmış% 10 Paraform aldehit çözeltisi içerir İnkübasyondan sonra hücreleri korumak için oda sıcaklığında iki saat inkübe edin.

Suyu, 0,22 mikrometre gözenek boyutunda beyaz membran filtreli bir cam vakumlu filtrasyon ünitesinin filtrasyon kulesine dökün ve çözeltiyi çekmek için vakumu uygulayın. Vakum filtresinden 10 mililitre PBS uygulayarak filtreyi yıkayın. Filtreleri negatif kontroller olarak etiketleyin ve eksi 20 santigrat derecede saklayın.

Deneysel bir ekosistem veya mikro kozmos oluşturmak için, altı adet bir litrelik önceden durulanmış cam şişeyi 800 mililitre önceden filtrelenmiş su numunesi ile doldurarak başlayın. Her bir mikrokozmosa BRDU'yu 10 mikromolar nihai konsantrasyona ekleyin. Karıştırmak için şişeyi elle hızla döndürün.

Her numune test edilecek ve üç kez kopyalanacaktır. Bu nedenle, mikro kozmosların üçüne, model DOC bileşiğini ekleyin. Burada reine, mikrokozmoslara 100 nanomolar nihai konsantrasyonda eklenir.

Sonra diğer üç mikrokozmosa steril PBS ekleyin. Bunlar, DOC olmayan kontroller olarak işlev görecek, tüm mikro kozmosları karanlıkta 100 RPM'lik bir çalkalama inkübatörüne 25 santigrat derece olan insitu sıcaklığında yerleştirecektir. Burada 0, 8, 16 ve 24 saatlik zaman noktalarında.

Dört mililitre taze% 10 paraform aldehit içeren 50 mililitrelik steril bir polipropilen tüpte her bir mikrokozmostan 36 mililitre toplayın, hücreleri sabitlemek için oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. Daha sonra korunmuş hücreleri 0.22 mikrometre gözenek boyutunda beyaz membran filtrelerden süzün. PFA kalıntılarını yıkamak için vakum filtresinden 10 mililitre PBS uygulayın.

Hemen INS situ immün tespitine geçin veya BRDU'nun bakteriyel planktona dahil edilmesini test etmek için filtreleri eksi 20 santigrat derecede saklayın. Bakteri hücre duvarını tehlikeye atmak için numune filtrelerini oda sıcaklığında atarak başlayın. Filtreyi bir filtrasyon ünitesine yerleştirin, ardından hücreleri kaplamak için filtrenin üzerine bir mililitre lizozim solüsyonu pipetleyin ve oda sıcaklığını 30 dakika inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, çözeltiyi çıkarmak için bir vakum uygulayın. Çözelti filtreden geçtikten sonra, 10 mililitre PBS ekleyerek hücreleri yıkayın ve bir vakum uygulayın. Daha sonra hücre duvarını daha da tehlikeye atmak için, hücreleri kaplamak için filtreye bir mililitre proteinaz K çözeltisi ekleyin.

Oda sıcaklığını 30 dakika inkübe edin. Tek tabakalı DNA üretmek için PBS ile yıkayın. Filtre üzerindeki hücreleri kaplamak için bir mililitre eksonükleaz çözeltisi ekleyin.

37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından filtreyi vakum filtresinden 10 mililitre PBS geçirerek yıkayınız. Ardından, hücresi olmayan kısmı çıkarmak için filtrenin kenarlarını kesin.

Daha sonra alkolle temizlenmiş kuru bir yüzeyde, filtreyi sekiz eşit büyüklükte parçaya bölmek için steril bir bıçak kullanın. Her numune için sekiz çerçeve contası inkübasyon odası gereklidir: filtrenin sekizde birini monte edilmiş çerçeve contası inkübasyon odası numune tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Odalar bir araya getirildikten sonra, A-B-R-D-U etiketli hücreleri yerinde tespit etmek için Roche Intu hücre çoğalma kiti flus'u kullanın.

Ayakta durma prosedürleri tamamlandıktan sonra, filtre bölümünü inkübasyon odasından çıkarın ve steril bir bıçak kullanarak steril bir yüzeye yerleştirin, filtre bölümünü küçük parçalar halinde dilimleyin. Filtre parçalarını bir mililitre PBS içeren iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın, tüpü sıkıca kapatın ve paraform ile kapatın. Daha sonra tüpü 37 santigrat derece ve 200 RPM'de 10 dakika boyunca çalkalanan bir inkübatörde inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, tüpü sabitleyin ve maksimum hızda girdap yapın. Beş dakika boyunca SUP natantını steril 15 mililitrelik bir polipropilen tüpe pipetleyin. Daha sonra filtreyi PBS'de yeniden süspanse edin ve girdap ve inkübasyon adımlarını her seferinde iki kez daha tekrarlayın ve snat'ı her numune için aynı 15 mililitrelik tüpe ekleyin.

