Atomik Kuvvet Mikroskopi Görüntüleme Bakteriyel İmmobilizasyon
August 10th, 2011
Canlı Gram-negatif ve Gram-pozitif bakterilerin jelatin kaplı mika üzerinde hareketsiz ve Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) kullanarak sıvı görüntülü olabilir.
Atomik kuvvet mikroskobu veya bir FM, numuneyi kimyasal olarak işlemeye gerek kalmadan yüksek çözünürlüklü görüntüler oluşturmak için bir yüzeyin mekanik olarak sondalanmasını kullanır. Bu videoda, bakteriler jelatin kaplı mika üzerine immobilize edilir ve bir FM ile sıvı bir ortamda görüntülenir. İlk olarak, MICA® kareleri A FM mikroskop platformuna uyacak şekilde kesilir. MICA'nın üst tabakası çıkarılır ve mika kareleri jelatin ile kaplanır.
Daha sonra, jelatin kaplı mika üzerine bir damla bakteri süspansiyonu yerleştirilir ve yayılır. Bir pipet ucu kullanılarak numuneler 10 dakika inkübe edilir. Daha sonra bağlanmamış bakteriler yüzeyden yıkanır.
Numune, A FM ıslak hücresine yerleştirilir ve canlı bakterilerin yüksek çözünürlüklü görüntülerini elde etmek için görüntülenir. Bu tekniğin ISO gözenekli filtre mobilizasyonu gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, hem çubuk şeklindeki hem de küresel bakterilerin güvenilir bir şekilde hareketsiz hale getirilebilmesidir. Ayrıca, hücre yüzeyinin daha büyük bir yüzdesine A FM probu tarafından erişilebilir.
Atomik kuvvet mikroskobunun diğer mikroskopilere göre önemli bir avantajı, tek hücreli çalışmaların hücre morfolojisi, septum oluşumu ve sitokinez ile ilgili araştırmalar yapılabilmesidir. Bu yönteme yeni olan kişiler, bakterileri hareketsiz hale getirdiği kanıtlanmamış jelatini veya bileşenlerin bakterilerin jelatin yüzeyine yapışması ile rekabet edeceği karmaşık bir ortamda yetiştirilen kullanılmış bakterileri kullanma eğiliminde oldukları için mücadele edeceklerdir. Bu yöntem için ilk olarak 1970'lerde bakterilerin hareketsiz hale getirildiği deneylerden aklımıza geldi.
Işık mikroskobu ve oto radyografi kullanan deneyler için jelatin kaplı cam slaytlar. Bu gösteride, canlı gram-negatif bakteriler bir FM görüntüleme için immobilize edilir, ancak yöntem aynı zamanda gram-pozitif bakterilere de uygulanabilir. MICA'yı hazırlamak için, A FM mikroskop aşamasına uyacak ve A FM ıslak hücreyi barındıracak şekilde makasla keserek başlayın.
Daha sonra MICA® yüzeyine viski bandı yerleştirin ve MICA'nın dış tabakasını kesilen parçadan soymak için çıkarın. Yalnızca pürüzsüz, kırılmamış katmanlar kalana kadar dış katmanı her iki taraftan çıkarmaya devam edin. Jelatin çözeltisini hazırlamak için, bir laboratuvar şişesine 100 mililitre damıtılmış su ekleyin ve bir mikrodalgada ısıtın.
Su kaynamaya başladığında, mikrodalgadan çıkarın, 0.5 gram jelatin ekleyin ve jelatin eriyene kadar şişeyi hafifçe şişirin. Sığır jelatinlerinin bu prosedür için iyi çalışmadığını unutmayın. Domuz jelatinleri tavsiye edilir.
Şişeyi tezgahın üzerine yerleştirin ve 60 ila 70 santigrat dereceye kadar soğumaya bırakın. Daha sonra, MICA'nın forseps kullanılarak tamamen daldırılabilmesini sağlamak için yeterli miktarda jelatin çözeltisini küçük bir behere dökün. Bir MICA® karesini ılık jelatin çözeltisine batırın ve hızla geri çekin. Hemen.
MICA'yı gece boyunca ortam havasında kuruması için bir mikro santrifüj rafına yaslanmış bir kağıt havlu üzerine kenarına yerleştirin. Jelatin kaplı MICA® en az iki hafta boyunca kullanılabilir. Jelatin kaplı MICA'ya birkaç hafta kullanılmayacaksa.
Kapalı bir Petri kabında filtre kağıdına yerleştirin ve oda sıcaklığında saklayın. Fazla jelatin çözeltisi buzdolabında tutulabilir ve stok çözeltisini 60 ila 70 derece arasında yeniden ısıtarak yaklaşık bir ay boyunca kullanılabilir. Yeniden ısıtma sırasında jelatinin kaynatılmamasını sağlamak için Celsius özeni gösterilmelidir.
Bakterileri jelatin kaplı MICA'ya monte etmeden önce, bakteri konsantrasyonunun yeterli olduğundan emin olun. Bakteri örneğinin 600 nanometrede optik yoğunluk okumasını elde etmek için bir spektrofotometre kullanın. 0,5'e bir OD en uygunudur.
