Name: Atomik Kuvvet Mikroskopi Görüntüleme Bakteriyel İmmobilizasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Öğrenin bakterileri jelatin kaplı mika üzerinde immobilize ederek atomik kuvvet mikroskobisi ile sıvı ortamda canlı görüntüleme yöntemini. Bu teknik Gram-pozitif ve Gram-negatif bakterilerin yüksek çözünürlüklü analizi için güvenilir bir protokol sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, Biyolojik ve Çevresel Araştırma Dairesi, ABD Enerji Bakanlığı ve hibe finansmanı Virginia Commonwealth Sağlık Araştırma Kurulu tarafından desteklenmektedir. Oak Ridge Ulusal Laboratuvarı&#39;nda, Sözleşme No: DE-AC05-00OR22725 altında ABD Enerji Bakanlığı için UT-Battelle, LLC tarafından yönetilmektedir.

1. Mika hazırlanması: <ol><li> AFM mikroskobu (yaklaşık 22 × 30 mm) uyum için gerekli boyut makas ile mika (Elektron Mikroskobu Bilimleri) kesin. </li><li> Cleave, her iki tarafta mika, genellikle bant kullanarak, dış katmanı kaldırmak için sadece yumuşak kesintisiz katmanları kalmayıncaya kadar. </li></ol> 2. Jelatin solüsyonu hazırlanması: <ol><li> Bir laboratuvar şişesi 100 ml distile su ekleyin. </li><li> Mikrodalga şişe su kaynamaya başlayana kadar ısıtın. (Mikrodalga mevcut değilse, sıcak bir plaka üzerinde bir beher su ısıtılır.) </li><li> 0.5 gram jelatin (Sigma G-6144, G-2625 ya da G-2500) tartılır ve sıcak distile su ekleyin. </li><li> Yavaşça girdap jelatin kadar şişe tamamen çözülür. </li><li> 60-70 ° C'ye kadar jelatin solüsyonu soğutun </li><li> Kesim bölünmüş mika batırılmış olabilir içine küçük bir beher (20 ml) yaklaşık 15 ml dökün. </li></ol> 3. Mika kaplama: <ol><li> Batmak mika ısıtılmış jelatin çözüm içine kareler ve mika (Şekil 1a) kaplı olduğu gibi hızlı çekilme. </li><li> Kaplama sonra, (Şekil 1b), havadaki kuru bir kağıt havlu üzerine, kenarında, hemen mika destek. Jelatin kaplı mika, en az 2 hafta süreyle kullanılabilir. Aşırı jelatin solüsyonu buzdolabında saklanmalı ve sadece 60-70 ° C arasında stok solüsyonu tekrar ısıtmayı tarafından yaklaşık bir ay için kullanılan Jelatin yeniden ısıtırken sırasında haşlanmış olmadığından emin olmak için alınmalıdır. </li></ol> 4. Jelatin kaplı mika bakteri Montaj: <ol><li> Pelet bakteri kültürü 1 ml (0.5 - 1.0 OD 600 nm) 800 4500 RCF. Bakteri bağlı olarak, minimum RCF pelet ~ 5 dakika içinde hücreler </li><li> Filtreli deiyonize su ya da tampon aynı hacimde pelet yıkayın. </li><li> Santrifüj yoluyla hücreler tekrar toplayın. </li><li> Nanopure deiyonize su ya da tampon 500 mcL derhal pelletini tekrar. (Bakteriyel