Name: ReAsH / Flash Etiketleme ve Hücreler Tetracysteine Sensör Proteinlerin Görüntü Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Öğrenin, canlı hücrelerde tetracysteine etiketli proteinleri FlAsH ve ReAsH boyalarıyla etiketleme ve konfokal mikroskopi ile nicel analiz yapma yöntemini. Bu teknik protein yapısı ve işlevi çalışmalarında kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma DMH ve TDM (NHMRC proje hibe) bağışları ile finanse edilmiştir. DMH Miegunyah Trust tarafından finanse edilen bir Grimwade Üyesi.

1. ReAsH / Flash ile etiketlenmesi için hücrelerin hazırlanması <ol><li> Ilgi hücre hattı için standart hücre kültürü yöntemleri kullanarak, doğrudan transfeksiyon için hazır bir canlı hücre görüntüleme slayt yapışık hücreler bir kültür hazırlayın. </li><li> Seçtiğiniz transfeksiyon yöntemine göre faiz plazmid içeren TC etiketli gen Transfect. </li></ol> TC etiketleri belirli bağlayıcı ölçüde değerlendirmek ve odaklı mikrograflar toplama kanalları arasında floresan bleedthrough değerlendirmek için pozitif ve negatif kontrollerin kullanılması önemlidir Not. Bu nedenle, iki renk (örneğin Flash / Cherry veya ReAsH / CFP veya ReAsH / GFP kombinasyonları), örnekler, tek renk (örneğin Floresan protein tek başına ya da mümkünse hiçbir floresan ile Flash / ReAsH ama bağlı TC-etiketli bir protein için hazırlanan sağlamak protein) <ol start="3"><li> Transfeksiyon Bir iki gün sonra, HBSS (37 ° C) 300 mcL önceden ısıtılmış hücreleri nazikçe yıkayın. </li><li> Prewarmed HBSS ve 10 mcM 1,2-ethanedithiol (EDT) 300 mcL 1 mcM Flash (ya da ReAsH) hücreler yavaşça bırakın. </li></ol> Hücreler ekleyerek Flash / ReAsH eklemeden önce EDT ekleyebilir ve hemen önce tampon yapmak önemlidir. 37 ° C dokusunda kültür inkübatör tam 30 dakika boyunca inkübe. Eşiğe deneyimimiz uzun inkübasyon süreleri önemli ölçüde artırır. Yeni yapıları da, zaman ve Flash / ReAsH konsantrasyonu (0.5-2 mcM) etiketlenmesi için optimize edilmelidir. <ol start="5"><li> Yavaşça 300 mcL prewarmed HBSS + 250 mcM 37 az 15 dakika boyunca 2,3-dimercaptopropanol (BAL) ° C ile değiştirin sonra hücrelerin çözüm etiketleme aspirat </li><li> Çözüm nazik aspirasyonu ile yıkayın ve 300 mcL prewarmed HBSS ile değiştirin çıkarın. </li></ol> Bu yıkamadan sonra, hücreler, bu non-spesifik biarsenical boya floresan artırdığını bulduk rağmen paraformaldehid (% 3.2 solüsyonu ile 15 dakika) ile sabit olabilir. Bu nedenle genellikle görüntü hücreleri oda sıcaklığında yaşıyor. (Etiketleme biarsenical boya bağlanmasını engelleyen önce bu hücre fiksasyonu unutmayın.) 2. Görüntüleme konfokal mikroskop hücreleri <ol><li> Konfokal mikroskop, görüntüleme bireysel fluorophores (bkz. Tablo 1) parametrelerini ayarlamak ve kanallar arasında ihmal edilebilir bleedthrough olduğundan emin olunuz. Bu floresan için her biri farklı floresan bir satın alma ayarı karşı bireysel fluorophores (kontrol numuneleri) kontrol ederek elde edilebilir. Emisyon dalga boyu aralığında ayarlanması bleedthrough (bu da sinyal / gürültü azaltabilir rağmen) en aza indirmek için yardımcı olabilir. </li><li> Ayrıca numune maksimum floresans dedektör doyurabilecek kalmaması photomultiplier ayarlarını. (SP2 Leica konfokal Q-LUT ayarını kullanarak tespit edilebilir). Bir kez iyi görüntüleme ayarları belirlenir, bunların örnekleri arasında herhangi bir değişiklik yok. </li><li> Diğer ayarlar (bu optimize edilmiş olmasına rağmen) biz genellikle 200 Hz tarama hızı ve 4 hat ortalamalar ve bir iğne deliği çapı 1 Airy birim toplamak. Iğne deliği çapı sinyal / noise bir sorun olup olmadığını, ancak, bu görüntüleme bazı kaybına neden olabilir genişletilebilir. </li><li> Mümkünse, 12-bit (veya üstü) formatında konfokal görüntüleri toplayın. 