Atomik Kuvvet Mikroskopi Görüntüleme Bakteriyel İmmobilizasyon

Atomik kuvvet mikroskobu veya AFM, numuneyi kimyasal olarak işleme gerek kalmadan yüksek çözünürlüklü görüntüler oluşturmak için yüzeyin mekanik olarak taranmasını kullanır. Bu videoda, bakteriler jelatin kaplı mika üzerine immobilize edilir ve bir AFM tarafından sıvı ortamda görüntülenir. Öncelikle MICA kareleri, AFM mikroskop platformuna uygun boyutlarda kesilir. MIKA'nın üst tabakası çıkarılır ve mika kareler jelatin ile kaplanır.

Ardından, jelatin kaplı mika üzerine bir damla bakteri süspansiyonu yerleştirilir ve yayılır. Pipet ucu kullanılarak, örnekler 10 dakika boyunca inkübe edilir. Daha sonra, bağlanmamış bakteriler yüzeyden yıkanarak uzaklaştırılır.

Numune A FM ıslak hücreye yerleştirilir ve canlı bakterilerin yüksek çözünürlüklü görüntülerini elde etmek için görüntüleme yapılır. Bu tekniğin ISO gözenekli filtre immobilizasyonu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, hem çubuk şekilli hem de küresel bakterilerin güvenilir bir şekilde immobilize edilebilmesidir. Ayrıca, hücre yüzeyinin daha büyük bir kısmı A FM probu için erişilebilirdir.

Atomik kuvvet mikroskobunun diğer mikroskobik yöntemlere göre temel bir avantajı, tek hücre çalışmaları yapılabildiği için hücre morfolojisi, septum oluşumu ve sitokinezi üzerine incelemeler yürütülebilmesidir. Bu yöntemde yeni olan kişiler, bakterileri sabitlediği kanıtlanmamış jelatinler kullandıkları veya bileşenlerin bakterilerin jelatin yüzeyine yapışmasıyla rekabet edeceği kompleks ortamlarda büyütülmüş bakteriler kullandıkları için zorluk yaşayabilirler. Bu yöntemle ilgili ilk fikri, bakterilerin immobilize edildiği 1970'lerdeki deneylerden aldık.

Işık mikroskobu ve otoradyografi kullanan deneyler için jelatin kaplı cam lamlar. Bu demonstrasyonda, canlı gram-negatif bakteriler bir AFM görüntülemesi için immobilize edilmektedir, ancak yöntem gram-pozitif bakteriler için de uygulanabilir. MICA'yı hazırlamak için, önce AFM mikroskop tablasına uyması ve AFM ıslak hücreye yerleşebilmesi için makasla kesin.

Ardından, MICA yüzeyine şeffaf bant yapıştırın ve bandı kaldırarak kesilmiş parçanın dış katmanını soyun. Sadece pürüzsüz ve bozulmamış katmanlar kalana kadar her iki taraftan dış katmanları çıkarmaya devam edin. Jelatin çözeltisini hazırlamak için, bir laboratuvar şişesine 100 milliliters saf su ekleyin ve mikrodalga fırında ısıtın.

Su kaynamaya başladığında mikrodalgadan çıkarın, 0.5 gram jelatin ekleyin ve jelatin çözünene kadar şişeyi hafifçe sallayarak şişirin. Sığır jelatinlerinin bu prosedür için uygun olmadığını unutmayın. Domuz jelatinlerinin kullanılması önerilir.

Şişeyi tezgah üzerine yerleştirin ve 60 ila 70 °C'ye kadar soğumasını bekleyin. Ardından, bir MICA karesinin pens kullanılarak tamamen daldırılabileceğinden emin olmak için jelatin çözeltisinin yeterli miktarda küçük bir behere dökün. Bir MICA karesini sıcak jelatin çözeltisine daldırın ve hemen geri çıkarın.

MICA'yı, ortam havasında gece boyunca kuruması için bir mikro santrifüj rafına yaslayarak bir kağıt havlu üzerine kenarı üzerine yerleştirin. Jelatin kaplı MICA en az iki hafta boyunca kullanılabilir. Eğer jelatin kaplı MICA birkaç hafta boyunca kullanılmayacaksa.

Kapalı bir Petri kabı içindeki filtre kağıdına yerleştirin ve oda sıcaklığında saklayın. Fazla jelatin çözeltisi buzdolabında saklanabilir ve stok çözelti basitçe 60 ile 70 °C arasına kadar yeniden ısıtılarak yaklaşık bir ay boyunca kullanılabilir. Yeniden ısıtma sırasında jelatinin kaynamamasına dikkat edilmelidir.

Bakterileri jelatin kaplı MICA üzerine yerleştirmeden önce, bakteri konsantrasyonunun yeterli olduğundan emin olun. Bakteri örneğinin 600 nanometredeki optik yoğunluk değerini belirlemek için bir spektrofotometre kullanın. 0.5 ile 1 arası bir OD değeri optimaldir.