Daha sonra, kültürün bir mililitresini bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve santrifüjlemeyi takiben pelet yapmak için santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarmak için bir pipet kullanın, ardından peleti bir mililitre filtrelenmiş deiyonize su veya tamponda yıkayın. Tekrarlamak için nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
Pelet santrifüjünü askıya alın, kazancınızı artırın ve peleti hemen yeniden askıya alın. 500 mikrolitre nano saf deiyonize suda, yeterli hücre konsantrasyonuna sahip olmak için bakteri süspansiyonu gözle görülür şekilde çimlenmiş olmalıdır. FM görüntüleme için.
Ozmotik şok söz konusuysa, görüntüleme solüsyonuna 0.25 molar sükroz eklenebilir. Bu bakteriyi suda tekrar askıya aldım, ancak diğer sıvıları denemekten korkmayın. Örneğin, bunu %0.25 sükroz ile yaptık, bu yüzden diğer sıvıları deneyin ve bunun da işe yarayıp yaramayacağını görün.
Her örnek için iki slayt hazırlayın. Bir mikro pipetleyici kullanarak, jelatin kaplı yüzeye 10 ila 20 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin. Ardından, bir FM görüntüleme için yeterli bir kapsama alanı sağlamak için, damlacığı hem X hem de Y yönünde yaymak için bir mikro pipet ucu kullanın.
Pipet ucuyla jelatin yüzeyine fiziksel olarak dokunmamaya dikkat ederek, numuneyi oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Daha sonra, numunenin kenarını bir kağıt havluya veya filtre kağıdına dokundurarak numunedeki fazla sıvıyı bir su akışı ile sıfırlayın. Bir nitrojen gazı jeti kullanarak slaytlardan birini hızla kurutun.
Ardından slaydı görsel olarak inceleyin. Opak bir nokta, bakterilerin yıkama adımında uzaklaştırılmadığını gösterir. Şimdi görüntüleme için kullanılacak olan diğer lamın kurumasına izin verilmemelidir.
A FM ıslak tablasına yerleştirin ve klipsleri kullanarak sabitleyin, bir mikro pipet kullanarak ıslak tablaya su ekleyin. Sıvı içinde görüntülemeden önce atomik kuvvet mikroskobunu hazırlamak iyi bir fikirdir. Sıvı içinde görüntüleme için konsolun A FM'ye yerleştirildiğinden ve lazerle hizalandığından emin olun.
100 mikron tarama kafası ve nanometre başına 0,01 ila 0,1 nano newton arasında değişen nominal yay sabitlerine sahip vico silisyum nitrür probları ile donatılmış bir pico artı atomik kuvvet mikroskobu kullanarak atomik kuvvet mikroskobu ile görüntülemeye devam edin. Mikroskop hazırlandıktan sonra, bir FM tarayıcıyı yerleştirin ve streç mikroskobun içine yerleştirin. Tipik olarak, görüntüleme hızımız olarak saniyede 0,5 satırdan saniyede bir satıra kadar başlarız ve çözünürlük satır başına 1 28 veri noktasından 512'ye ayarlanır.
Enstrümanı, satır başına 128 ila 512 piksel kullanarak görüntü toplayacak şekilde ayarlayın. Saniyede 0,5 ila bir satır tarama hızında tarayın. Ardından gerekirse, en iyi görüntüleri elde etmek için A FM'deki ayar noktasını ve kazançları ayarlayın.
Son olarak, görüntüleri toplayın. E coli bakterileri, bu videoda anlatıldığı gibi jelatin kaplı MICA'ya monte edildi ve daha sonra 0.005 molar PVS'de görüntülendi. Bu yöntemi kullanarak.
Asa toplanan görüntüde açıkça görülebilir ve hücre yüzeyleri pürüzsüzdür ve dehidrasyon belirtisi göstermez. Buna karşılık, burada gösterildiği gibi havadaki aynı e coli'den alınan görüntüler, genellikle sıvıda görülmeyen yapıları gösterir. Bu durumda hücreler dehidrasyona bağlı olarak halka yaşlı bir görünüm gösterir ve FIA gibi bakteri uzantıları görülebilir.
Bu videoyu izledikten sonra, sıvı bir ortamda FM görüntüleme için bakteri örneklerinin nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, jelatin kaplı mikro yüzeyler daha önce yatakta hazırlanmışsa, bu teknik yaklaşık bir saat içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü denerken, doğru jelatini seçmek ve bu prosedürü takiben uygun bir bakteri konsantrasyonuna sahip olmak önemlidir.