12-bit formatında, 8-bit (0-255) göre, her bir piksel yoğunluğu için değerleri (0-4095) daha yüksek dinamik aralık yakalar. Bu zengin veri seti nicel verilerin analiz kalitesini en üst düzeye kaydedilir sağlamak için önemlidir. </li><li> Floresan protein kanal (Kiraz, GFP veya CFP) ve aynı zamanda tüm örnekler için biarsenical boya kanal (Flash veya ReAsH) görüntüleri toplayın. </li></ol> 3. Verilerin analizi <ol><li> Yazılım bilgisayarınıza 8 ImageJ yükleyin. <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </li><li> ImageJ sürümüne aşağıdaki eklentileri olduğundan emin olun: <ul><li> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/file-opener.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/file-opener.html</a> </li><li> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/image_correlator.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/image_correlator.html</a> </li><li> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lut-editor.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lut-editor.html</a> </li></ul></li><li> Açık ImageJ ve v1.32c daha eski bir sürümü kullanıyorsanız, bir kez (farklı dosyalar üzerinde tıklarken kontrol düğmesi basılı tutarak yapılabilir) açılacak birden fazla görüntü sağlamak için aşağıdaki seçenekleri tıklayın: <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"></li><li> ImageJ ilgi görüntüleri açın. ImageJ, her resim için ayrı ayrı ekranda görüntülenen maksimum ve minimum piksel yoğunlukları otomatik olarak tanımlayacaktır. Farklı görüntüler d olacağı verilenifferent piksel yoğunlukları bakıldığında görüntülenen görüntüleri karşılaştırılabilir DEĞİLDİR anlamına gelir. </li><li> Açılan görüntülerin hepsi aynı ölçekte sağlamak için, fiziksel üst tanımlayabilirsiniz ve daha düşük piksel yoğunluklarda (bu başka bir yazılım olacak gibi görüntülerin gerçek veri içeriği değişmeyecek) görülebilir. Bu değerler aşağıdaki menü altında ayarlanabilir: <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"></li><li> Alternatif bir yaklaşım, aynı ölçekte yığın (görüntülemek için) tüm görüntüleri bir dosya içine tüm görüntüleri bir araya koyar ve otomatik olarak ölçekli yığınları ile çalışmak için. Verilerle çalışmak için en kolay yolu, her kanal bir yığın dönüştürmek için. Böylece, floresan protein kanal için gösterildiği gibi yığını tüm dönüştürmek. Başlığında bir ortak adı (örneğin, "ch00") içeren tüm görüntüleri istifleme tarafından kolayca bir kanal seçebilirsiniz. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"></li><li> Şimdi analiz için 8-bit için tüm açık görüntüleri dönüştürmek. Bu aslında bir 0-255 aralığı (8-bit tanımlayan) içine görüntülenen aralık rescale. ÖNEMLİ NOT: orijinal 12-bit (veya üstü) biçiminde tasarruf ya da bilgi içeriğini kaybedersiniz . Not, bu biçimi, rakamlar vb yapmak için yararlıdır bu nedenle bazı yazılım paketleri sadece 8-bit görüntüleri görüntüleyebilirsiniz <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"></li><li> "Seçenek" olarak ... Kaydet "seçeneğini kullanarak 8-bit dönüştürülür" olarak adlandırılan yeni bir klasörde bir kopyasını kaydedin. </li><li> Biarsenical boya bağlayıcı bir bütün görüntü ölçüde incelemek için bir yöntem, bir piksel yoğunluğu korelasyon arsa gerçekleştirmek için. Bu araziler bir kanal ikinci bir kanala karşılık gelen piksel değerine göre her piksel değeri. Bağlayıcı yüksek olup olmadığını Dolayısıyla CFP floresan yüksek bir piksel konumunu da ReAsH floresan yüksek olacak. </li><li> Co-korelasyon piksel analiz etmek, 8-bit ReAsH ve Cerulean / GFP görüntüleri ImageJ açık olduğundan emin olun. </li><li> "Görüntü korelatör" eklentisi aşağıda gösterildiği gibi açın. ReAsH veya flash yığını ve floresan protein yığını olarak "Image2" gibi "image1" i seçin. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"></li><li> Yığını herhangi bir ayrıntılı bilgi görüntülemek olmayabilir, bu normaldir. "SCATTERPLOTS" olarak adlandırılan yeni bir klasöre yığını kaydedin ve bunu atıfta örnek olarak aynı dosya adını vermek (örneğin, "flash-kiraz korelasyon komplo") </li><li> Verileri görüntülemek için anlamlı iki seçenekten birini yapabilirsiniz. Öncelikle günlük biçiminde böylece veri dönüşümü. Sonra aşağıdaki gibi görsel veri rescale: <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step6.jpg" alt="Şekil 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 6"></li><li> Alternatif olarak, sadece düşük değerler (örneğin 1-255) ve özel bir LUT kullanarak veri görüntülemek için görsel veri rescale. LUT (Yukarı Bak), bir görüntüdeki her bir piksel değeri atanır renk bir masa temsil eder Bu bir görüntü için bir Pseudocolor düzenini tanımlamak için kullanılan ve bir görüntüdeki bazı özellikleri tanımlamak için yararlı olabilir. "LUT editörü" özel bir LUT tıklama oluşturmak ve yeni bir biri olarak gösterilir (bu kaydedilir ve daha sonra kullanılabilir) yapmak için. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step7.jpg" alt="Şekil 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 7"></li><li> 0-255 parlaklık / kontrast aralığı (yukarıdaki 13. adımda açıklandığı gibi) ayarlayın. "Kilidi" olarak ekranda gösterilen görüntü, görüntüdeki her bir pikselin kırmızı, yeşil ve mavi renk, her bir 8-bit değeri kaydeder RGB formatına dönüştürülecek için. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step8.jpg" alt="Şekil 8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 8"> 8-bit veya 16-bit görüntüleri ilk görüntüleri diğer programlara kopyalama ve yapıştırma için açın. Yukarıda adım 14 olarak açıklandığı gibi, resmin bir LUT renk düzeni atayın. CFP için, aşağıda açıklandığı gibi "Cyan" LUT atamak ... <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step9.jpg" alt="Şekil 9" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 9"></li><li> Görüntüyü seçin ve panoya kopyalamak için seçmek ... <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step10.jpg"></li></ol> 4. Temsilcisi sonuçları: Biarsenical boya ile etiketleme hücrelerin başarı, birkaç anahtar parametreleri bağlıdır. Öncelikle, boya ile etiketleme zamanlaması çok önemlidir. Biz bulduk, etiketleme uzun süre (30 dakika daha fazla) yüksek düzeyde bir non-spesifik bir arka plan boyama sonuç. Şekil 1, daha önce 7 açıklandığı gibi TC etiketi içeren CFP türev Cerulean erimiş huntingtin parçası yabani tip formu (25Q) için tipik bir sonucu gösterir . Bu örnek ReAsH ile 30 dakika boyanmış ve TC etiketi eksik örnek minimal arka plan var. Biz paraformaldehid artar arka plan ile hücre sabitleme metanol ile tespit floresan protein etiketi floresan lağvetti ederken bulduk. Bu nedenle hücreler mümkünse biz görüntü canlı. Ayrıca bu fiksasyon önce dikkat etmek önemlidir.biarsenical boya ile etiketleme için TC motifi değişiklikler nedeniyle, muhtemelen onların bağlayıcı önler. Tutarlı sonuçlar elde etmek için bir başka kritik faktör, hücre yoğunluğu. Biz, gevşek bir şekilde dağıtılmış ve aynı zamanda geniş bir topaklanma farklı hücreler biarsenical boyaların düzensiz boyanma yol açabilir görüntü hücreleri kritik bulduk. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 Tetracysteine ​​etiketleri ve huntingtin (exon1-25Q) Cerulean füzyonlar ile transfekte canlı hücrelerde ReAsH boyanma. TC etiketi huntingtin Cerulean füzyon (7 açıklandığı gibi) kavşak noktasında yer almaktadır. Piksel yoğunluğu korelasyon arsa hücre boyunca bağlayıcı ReAsH farklılıkları bir değerlendirme sağlar ve konformasyonel değişikliği veya ligand etkileşimleri nedeniyle bağlayıcı ReAsH değişiklikler harita için kullanılabilir.