Ardından, kültürden bir mililitreyi bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve çökelme sağlamak için santrifüjleyin. Süpernatanı uzaklaştırmak için bir pipet kullanın, ardından peleti bir mililitre filtrelenmiş deiyonize su veya tampon ile yıkayın. Resüspansiyon için pipetle nazikçe yukarı-aşağı çekme işlemi yapın.

Pelleti santrifüjle toplayın ve ardından pelleti hızla yeniden süspanse edin. Bakteriyel süspansiyon, FM görüntüleme için yeterli hücre konsantrasyonuna sahip olmak adına 500 µL nanopure deiyonize su içerisinde gözle görülür şekilde bulanık olmalıdır.

Ozmotik şok bir endişe kaynağıysa, görüntüleme çözeltisine 0,25 molar sakkaroz eklenebilir. Ben bu bakterileri su içinde yeniden süspanse ettim ancak diğer sıvıları denemekten çekinmeyin. Örneğin, bunu %0,25 sakkaroz ile gerçekleştirdik; bu nedenle diğer sıvıları deneyerek bunların da işe yarayıp yaramayacağını görün.

Her bir örnek için iki lam hazırlayın. Bir mikro pipet kullanarak, jelatin kaplı yüzeye 10 ila 20 µL hücre süspansiyonu ekleyin. Ardından, FM görüntüleme için yeterli bir kapsama alanı sağlamak amacıyla, damlacığı X ve Y yönlerinde yaymak için bir mikro pipet ucunu kullanın.

Pipet ucuyla jelatin yüzeyine fiziksel olarak temas etmemeye dikkat ederek, örneği oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, su akıntısıyla durulayın ve örneğin kenarını bir kağıt havluya veya filtre kağıdına değdirerek fazla sıvıyı uzaklaştırın. Lamlardan birini azot gazı püskürterek hızlıca kurutun.

Ardından lamı görsel olarak inceleyin. Opak bir leke, bakterilerin yıkama adımında uzaklaştırılmadığını gösterir. Görüntüleme için kullanılacak olan diğer lamın kurumasına izin verilmemelidir.

Numuneyi AFM ıslak tablasına yerleştirin ve klipsler yardımıyla sabitleyin, ardından bir mikro pipet kullanarak ıslak tablaya su ekleyin. Sıvı ortamda görüntüleme yapmadan önce atomik kuvvet mikroskobunu hazırlamak faydalıdır. Sıvı ortamda görüntüleme için uygun olan kantileverin AFM'ye yerleştirildiğinden ve lazerle hizalandığından emin olun.

100 mikronluk tarama kafası ve 0.01 ile 0.1 nano newton per nanometer arasında nominal yay sabitlerine sahip vico silikon nitrür problarla donatılmış bir pico plus atomik kuvvet mikroskobu kullanarak atomik kuvvet mikroskopi ile görüntülemeye geçin. Mikroskop hazırlandıktan sonra, FM tarayıcıyı ve tablasını mikroskoba yerleştirin. Görüntüleme hızı olarak tipik olarak saniyede 0.5 satırdan başlayıp saniyede bir satıra kadar çıkıyoruz ve çözünürlük satır başına 128 veri noktasından 512'ye kadar ayarlanır.

Cihazı, satır başına 128 ila 512 piksel kullanacak şekilde görüntüleme için ayarlayın. Saniyede 0,5 ila bir satır tarama hızıyla tarama yapın. Ardından, gerekirse, optimize edilmiş görüntüler elde etmek için A FM üzerindeki set noktasını ve kazançları ayarlayın.

Son olarak, görüntüleri toplayın. E coli bakterileri, bu videoda açıklandığı gibi jelatin kaplı MICA üzerine yerleştirilmiş ve ardından 0,005 molar PVS içerisinde görüntülenmiştir. Bu yöntem kullanılarak.

Toplanan görüntüde scepter'lar net bir şekilde görülmektedir ve hücre yüzeyleri, dehidrasyon belirtisi göstermeksizin düzgündür. Buna karşılık, burada gösterildiği gibi aynı e coli'den havada alınan görüntüler, genellikle sıvıda görülmeyen yapıları ortaya koyar. Bu durumda hücreler, dehidrasyon nedeniyle halka benzeri bir görünüm sergiler ve FIA gibi bakteriyel ek yapılar görülebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, sıvı ortamda FM görüntülemesi için bakteriyel örneklerin nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Gelatin kaplı mikro yüzeyler önceden hazırlanmışsa, bu teknik uzmanlaşıldığında yaklaşık bir saat içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü uygularken, doğru gelatinin seçilmesi ve prosedür boyunca uygun bakteri konsantrasyonunun sağlanması önemlidir.

Bakteriyel yüzeylerdeki kuvvet ölçümlerini sürdürmek için FN kantilevin bir kuvvet algılama aracı olarak kullanılması gibi diğer ölçümler de gerçekleştirilebilir. Ayrıca, etkileşim kuvvetlerini tanımlamak ve ölçmek amacıyla, bakteriyel yüzeydeki spesifik hedeflerle etkileşime girmesi için A FM ucuna spesifik prob molekülleri bağlanabilir. Genel bir not olarak, patojenik bakterilerle çalışıyorsanız, bu yöntemi uygularken her zaman gerekli önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.