süspansiyon AFM görüntüleme için hücrelerin yeterli bir konsantrasyon elde etmek için gözle görülür bir şekilde bulanık olması gerekir.) </li><li> Bir pipet ucu (Şekil 1c) kullanarak yüzey üzerinde jelatin kaplı mika ve yayılması için hücre süspansiyonu (10-20 mcL) uygulayın. Bakım bakteriyel bir çözüm uygulayarak veya yayarken fiziksel pipet ile jelatin yüzeyine dokunmayın değil alınmalıdır. </li><li> İzin yüzeyi, 10 dakika dinlenme ve su ya da tampon (Şekil 1 cd) bir dere ile durulayın. Prosedürü boyunca, örnek kurumasına izin olmadığından emin olmak için özen gösterin. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Şekil 2, jelatin kaplı mika üzerine monte edilmiş ve AFM tarafından görüntülendi bakteri hücreleri örnek görüntüleri gösterir. Bizim laboratuvarlarımızda, örnekler, genellikle 100 mm tarama kafası ile donatılmış bir PicoPlus atomik kuvvet mikroskobu (Agilent Technologies, Tapınağı, AZ) kullanarak görüntülü. Cihaz bir tarama 0.5-1.0 satır / s hızda, line-scan başına 128-512 piksel işletilmektedir Tipik olarak kullanılan konsol Veeco 0.01 'den 0.1 nN / nm arasında değişen nominal yay sabitleri ile silisyum nitrür probları (MLCT-AUHW Veeco, Santa Barbara, CA). <img src="/files/ftp_upload/2880/2880fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1: 60-70 ° C 20 ml beher yerleştirilen bir sıcaklık az jelatin . Bir cımbız kullanarak taze mika kareler tamamen jelatin (a) çekilmiş ve bir mikro santrifüj raf (b) yaslanmış bir kağıt havlu üzerine dik olarak yerleştirilen içine dalmış olan bölünmüş. Bakteriyel örnek bir damlacık X ve Y yönlerinde (c) hem de bir pipetlemeyin ucu ile mika ve yayılması üzerine yerleştirilir. Örnek mika yüzey üzerinde en az 10 dakika süreyle inkübe izin sonra distile su akışı örnek durulayın. Immobilizasyon çalıştı Eğer, (d) sağ panelinde görüldüğü gibi mika opak bir yerde görmek mümkün olacak. Immobilizasyon işe yaramadıysa sol paneldeki gibi net bir mika parçası alacak. Damlacık bakteri konsantrasyonu mika ölçeklerde opak nokta jelatin işlenmiş mika yerinde. <img src="/files/ftp_upload/2880/2880fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 E. AFM görüntüleri coli. Panel (a), hücreler, jelatin kaplı mika üzerine monte edilir ve görüntülü olarak 0.005 M PBS. Karşılaştırma için, jelatin kaplı mika üzerine monte edilmiş ve hava görüntülü bakteri hücrelerinin bir görüntü paneli (b) 'de gösterilmiştir. Septa pili (inset panel (b)) varlığı ile gösterildiği gibi sıvı, daha fazla çözünürlük, toplanan görüntü açıkça görülebilir hava elde edilebilir. Rağmen