<ol><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Ann. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+covalent+labeling+of+recombinant+protein+molecules+inside+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells.</a> Science. 281, 269-2672 (1998).</li>
<li>Uttamapinant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorophore+ligase+for+site-specific+protein+labeling+inside+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 10914-10919 (2010).</li>
<li>Ignatova, Z., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+protein+stability+and+aggregation+in+vivo+by+real-time+fluorescent+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Monitoring protein stability and aggregation in vivo by real-time fluorescent labeling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 523-528 (2004).</li>
<li>Coleman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+detection+of+prion+protein+with+biarsenical+labeling+and+FlAsH+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Conformational detection of prion protein with biarsenical labeling and FlAsH fluorescence.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 380, 564-568 (2009).</li>
<li>Luedtke, N. W., Dexter, R. J., Fried, D. B., Schepartz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surveying+polypeptide+and+protein+domain+conformation+and+association+with+FlASH+and+ReAsH%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Surveying polypeptide and protein domain conformation and association with FlASH and ReAsH.</a> Nat. Chem. Biol. 3, 779-784 (2007).</li>
<li>Ramdzan, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation+sensors+that+distinguish+monomeric+proteins+from+oligomers+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Conformation sensors that distinguish monomeric proteins from oligomers in live cells.</a> Chem. Biol. 17, 371-379 (2010).</li>
<li>Abramoff, M. agelhaes, PJ, S. J. R. am <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+International%22%5BJournal%5D)">Image processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Hearps, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biarsenical+dye+Lumio+exhibits+a+reduced+ability+to+specifically+detect+tetracysteine-containing+proteins+within+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Fluor%22%5BJournal%5D)">The biarsenical dye Lumio exhibits a reduced ability to specifically detect tetracysteine-containing proteins within live cells.</a> J. Fluor. 17, 593-597 (2007).</li>
<li>Adams, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo%3A+Synthesis+and+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications.</a> J. Am. Chem. Soc. 124, 6063-6076 (2002).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Meth. 2, 905-909 (2005).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Ikinci bir boya ile floresan protein ve konformasyonel özellikleri ile etiket protein lokalizasyon yaklaşımı farklı proteinlerin konformasyonlar hücreleri ve protein konformasyonu dinamiklerini değiştiren olaylar tahakkuk haritalama için çok potansiyel sunmaktadır. ReAsH / Flash ilk memeli hücresel retinoik asit bağlayıcı protein 4 protein katlanması için bir hücre sensörü olarak kullanılmıştır. Bu örnekte, bir TC etiketi bağlı Flash gelişeceğini formuna göre katlanmış şeklinde floresans verimi azalır hücrese...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog Numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Μ-slaytları 8-iyi </td><td> Ibidi </td><td> 80826 </td><td> Biz bu odasına görüntüleme için kültür hücreleri için özellikle yararlı olabilmesi için slaytlar bulabilirsiniz. </td></tr><tr><td> TC-Flash II Tetracysteine ​​Etiket algılama hücresinde Kiti * yeşil floresan * * canlı hücre görüntüleme </td><td> Invitrogen </td><td> T34561 (Flash) veya T34562 (ReAsH) </td><td></td></tr><tr><td> Hanks &#39;Dengeli Tuz Çözeltisi </td><td> Invitrogen </td><td> 14175-103 </td><td></td></tr><tr><td> 2,3-Dimercapto-1-propanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D1129-5ML </td><td></td></tr><tr><td> 1,2-Ethanedithiol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 02.390-25ml </td><td></td></tr></tbody></table>

