ReAsH / Flash Etiketleme ve Hücreler Tetracysteine ​​Sensör Proteinlerin Görüntü Analizi

Bu prosedürün genel amacı, bir tetra sistein ve floresan etiketli proteini eksprese eden hücreleri, flaş veya kül boyaları ile etiketlemek ve sonuçları kantitatif olarak analiz etmektir. Bu, ilk olarak, bir floresan proteini taşıyan bir plazmit ve bir tetra sistein etiketi içeren hedef proteinin ilgilenilen hücre hattına transekte edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, eksprese edilen protein R veya flaş ile etiketlenir ve spesifik olarak bağlı olmayan diyet, mikroskobik görüntülemeye hazırlanmak için BAL ile yıkanarak çıkarılır.

Daha sonra, kül veya flaş ve floresan protein kanalları ile hücrelerin floresan görüntülerini toplamak için konfokal bir mikroskop kullanılır. Son olarak, görüntüler, kül veya flaşın hedef proteine bağlanmasını ölçmek için görüntü J kullanılarak analiz edilir. Sonuç olarak, kül floresansının floresan protein floresansı ile korelasyonu yoluyla hücrelerdeki hedef proteine kül veya flaş bağlanmasının derecesini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin, hedef proteini GFP ile basitçe almak gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, proteinin lokalizasyonuna ek olarak konformasyonel değişiklik gibi ikinci bir özelliğini izleyebilmesidir. Bu yöntem, protein altyapısı ve fonksiyon alanında, TAC'nin kül veya parlamayı yasaklama yeteneğini değiştiren izasyon olayları, konformasyonel değişiklikler ve LI bağlanma olayları gibi anahtar soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem için ilk olarak, Huntington'ın hücrelerde ne kadar küçük mikroskobik çok eşli olduğunu değerlendirmek istediğimizde aklımıza geldi.

Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü veri analizi adımının öğrenilmesi zordur çünkü teknik olarak karmaşıktırlar Deneysel prosedürlerin gösterilmesi. Birinci ila üçüncü adımlar, laboratuvarımızdan bir araştırma görevlisi olan Yasmin Ranson'ın veri analizini göstermesi olacaktır. Dördüncü adım, laboratuvarımızdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Sevki GaN olacak İlgilendiğiniz hücre hattı için standart hücre kültürü yöntemlerini kullanma ve transfeksiyon için hazır bir canlı hücre görüntüleme slaydı.

İlgilenilen TC etiket genini içeren plazmitinizi transfekte eden bir yapışma hücreleri kültürü hazırlayın. Tercih edilen bir transfeksiyon yöntemine göre, TC etiketlerine spesifik bağlanmanın derecesini değerlendirmek ve ayrıca konfokal mikrografları toplarken kanallar arasındaki akıcılığın ağartıcı akışını değerlendirmek için pozitif ve negatif kontrollere sahip olmak önemlidir. Bu nedenle, iki renk için, numunelerin tek renkler için hazırlandığından emin olun, ya floresan proteini kendi başına ve mümkünse, ete bağlı bir T ctech proteini ya da vs.Ama

bir floresan proteini olmadan. Transfeksiyondan bir ila iki gün sonra, hücreleri 300 mikrolitre savaş öncesi Hank'in denge tuzu çözeltisi veya HBSS ile nazikçe durulayın, 10 mikromolar, bir, iki et Ethan dia tiyol veya EDT ve bir mikromolar flaş veya kül ile taze ön ısıtma HBSS hazırlayın. Ve HBSS'yi hücrelerden çıkardıktan sonra, bir doku kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede tam olarak 30 dakika boyunca 300 mikrolitre kül ortamı inkübe edin.

Deneyimlerimize göre, daha uzun inkübasyon süreleri arka plan floresansını önemli ölçüde artırır. Etiketleme solüsyonunu hücrelerden nazikçe aspire edin ve 37 santigrat derecede 15 dakika boyunca 250 mikromolar, iki üç dimer, kapaklı propanol veya BAL içeren 300 mikrolitre ön ısıtma HBSS ile değiştirin. Yıkama solüsyonunu nazikçe aspire ederek çıkarın ve 300 mikrolitre ön ısıtma HBSS ile değiştirin.