<ol><li>Bernal, R., Pullarkat, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of axons.</a> Phys Rev Lett. 99, 018301-018301 (2007).</li>
<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Dev Biol. 102, 379-389 (1984).</li>
<li>Chetta, J., Kye, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+dynamics+in+response+to+tensile+loading+of+mammalian+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal dynamics in response to tensile loading of mammalian axons.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 67, 650-665 (2010).</li>
<li>Dennerll, T. J., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytomechanics+of+axonal+elongation+and+retraction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cytomechanics of axonal elongation and retraction.</a> J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).</li>
<li>Fu, S. Y., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+and+molecular+basis+of+peripheral+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration.</a> Mol Neurobiol. 14, 1-2 (1997).</li>
<li>Gray, C., Hukkanen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+neural+growth%3A+calcitonin+gene-related+peptide+and+substance+P-+containing+nerves+attain+exceptional+growth+rates+in+regenerating+deer+antler%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P- containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler.</a> Neuroscience. 50, 953-963 (1992).</li>
<li>Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tension+as+a+regulator+and+integrator+of+axonal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Tension as a regulator and integrator of axonal growth.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 17, 6-10 (1990).</li>
<li>Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tension+as+a+regulator+of+axonal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Mechanical tension as a regulator of axonal development.</a> Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytomechanics+of+axonal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Cytomechanics of axonal development.</a> Cell Biochem Biophys. 27, 135-155 (1995).</li>
<li>Iwata, A., Browne, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+survival+and+outgrowth+of+mechanically+engineered+nervous+tissue+constructs+implanted+into+spinal+cord+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Long-term survival and outgrowth of mechanically engineered nervous tissue constructs implanted into spinal cord lesions.</a> Tissue Eng. 12, 101-110 (2006).</li>
<li>Lamoureux, P., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+elongation+within+and+along+the+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Growth and elongation within and along the axon.</a> Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).</li>
<li>Lamoureux, P., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytomechanical+investigation+of+neurite+growth+on+different+culture+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A cytomechanical investigation of neurite growth on different culture surfaces.</a> J Cell Biol. 118, 655-661 (1992).</li>
<li>Lindqvist, N., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+glial+%28Muller%29+cells%3A+sensing+and+responding+to+tissue+stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinal glial (Muller) cells: sensing and responding to tissue stretch.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1683-1690 (2010).</li>
<li>Loverde, J. R., Ozoka, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Axon+Stretch+Growth+in+Embryonic+and+Adult+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Axon Stretch Growth in Embryonic and Adult Neurons.</a> J. Neurotrauma. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Lu, Y. B., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+properties+of+individual+glial+cells+and+neurons+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17759-17764 (2006).</li>
<li>O'Toole, M., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physical+model+of+axonal+elongation%3A+force%2C+viscosity%2C+and+adhesions+govern+the+mode+of+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth.</a> Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).</li>
<li>Pfister, B. J., Bonislawski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch-grown+axons+retain+the+ability+to+transmit+active+electrical+signals%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Stretch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals.</a> FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).</li>
<li>Pfister, B. J., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+Engineering+Strategies+for+Peripheral+Nerve+Repair%3A+Surgical+Applications%2C+State+of+the+Art%2C+and+Future+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Biomedical Engineering Strategies for Peripheral Nerve Repair: Surgical Applications, State of the Art, and Future Challenges.</a> Crit Rev Biomed Eng. 39, 81-124 (2011).</li>
<li>Pfister, B. J., Iwata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+stretch+growth+of+integrated+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extreme stretch growth of integrated axons.</a> J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).</li>
<li>Pfister, B. J., Iwata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+transplantable+nervous+tissue+constructs+comprised+of+stretch-grown+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons.</a> J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).</li>
<li>Siechen, S., Yang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tension+contributes+to+clustering+of+neurotransmitter+vesicles+at+presynaptic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mechanical tension contributes to clustering of neurotransmitter vesicles at presynaptic terminals.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12611-12616 (2009).</li>
<li>Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch+growth+of+integrated+axon+tracts%3A+extremes+and+exploitations%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Stretch growth of integrated axon tracts: extremes and exploitations.</a> Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).</li>
<li>Smith, D. H., Wolf, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+strategy+to+produce+sustained+growth+of+central+nervous+system+axons%3A+continuous+mechanical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">A new strategy to produce sustained growth of central nervous system axons: continuous mechanical tension.</a> Tissue Eng. 7, 131-139 (2001).</li>
<li>Weiss, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+patterns%3A+The+mechanics+of+nerve+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Growth%2C+Third+Growth+Symposium%22%5BJournal%5D)">Nerve patterns: The mechanics of nerve growth.</a> Growth, Third Growth Symposium. 5, 163-203 (1941).</li>
<li>Zheng, J., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensile+regulation+of+axonal+elongation+and+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tensile regulation of axonal elongation and initiation.</a> J Neurosci. 11, 1117-1125 (1991).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Çeşitli faktörler AFM tarafından mikrobiyal montaj hücre ve görüntüleme etkileyebilir. Mika kaplama için kullanılan jelatin önemlidir. Ticari jelatin, balık, inek, ve domuz da dahil olmak üzere bir dizi omurgalıların izole edilmiştir. Kökeni ve işleme yöntemi Her iki bakteri immobilizasyon için jelatin uygunluğunu belirler. Sayısız kaynakları ve türleri jelatin hareketsizleştirir bakteri onların etkinliği değerlendirilmiştir [1]. Sigma G-6144, G-2625 için en etkili jelatin bulundu. Domuz (domuz) türetilen bu jelatin, sı...