reash / flash etiketleme ve hücreler tetracysteine ​​sensör proteinlerin görüntü analizi

ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

Floresan proteinleri ve boyalar, hücrelerin protein kaçakçılığı, yerelleştirme ve fonksiyon çalışması için gerekli araçları vardır. Yeşil floresan proteininin (GFP) gibi floresan proteinleri yoğun proteinlere füzyon ortağı olarak küçük etiketleri konformasyonel değişikliği gibi hücrelerin incelenmesi gereken proteinlerin yeni işlevler sağlayan bir protein ilgi 1 özellikleri, son gelişmeleri takip etmek için kullanılmış olsa da ve protein dernek 2, 3. Bir küçük etiket sistemi genetik biarsenical boyalar bağlayan bir hedef protein, içine yerleştirilen bir tetracysteine ​​motifi (CCXXCC) içerir ReAsH (kırmızı floresan) ve Flash (yeşil floresan), 2 canlı hücrelerinde bile yüksek özgüllüğü. TC / biarsenical boya sistemi, konformasyonel değişikliği ve protein-protein etkileşimleri 4-7 ölçmek için birçok yeni yaklaşımlar sağladı floresan proteinleri daha ana proteine ​​daha az sterik kısıtlamalar sunmaktadır . Yakın zamanda hücrelerde mutant huntingtin ifade oligomerization, sensörler, bir roman gibi TC etiketleri uygulama geliştirdi Huntington hastalığı 7 nöronların agrega mutasyona uğramış. Huntingtin iki floresan boyalar, bir protein konumunu izlemek için floresan protein ve sadece monomerlerin biarsenical boyalar bağlayan ikinci bir TC etiketi ile etiketlenmiş. Bu nedenle, protein ve biarsenical boya reaktivitesi arasında ko değişiklikler hücre içinde mekansal eşlenebilir mikroskopik oligomer içerikler sağladı. Burada, Flash veya ReAsH canlı memeli hücrelerinde ve nasıl iki renkli floresan (Kiraz / Flash CFP / / Flash veya GFP ölçmek için bir floresan proteini (Kiraz, GFP veya CFP) erimiş TC etiketli proteinlerin nasıl etiketlemek için tarif ReAsH kombinasyonları).

Flash ve ReAsH biarsenical boyalar özellikle proteinlerin tetracysteine ​​motiflerine bağlanır ve seçici canlı hücrelerde protein etiketleyebilirsiniz. Son zamanlarda bu etiketleme stratejisi, farklı protein konformasyonlar veya oligomerik devletler için sensörler geliştirmek için kullanılır olmuştur. Biz etiketleme yaklaşımı tanımlar ve yöntemleri kantitatif bağlayıcı analiz etmek.

ReAsH / Flash Etiketleme ve Hücreler Tetracysteine ​​Sensör Proteinlerin Görüntü Analizi

Floresan proteinler ve boyalar; hücrelerdeki protein taşınımının, lokalizasyonunun ve fonksiyonunun incelenmesi için temel araçlardır. Floresan proteinler ...