Bu yıkamadan sonra, hücreler paraform yüksekliği ile sabitlenebilir, ancak bunun spesifik olmayan sinik floresansı arttırdığını bulduk. Bu nedenle, hücreleri genellikle oda sıcaklığında canlı olarak görüntüleriz. Ek olarak, etiketlemeden önce hücrelerin sabitlenmesi, bial boya bağlanmasını önler.

Konfokal mikroskopta hücreleri görüntülemeye başlamak için, tek tek floroforları görüntülemek için parametreleri ayarlayın ve kanallar arasında ihmal edilebilir bir kanama olduğundan emin olun. Ardından, fotoğraf çarpanı ayarlarını, numunedeki maksimum floresan dedektörü doyurmayacak şekilde ayarlayın. En iyi görüntüleme ayarları belirlendikten sonra, numuneler arasında hiçbirini değiştirmeyin.

200 hertz'lik bir tarama hızı kullanın, dört satır ortalaması toplayın ve iğne deliği çapını bir alan birimine ayarlayın. Sinyal-gürültü sorunu varsa iğne deliği çapı genişletilebilir. Ancak bu, görüntüleme çözünürlüğünde bir miktar kayba neden olabilir.

Mümkünse konfokal görüntüleri 12 bit veya daha yüksek bir formatta toplayın. Nicel veri analizinin kalitesini en üst düzeye çıkarmak. Floresan protein kanalı ve ayrıca tüm numuneler için BI cephanelik kalıp kanalı için görüntüler toplayın.

Verileri analiz etmek için Image J yazılımını aşağıdaki eklentilerle birlikte kullanın. Image J'nin 1.32 C sürümünden daha eski bir sürümünü kullanıyorsanız, aşağıdaki seçeneklere tıklayın. Aynı anda birden fazla görüntünün açılmasını sağlamak için, düzenleme seçenekleri giriş eğik çizgi çıktısı, eğik çizgi paylaşımını açmak için j dosya seçiciyi kullanmak için kutuyu tıklayın.

Tamam'a tıklayın. İlgilendiğiniz görselleri açın. Görüntü J, farklı görüntüler farklı piksel yoğunluklarına sahip olacağından, her görüntü için ekranda görüntülenen maksimum ve minimum piksel yoğunluklarını ayrı ayrı otomatik olarak tanımlayacaktır.

Bu, görüntülenen görüntülerin görüntülendiği gibi karşılaştırılabilir olmadığı anlamına gelir. Açılan görüntülerin hepsinin aynı ölçekte olduğundan emin olmak için, görüntülenecek üst ve alt piksel yoğunluklarını fiziksel olarak tanımlayın. Bu değerleri ayarlamak için görüntüyü seçin, parlaklık eğik çizgi kontrastını ayarlayın.

Ayarla'ya tıklayın, görüntülenen minimum ve maksimum değerleri tanımlayın. Ardından tüm açık görüntülere yay'ı seçin ve Tamam'ı tıklayın. Alternatif olarak, belirli bir kanalın tüm görüntülerini tek bir dosyada veya yığında bir araya getirin.

Görüntü J daha sonra tüm görüntüleri otomatik olarak aynı ölçeğe ayarlayacaktır. Bunu yapmak için, görüntü yığınlarını seçin, yığınlanacak görüntüleri girin, her dosya için ortak bir ad girin ve kullanılan başlıkları etiket olarak seçin. Tamam'a tıklayın.

Analiz için tüm açık görüntüleri sekiz bite dönüştürün. Sekiz bit görüntü türü seçildiğinde, bu, görüntülenen aralığı sıfır ile 255 arasında bir aralığa yeniden ölçeklendirir. Bilgi içeriğini kaybedeceği için orijinal 12 bit veya daha yüksek formatta kaydetmemek önemlidir.

Bir kopyası, Farklı Kaydet Seçeneği kullanılarak dönüştürülmüş sekiz bit adlı yeni bir klasöre kaydedin. Bütün bir görüntüdeki bi arsal kalıp bağlamanın kapsamını incelemenin bir yöntemi, bir piksel yoğunluğu korelasyon grafiği gerçekleştirmektir. Bu çizimin bir kanaldaki her piksel değeri, ikinci bir kanaldaki karşılık gelen piksel değerine göredir.