<table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Jelâtin </td><td> Sigma, St Louis, MO </td><td> G6144, G2625 ve G2500 </td></tr><tr><td> PicoPlus Atomik Kuvvet Mikroskobu </td><td> Agilent Technologies, Tempe, AZ </td><td></td></tr><tr><td> AFM Çıkma </td><td> Veeco, Santa Barbara, CA </td><td> MLCT-AUHW </td></tr></tbody></table>

atomik kuvvet mikroskopi görüntüleme bakteriyel İmmobilizasyon

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM görüntüleme aracı mekanik problar bir yüzey, yüksek çözünürlüklü (nm ölçekli). Numunenin kimyasal tedavi etmek gerek kalmadan, sıvı bir ortamda, görüntü hücreleri ve biyomoleküllerin yeteneği vardır. Bu amacı gerçekleştirmek için, örnek tarama AFM konsol ucu tarafından uygulanan kuvvetler tarafından kaldırılmasını engellemek için yeterli montaj yüzeyine uygun olmalıdır. Birçok durumda, başarılı görüntüleme için örnek montaj yüzeyine immobilizasyonu bağlıdır. Optimal, immobilizasyon minimal invaziv metabolik süreçleri ve fonksiyonel özellikleri tehlikeye böyle örnek olmalıdır. Domuz (domuz) jelatin kaplama taze bölünmüş mika yüzeyleri, negatif yüklü bakterilerin yüzeye immobilize ve sıvı AFM tarafından görüntülenmiş. Jelatin kaplı mika bakteri hücrelerinin immobilizasyonu negatif yüklü bakteri ve pozitif yüklü jelatin arasında elektrostatik etkileşim nedeniyle büyük olasılıkla. Çeşitli faktörler, kimyasal bileşenler bakteri asılı olduğu, sıvı, bakteri görüntülü hangi bakteri suşu ve orta jelatin kaplı mika, yüzey özellikleri bakteri inkübasyon süresi de dahil olmak üzere bakteriyel immobilizasyon, müdahale edebilirsiniz. Genel olarak, jelatin kaplı mika kullanımı genellikle görüntüleme mikrobiyal hücreler için geçerli olmak üzere bulunur.

Canlı Gram-negatif ve Gram-pozitif bakterilerin jelatin kaplı mika üzerinde hareketsiz ve Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) kullanarak sıvı görüntülü olabilir.

Atomik Kuvvet Mikroskopi Görüntüleme Bakteriyel İmmobilizasyon

AFM, bir yüzeyi mekanik olarak tarayan yüksek çözünürlüklü (nm ölçekli) bir görüntüleme aracıdır. Hücrelerin ve biyomoleküllerin sıvı ortamda görüntülenmesini sağlama yeteneğine sahiptir...