Bakteri yüzeylerindeki kuvvet ölçümlerini korumak için FN konsolunun bir kuvvet algılama aracı olarak kullanılması gibi diğer ölçümler de gerçekleştirilebilir. Ayrıca, etkileşim kuvvetlerini tanımlamak ve ölçmek için bakteri yüzeyindeki belirli hedeflerle etkileşime girmek için spesifik prob molekülleri A FM ucuna bağlanabilir. Genel olarak, patojenik bakterilerle çalışıyorsanız, bu yöntemle çalışırken her zaman önlem almanız gerektiğini unutmayın.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, canlı Gram-negatif ve Gram-pozitif bakterileri bir sıvı ortamda immobilize etmek ve görüntülemek için Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) kullanımını gösterir. Yöntem, bakteri yapışmasını ve görselleştirmeyi kolaylaştırmak için mika yüzeyinin jelatin ile kaplanmasını içerir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyoloji
- Görüntüleme Teknikleri
- Atomik Kuvvet Mikroskobu
Arka Plan
- Atomik Kuvvet Mikroskobu, yüzeylerin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini sağlar.
- Canlı bakteriler, hareketleri nedeniyle çalışmakta zorluk çıkarabilir.
- Jelatin kaplı yüzeyler, bakteri immobilizasyonunu artırabilir.
- Sıvı ortamlarda görüntüleme, bakterilerin doğal durumunu korur.
Çalışmanın Amacı
- Bir yüzeye bakteri immobilize etme yöntemini göstermek.
- AFM kullanarak kimyasal işlem yapılmadan bakterileri görselleştirmek.
- Bakteri görüntüleme ile ilgilenen araştırmacılar için bir protokol sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Mika kareleri kesilir ve jelatin ile kaplanır.
- Jelatin yüzeyine bakteri süspansiyonu damlatılır.
- Bakterilerin yapışması için örnekler inkübe edilir.
- Görüntülemeden önce bağlı olmayan bakteriler yıkanır.
Ana Sonuçlar
- Canlı bakteriler jelatin kaplı mika üzerinde başarıyla immobilize edildi.
- AFM kullanılarak bakterilerin yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde edildi.
- Yöntem, sıvı ortamda görüntülemeyi sağlar.
- Hem Gram-negatif hem de Gram-pozitif bakteriler görselleştirildi.
Sonuçlar
- Bu yöntem, canlı bakterileri çalışmak için güvenilir bir yol sağlar.
- AFM, biyolojik numunelerin görüntülemesinde etkili bir şekilde kullanılabilir.
- Mikrobiyoloji ve görüntüleme tekniklerinde daha fazla uygulama mümkündür.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Atomic force microscopy enables high-resolution imaging of live bacteria in liquid environments without chemical fixation, preserving native morphology and physiological state. This capability supports early-stage target validation by allowing direct observation of bacterial surface structures, division events, and membrane dynamics under near-native conditions. The gelatin-coated mica immobilization method provides a reproducible, minimally invasive platform for microbiological imaging that reduces sample preparation artifacts and enhances data reliability in discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct visualization of bacterial morphology, septum formation, and cytokinesis to interrogate therapeutic hypotheses about cell division targets.
- Operational Value: Provides label-free, liquid-phase imaging that avoids fixation artifacts and preserves functional bacterial attributes for mechanistic de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Gelatin-coated mica creates a standardized, reusable surface for consistent bacterial immobilization across screening campaigns.
- Operational Value: Supports preparation of validated biological systems with high surface accessibility for AFM probe interaction, enabling reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates continuity from discovery to preclinical validation by imaging live bacteria in liquid, maintaining disease-relevant system integrity.
- Operational Value: Enables risk-adjusted advancement decisions through quantitative, reproducible morphological and topological readouts.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a standardized preparation step for live bacterial imaging, supporting hypothesis testing and biological de-risking before lead identification stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through direct imaging of cell surface dynamics and division events in liquid.
- Screening: Enables assay readiness via reproducible bacterial immobilization on gelatin-coated mica, ensuring consistent sample presentation for AFM analysis.
- Analytics: Generates high-resolution topographical and force measurements that allow comparison of bacterial conditions, treatments, or genetic modifications.
- Translational Research: Maintains continuity with preclinical work by preserving native bacterial state in liquid, avoiding artifacts from fixation or dehydration.
- Enterprise Reuse: Gelatin-coated mica substrates can be prepared in advance and stored for up to two weeks, enabling platform reuse across multiple projects and teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct, label-free observation of bacterial ultrastructure.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined immobilization protocols, gelatin source specifications (porcine), and concentration controls (OD 0.5–1.0).
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering quantitative morphological data that reduces late-stage biological risk in antimicrobial or antibacterial programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through standardized, scalable imaging outputs that enable cross-functional comparison of antibacterial candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation, liquid-cell imaging, and bacterial handling under aseptic conditions.
- Depends on access to AFM systems with liquid cells, silicon nitride probes, and environmental control for scan speed and resolution.
- Necessitates standardization of gelatin preparation (porcine, 0.5% in distilled water), mica preparation, and bacterial concentration (OD 0.5–1.0 at 600 nm) across teams.
- Involves adaptation considerations for different bacterial strains, media components, and imaging buffers (e.g., sucrose addition for osmotic sensitivity).
- Limited by the need to avoid gelatin boiling during preparation and potential interference from complex media components that compete with bacterial adhesion to gelatin.