Bu nedenle, GFP floresansında yüksek bir piksel konumu, yüksek bağlanma varsa kül floresansında da yüksek olacaktır. Piksel korelasyonunu analiz etmek için, sekiz bit REA ve GFP görüntülerinin görüntüde açık olduğundan emin olun J.Sonraki, eklentiler görüntü ilişkilendiricisini seçerek görüntü ilişkilendirici eklentisini açın. Görüntü dosyalarını birinci görüntüye ve ikinci görüntüye atayın.

Ardından Tamam'ı tıklayın. Elde edilen yığın herhangi bir ayrıntılı bilgi görüntülemeyebilir. Bu normal.

Yığını dağılım grafikleri adlı yeni bir klasöre kaydedin ve başvurduğu örnekle aynı dosya adını verin. Örneğin, Ash GFP Korelasyon grafiği. Verileri görüntülemek için iki seçenekten birini belirleyin.

İlk olarak, process math log auto'yu seçerek verileri bir günlük biçimi olacak şekilde dönüştürün. Ardından, verileri görsel olarak yeniden ölçeklendirmek için görüntüyü tıklayın, parlaklığı ayarlayın, kontrastı eğik çizgi haline getirin ve otomatik'i seçin. İkinci olarak, verileri yalnızca düşük değerleri gösterecek şekilde görsel olarak yeniden ölçeklendirin ve özel bir LUT oluşturmak için verileri özel bir arama tablosu veya LUT kullanarak görüntüleyin.

Çok basit bir LUT için görüntü rengini düzenleme LUT'a tıklayın. Sol üst piksele tıklayın ve siyah rengi seçin. Ardından sağdaki bir sonraki pikseli seçin ve kırmızı rengi seçin.

Ardından, üçüncü piksele tıklayın ve fare düğmesini basılı tutarken seçimi sağ alt piksele sürükleyin. Kırmızı rengi seçin, Tamam'ı tıklatın ve sonra beyaz rengi seçin ve Tamam'ı tıklatın. Görüntüyü ekranda gösterilen görüntüye kilitlemek için daha önce açıklandığı gibi sıfır ile 255 arasında parlaklık eğik çizgi kontrast aralığını seçin.

Görüntüleri diğer programlara kopyalayıp yapıştırmak için RGB formatına dönüştürün. İlk olarak, daha önce açıklandığı gibi sekiz bit veya 16 bit görüntüleri açın. GFP için görüntülere bir LUT renk şeması atayın.

Resme tıklayarak yeşil LUT'u atayın. Tabloları yeşil olarak arayın. Son olarak, kopyalanacak görüntüyü seçin ve panoya kopyalayın Sisteme kopyalamayı düzenle'yi seçerek, bu şekil, kaynaşmış kinaz çorabı, GFP ve 30 dakika boyunca lekelenmiş bir TC etiketi için tipik bir sonucu gösterir.

HEC 2 9 3 hücrelerindeki kül ile, ASH'nin yüksek afiniteye sahip bir TC etiketi taşıyan hedef proteine verimli bir şekilde bağlandığı görülmektedir. Buna karşılık, bu şekil, GFP'ye kaynaşmış, ancak hem TC etiketinin özgüllüğünü hem de arka plan boyama seviyesini doğrulamak için gerekli olan TC etiketinden yoksun olan SARK'nın karşılık gelen kontrol örneğini göstermektedir. Bu sonuç, RH'nin hedef protein ile hiçbir reaktivitesi olmadığını, TC etiketinin eksik olduğunu ve SSH bağlanması için TC etiketinin özgüllüğünü gösterdiğini göstermektedir.

Bu prosedürü denerken, hücrelerde V bağlanmasını etkileyeceğinden, hücrelerin birleşik ve sakin olmasına izin vermemeyi unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, verilerinizi nicel olarak nasıl basitçe analiz edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız ve veri görselleştirme için kendi benzersiz IUTS'nizi geliştirmek için bu yöntemleri iyileştirebilirsiniz.