Atomik kuvvet mikroskobu veya AFM, numuneyi kimyasal olarak işleme gerek kalmadan yüksek çözünürlüklü görüntüler oluşturmak için yüzeyin mekanik olarak taranmasını kullanır. Bu videoda, bakteriler jelatin kaplı mika üzerine immobilize edilir ve bir AFM tarafından sıvı ortamda görüntülenir. Öncelikle MICA kareleri, AFM mikroskop platformuna uygun boyutlarda kesilir. MIKA'nın üst tabakası çıkarılır ve mika kareler jelatin ile kaplanır.Ardından, jelatin kaplı mika üzerine bir damla bakteri süspansiyonu yerleştirilir ve yayılır. Pipet ucu kullanılarak, örnekler 10 dakika boyunca inkübe edilir. Daha sonra, bağlanmamış bakteriler yüzeyden yıkanarak uzaklaştırılır.Numune A FM ıslak hücreye yerleştirilir ve canlı bakterilerin yüksek çözünürlüklü görüntülerini elde etmek için görüntüleme yapılır. Bu tekniğin ISO gözenekli filtre immobilizasyonu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, hem çubuk şekilli hem de küresel bakterilerin güvenilir bir şekilde immobilize edilebilmesidir. Ayrıca, hücre yüzeyinin daha büyük bir kısmı A FM probu için erişilebilirdir.Atomik kuvvet mikroskobunun diğer mikroskobik yöntemlere göre temel bir avantajı, tek hücre çalışmaları yapılabildiği için hücre morfolojisi, septum oluşumu ve sitokinezi üzerine incelemeler yürütülebilmesidir. Bu yöntemde yeni olan kişiler, bakterileri sabitlediği kanıtlanmamış jelatinler kullandıkları veya bileşenlerin bakterilerin jelatin yüzeyine yapışmasıyla rekabet edeceği kompleks ortamlarda büyütülmüş bakteriler kullandıkları için zorluk yaşayabilirler. Bu yöntemle ilgili ilk fikri, bakterilerin immobilize edildiği 1970'lerdeki deneylerden aldık.Işık mikroskobu ve otoradyografi kullanan deneyler için jelatin kaplı cam lamlar. Bu demonstrasyonda, canlı gram-negatif bakteriler bir AFM görüntülemesi için immobilize edilmektedir, ancak yöntem gram-pozitif bakteriler için de uygulanabilir. MICA'yı hazırlamak için, önce AFM mikroskop tablasına uyması ve AFM ıslak hücreye yerleşebilmesi için makasla kesin.Ardından, MICA yüzeyine şeffaf bant yapıştırın ve bandı kaldırarak kesilmiş parçanın dış katmanını soyun. Sadece pürüzsüz ve bozulmamış katmanlar kalana kadar her iki taraftan dış katmanları çıkarmaya devam edin. Jelatin çözeltisini hazırlamak için, bir laboratuvar şişesine 100 milliliters saf su ekleyin ve mikrodalga fırında ısıtın.Su kaynamaya başladığında mikrodalgadan çıkarın, 0.5 gram jelatin ekleyin ve jelatin çözünene kadar şişeyi hafifçe sallayarak şişirin. Sığır jelatinlerinin bu prosedür için uygun olmadığını unutmayın. Domuz jelatinlerinin kullanılması önerilir.Şişeyi tezgah üzerine yerleştirin ve 60 ila 70 °C'ye kadar soğumasını bekleyin. Ardından, bir MICA karesinin pens kullanılarak tamamen daldırılabileceğinden emin olmak için jelatin çözeltisinin yeterli miktarda küçük bir behere dökün. Bir MICA karesini sıcak jelatin çözeltisine daldırın ve hemen geri çıkarın.MICA'yı, ortam havasında gece boyunca kuruması için bir mikro santrifüj rafına yaslayarak bir kağıt havlu üzerine kenarı üzerine yerleştirin. Jelatin kaplı MICA en az iki hafta boyunca kullanılabilir. Eğer jelatin kaplı MICA birkaç hafta boyunca kullanılmayacaksa.Kapalı bir Petri kabı içindeki filtre kağıdına yerleştirin ve oda sıcaklığında saklayın. Fazla jelatin çözeltisi buzdolabında saklanabilir ve stok çözelti basitçe 60 ile 70 °C arasına kadar yeniden ısıtılarak yaklaşık bir ay boyunca kullanılabilir. Yeniden ısıtma sırasında jelatinin kaynamamasına dikkat edilmelidir.Bakterileri jelatin kaplı MICA üzerine yerleştirmeden önce, bakteri konsantrasyonunun yeterli olduğundan emin olun. Bakteri örneğinin 600 nanometredeki optik yoğunluk değerini belirlemek için bir spektrofotometre kullanın. 