Bu prosedürün genel amacı, tetra sistein ve floresan işaretli protein eksprese eden hücreleri flash veya ash boyalarıyla etiketlemek ve sonuçları kantitatif olarak analiz etmektir. Bu işlem, öncelikle floresan bir protein ile tetra sistein etiketi içeren hedef proteini taşıyan bir plazmidin ilgili hücre hattına transfekte edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, eksprese edilen protein R veya flash ile etiketlenir ve mikroskobik görüntülemeye hazırlanmak için spesifik olmayan şekilde bağlanan boya, BAL ile yıkanarak uzaklaştırılır.Ardından, ash veya flash ve floresan protein kanallarını kullanarak hücrelerin floresan görüntülerini toplamak için konfokal mikroskop kullanılır. Son olarak, ash veya flash'ın hedef proteine bağlanmasını nicelleştirmek için görüntüler Image J kullanılarak analiz edilir. Nihayetinde, ash floresansı ile floresan protein floresansının korelasyonu yoluyla, hücrelerde ash veya flash'ın hedef proteine bağlanma derecesini gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu tekniğin, hedef proteini sadece GFP ile işaretlemek gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, proteinin lokalizasyonuna ek olarak konformasyonel değişim gibi ikinci bir özelliğinin de takip edilebilmesidir

reashflash-labeling-image-analysis-tetracysteine-sensor-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz tek hücreleri üzerinde floresan kullanarak yapı değişiklikleri siteye özgü analizi ile birlikte membran proteinlerinin iyon taşıma kinetiği ölçen bir yöntem anlatacağım. Bu teknik, iyon kanalları ve iyon pompaları uyarlanabilir ve protein altbirimden arasındaki mesafe sınırlamaları belirlemek için kullanılabilir.

Membran Proteinleri Konformasyonel Dynamics incelenmesi In situ Site Floresan Etiketleme

Toplam İç Yansıma Floresans (TIRF) mikroskopi yakın yüksek kontrast ve zamansal çözünürlükte hücre yüzeyine yapıları gözlemlemek için güçlü bir yaklaşımdır. Biz TIRF hücre duvarı kapalı bakteriyel ve mantar hücreleri kortekste protein dinamiklerini incelemek için istihdam edilebilir göstermek.

Mikroorganizmalarda Cortex Organizasyon ve Dinamiği Görselleştirme, Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu kullanılarak

Hücresel canlılığı proteinin hatalı katlanması zamanında ve etkin yönetimine bağlıdır. Inklüzyonlarınca refolding, bozulması veya sekestrasyon: Burada bir katlanan proteinin farklı potansiyel kaderi görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz Ubc9, katlanabilir sensör kullanımını...

Canlı Hücrelerde Protein Aggregation 4D Görüntüleme

Bu protokol, canlı hücrelerin yüzeyindeki tek reseptörleri görselleştirmek ve izlemek ve böylece reseptör yanal hareketliliğini, reseptör komplekslerinin boyutunu analiz etmek ve ayrıca geçici reseptör-reseptör etkileşimlerini görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan mikroskobunun nasıl kullanılacağını açıklar. Bu protokol diğer zar proteinlerine genişletilebilir.

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Bu makale, bir sinaptobrevin2-pHluorin yapısı ve Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu kullanarak nöroblastom hücrelerinde nörotransmitter vezikül dinamiklerini araştırmak için bir yöntem sağlar. Görüntü işleme ve veri analizi için geliştirilen strateji de raporlanmaktadır.