Yeniden askıya alınan hücreleri dört santigrat derecede saklayın. Numune iki gün içinde faks ile analiz edilmelidir. Son olarak, yüksek düzeyde BRDU katılımına sahip popülasyonu elde etmek için hücreleri sıralayın.

Burada, bir BD faks alanı akış sitometresi ve ilgili yazılım kullanılır. Hücreler sıralandıktan sonra, BRDU ile zenginleştirilmiş popülasyon, taksonomik kimliğini belirlemek için test edilebilir. Gerçekleştirilen bakteri filtre PCR'lerinin 16 s ribozomal RNA genlerini amplifiye etmek için, sıralanan hücreleri beyaz 0.22 gözenek boyutunda bir polikarbonat membran filtreye pipetleyin ve steril bir bıçak kullanarak vakum pompasını açın, filtrenin hücresiz kenarlarını kesin.

Filtreyi her koşul için eşit büyüklükte dört parçaya bölün, hücreler tüpün içine bakacak şekilde üç PCR reaksiyon tüpünün her birine tek bir filtre parçası yerleştirin. 45 mikrolitre PCR sınıfı su ekleyin. Filtre bölümünün tamamen suya daldırılmasına izin verin.

Ardından, boncukların çözülmesine yardımcı olmak için kısa bir süre girdap yapmaya hazır iki Roche illustra pure T PCR boncuğu ekleyin. Daha sonra ileri ve geri 16 s ribozomal olmak üzere iki mikrolitre ekleyin. RNA gen primerleri.

Amplifikasyon inhibitörlerini emmeye yardımcı olmak için bir mikrolitre BSA veya bir mikrolitre su ekleyin. Bir termal döngüleyicide PCR amplifikasyonu gerçekleştirin. A diz çökme sıcaklığının döngü başına 62 santigrat dereceden 52 santigrat dereceye sırayla düştüğü ve ardından 52 santigrat derecede 15 döngüye sahip bir touchdown PCR programı önerilir.

Bromür lekeli %1 Agros jellerin C'sinde elektroforez ile PCR amplifikasyonunu onaylayın, PCR amplikonlarını jelden çıkarın ve bir KaiGen cayo hızlı jel ekstraksiyon kiti ile temizleyin. PCR jel saflaştırmasından sonra, aynı numunenin amplikonlarını birlikte çekin. Saflaştırılmış 16 s ribozomal DNA amplikonları artık bir dizi moleküler analiz için hazırdır.

Örnekler, Gürcistan'ın bir kıyı bölgesinden toplandı ve bu videoda açıklanan prosedürleri izleyerek Racine parçalayıcı bakterileri incelemek için işlendi. Racine, deniz ortamlarında her yerde bulunabilen çok eşli bir bileşiktir. Burada gösterildiği gibi deniz bakterileri için bir besin ve enerji kaynağı olarak hizmet edebilir.

Numunelerin olgu analizi, 24 saatlik bir inkübasyondan sonra, Racine modifiye mikrokozmoslarında BRDU dahil etme derecesi ile pozitif ilişkili olan daha yüksek FXI floresan yoğunluğuna sahip bir bakteri grubunun geliştirildiğini ortaya koymuştur. Bu hücreler, yüksek BRDU infüzyon hücreleri veya HI olarak belirlendi ve çoğunlukla Racine parçalayıcı bakteriler içermesi bekleniyordu. Hayır, merhaba.

Hücreler, yalnızca lii hücreleri olarak adlandırılan daha düşük BRDU dahil etme seviyelerine sahip hücreleri içeren ek kontrollerde bulundu, esas olarak kullanılamayan bakteriyel plankton içermesi bekleniyordu. Eklenen Racine HI hücreleri ayrı tüplere ayrıldı ve daha sonra membran filtrelere toplandı. Kısmi 16 ribozomal RNA gen amplikonu, filtre PCR sonrası elde edildi ve jel elektroforezi ile doğrulandı.

Sıralama filtresini takiben, sıralanmış hücreler arasındaki fonksiyonel çeşitliliği incelemek için fonksiyonel genlerin PCR amplifikasyonu da gerçekleştirilebilir. Floresanla aktive edilmiş hücre sınıflandırması ve BRDU katılımını birleştiren bir yaklaşım kullanarak su ortamındaki fonksiyonel bakteri hücrelerini fiziksel olarak nasıl ayıracağınızı ve tanımlayacağınızı gösterdik. Unutmayın, BIDU baş toprağıdır, bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman bir laboratuvar önlüğü ve bir glos giyilmelidir.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.