0.5 ile 1 arası bir OD değeri optimaldir.Ardından, kültürden bir mililitreyi bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve çökelme sağlamak için santrifüjleyin. Süpernatanı uzaklaştırmak için bir pipet kullanın, ardından peleti bir mililitre filtrelenmiş deiyonize su veya tampon ile yıkayın. Resüspansiyon için pipetle nazikçe yukarı-aşağı çekme işlemi yapın.Pelleti santrifüjle toplayın ve ardından pelleti hızla yeniden süspanse edin. Bakteriyel süspansiyon, FM görüntüleme için yeterli hücre konsantrasyonuna sahip olmak adına 500 µL nanopure deiyonize su içerisinde gözle görülür şekilde bulanık olmalıdır.Ozmotik şok bir endişe kaynağıysa, görüntüleme çözeltisine 0,25 molar sakkaroz eklenebilir. Ben bu bakterileri su içinde yeniden süspanse ettim ancak diğer sıvıları denemekten çekinmeyin. Örneğin, bunu %0,25 sakkaroz ile gerçekleştirdik; bu nedenle diğer sıvıları deneyerek bunların da işe yarayıp yaramayacağını görün.Her bir örnek için iki lam hazırlayın. Bir mikro pipet kullanarak, jelatin kaplı yüzeye 10 ila 20 µL hücre süspansiyonu ekleyin. Ardından, FM görüntüleme için yeterli bir kapsama alanı sağlamak amacıyla, damlacığı X ve Y yönlerinde yaymak için bir mikro pipet ucunu kullanın.Pipet ucuyla jelatin yüzeyine fiziksel olarak temas etmemeye dikkat ederek, örneği oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, su akıntısıyla durulayın ve örneğin kenarını bir kağıt havluya veya filtre kağıdına değdirerek fazla sıvıyı uzaklaştırın. Lamlardan birini azot gazı püskürterek hızlıca kurutun.Ardından lamı görsel olarak inceleyin. Opak bir leke, bakterilerin yıkama adımında uzaklaştırılmadığını gösterir. Görüntüleme için kullanılacak olan diğer lamın kurumasına izin verilmemelidir.Numuneyi AFM ıslak tablasına yerleştirin ve klipsler yardımıyla sabitleyin, ardından bir mikro pipet kullanarak ıslak tablaya su ekleyin. Sıvı ortamda görüntüleme yapmadan önce atomik kuvvet mikroskobunu hazırlamak faydalıdır. Sıvı ortamda görüntüleme için uygun olan kantileverin AFM'ye yerleştirildiğinden ve lazerle hizalandığından emin olun.100 mikronluk tarama kafası ve 0.01 ile 0.1 nano newton per nanometer arasında nominal yay sabitlerine sahip vico silikon nitrür problarla donatılmış bir pico plus atomik kuvvet mikroskobu kullanarak atomik kuvvet mikroskopi ile görüntülemeye geçin. Mikroskop hazırlandıktan sonra, FM tarayıcıyı ve tablasını mikroskoba yerleştirin. Görüntüleme hızı olarak tipik olarak saniyede 0.5 satırdan başlayıp saniyede bir satıra kadar çıkıyoruz ve çözünürlük satır başına 128 veri noktasından 512'ye kadar ayarlanır.Cihazı, satır başına 128 ila 512 piksel kullanacak şekilde görüntüleme için ayarlayın. Saniyede 0,5 ila bir satır tarama hızıyla tarama yapın. Ardından, gerekirse, optimize edilmiş görüntüler elde etmek için A FM üzerindeki set noktasını ve kazançları ayarlayın.Son olarak, görüntüleri toplayın. E coli bakterileri, bu videoda açıklandığı gibi jelatin kaplı MICA üzerine yerleştirilmiş ve ardından 0,005 molar PVS içerisinde görüntülenmiştir. Bu yöntem kullanılarak.Toplanan görüntüde scepter'lar net bir şekilde görülmektedir ve hücre yüzeyleri, dehidrasyon belirtisi göstermeksizin düzgündür. Buna karşılık, burada gösterildiği gibi aynı e coli'den havada alınan görüntüler, genellikle sıvıda görülmeyen yapıları ortaya koyar. Bu durumda hücreler, dehidrasyon nedeniyle halka benzeri bir görünüm sergiler ve FIA gibi bakteriyel ek yapılar görülebilir.Bu videoyu izledikten sonra, sıvı ortamda FM görüntülemesi için bakteriyel örneklerin nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Gelatin kaplı mikro yüzeyler önceden hazırlanmışsa, bu teknik uzmanlaşıldığında yaklaşık bir saat içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü uygularken, doğru gelatinin seçilmesi ve prosedür boyunca uygun bakteri konsantrasyonunun sağlanması önemlidir.Bakteriyel yüzeylerdeki kuvvet ölçümlerini sürdürmek için FN kantilevin bir kuvvet algılama aracı olarak kullanılması gibi diğer ölçümler de gerçekleştirilebilir. Ayrıca, etkileşim kuvvetlerini tanımlamak ve ölçmek amacıyla, bakteriyel yüzeydeki spesifik hedeflerle etkileşime girmesi için A FM ucuna spesifik prob molekülleri bağlanabilir. Genel bir not olarak, patojenik bakterilerle çalışıyorsanız, bu yöntemi uygularken her zaman gerekli önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.