TIRFM ve pH-duyarlı GFP-sondalar SH-SY5Y Nöroblastom Hücrelerinde nörotransmitter Vesikül Dynamics değerlendirin: Hücre Görüntüleme ve Veri Analizi

Protein etkileşimleri bir hücrenin işlevi merkezinde yer alıyor. Kalorimetre ve spektroskopik teknikleri yaygın onları karakterize etmek için kullanılır. Burada Shwachman-Diamond Sendromu (SBD'ler) mutasyona uğramış protein ve Uzama faktörü benzeri 1 GTPaz (EFL1) arasındaki etkileşimi incelemek için bir araç olarak floresan anizotropi açıklar.

Protein-protein etkileşimleri çalışmak için aracı olarak floresan Anizotropi

Bu makalede biyokimyasal miktarda deterjan çözündürüldükten TRPV1 spektroskopik analiz için elde için belirli yöntemleri açıklar. Kombine protokoller memeli iyon kanalları membran kontrollü bir ortamda yapısal ve fonksiyonel çalışmaları kolaylaştırmak için uyarlanmış Biyokimya ve biyofizik araçları sağlar.

Arıtma ve TRPV1 sulandırma spektroskopik analizi için

Protein-protein etkileşimleri biyolojik sistemleri için kritik olan ve bağlama Kinetik çalışmalar dynamics ve protein kompleksleri fonksiyonu sağlar. Floresans rezonans enerji transferi ve durdu-akış tekniği kullanarak karmaşık bir proteinin Kinetik parametrelerin quantifies bir yöntemi açıklanmaktadır.

Protein kompleksleri milisaniyelik zaman ölçekte dinamikleri çalışmaya vitro Floresans rezonans enerji transferi içinde kullanma

Protein tiol oksidasyonunun normal fizyolojik ve patofizyolojik koşullar altında önemli etkileri vardır. Reçine destekli yakalama, izobarik etiketleme ve kütle spektrometrisini kullanan, proteinlerin geri dönüşümlü olarak oksitlenmiş sistein kalıntılarının bölgeye özgü tanımlanmasını ve nicelleştirilmesini sağlayan kantitatif bir redoks proteomik yönteminin ayrıntılarını açıklıyoruz.

Reçine Destekli Yakalama, Protein Thiol Oksidasyonunun Çoklanmış Niceliği için İzobarik Tandem Kütle Etiketi Etiketleme ile Birleştirildiğinde

Bu çalışma, doğal olmayan amino asit (UAA) dahil etme yoluyla bölgeye özgü etiketleme kullanarak G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler) üzerinde tek moleküllü floresan rezonans enerji transferi (smFRET) deneyleri gerçekleştirmek için ayrıntılı bir prosedür sunmaktadır. Protokol, smFRET numune hazırlama, deneyler ve veri analizi için adım adım bir kılavuz sağlar.

Tek Moleküllü FRET Kullanarak Membran Reseptörlerinin Konformasyonel Dinamiğinin Görselleştirilmesi

Doğası gereği düzensiz bölgeler (IDR'ler), çevresel değişikliklere yanıt olarak konformasyonlarını değiştiren esnek protein alanlarıdır. Topluluk floresan rezonans enerji transferi (FRET), farklı koşullar altında protein boyutlarını tahmin edebilir. Hiperozmotik stres altında yaşayan Saccharomyces cerevisiae hücrelerinde IDR yapısal duyarlılığını değerlendirmek için bir FRET yaklaşımı sunuyoruz.

Canlı Hücrelerde Hiperozmotik Strese Yanıt Olarak İntrinsik Olarak Düzensiz Bölgelerin Yapısal Duyarlılığının FRET Kullanılarak Tahmini

Öğrenin, canlı hücrelerde tetracysteine etiketli proteinleri FlAsH ve ReAsH boyalarıyla etiketleme ve konfokal mikroskopi ile nicel analiz yapma yöntemini. Bu teknik protein yapısı ve işlevi çalışmalarında kullanılır.

ReAsH / Flash Etiketleme ve Hücreler Tetracysteine ​​Sensör Proteinlerin Görüntü Analizi

Daha fazla video keşfet

ReAsH / Flash Etiketleme ve Hücreler Tetracysteine Sensör Proteinlerin Görüntü Analizi