bacterial-immobilization-for-imaging-by-atomic-force-microscopy

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Plazmid DNA, sitoplazmik proteinleri ve DNA-protein kompleksleri görselleştirme dokunarak modu için bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM) yöntemi açıklanmıştır. Bu yöntem, biyokimyasal manipülasyon AFM görüntüleme örnekleri hazırlamak için alternatif yaklaşımlar içerir. Spesifik protein etkileşim bölgeleri içeren DNA yakın fizyolojik tampon koşulları görülmektedir.

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanılarak Rekombinant DNA ve Protein Kompleksleri Görselleştirme

Canlı hücrelerin içindeki dinamik proteinler hakkındaki uzay-zamansal bilgi, biyolojiyi anlamak için çok önemlidir. Hızlı 3D yapılı aydınlatma mikroskobu (f3D-SIM) adı verilen bir tür süper çözünürlüklü mikroskopi, bakterilerdeki sitokinetik Z halkası hakkında benzersiz bilgiler ortaya çıkarır: hem boncuk benzeri görünümü hem de halka içindeki FtsZ'nin hızlı dinamikleri.

Hızlı 3D-Yapılandırılmış Aydınlatma mikroskopi ile Canlı Bakteri Cytokinetic Z Yüzük Süper çözünürlük Görüntüleme (F3D-SIM)

Bu iletişim kuralı ile örneklenir bir heterobifunctional silane Bağlantı Aracısı atomik kuvvet mikroskobu dayalı tek molekül kuvvet spektroskopisi için tasarlanmış silikon-oksit yüzeyler için proteinlerin immobilizasyon kovalent açıklar RrgA etkileşim (pilus-1 İpucu adhesin, S. pneumoniae) fibronektin ile.

Proteinler kovalent immobilizasyon için tek molekül kuvvet spektroskopisi

Biz bir basit tekniğinde gen uzunluğunda DNA moleküllerinin immobilizasyon için boş hücre gen ifade deneyler biochips üzerinde gerçekleştirmek için kullanılan bir yüzey üzerinde açıklayınız.

Genlerin Multistep Strand deplasman litografi kullanarak işlevsel yüzey immobilizasyon

Biz immunolojik çalışmalar için tek bir T hücresi ve boncuk parçacık ile Atomic Force mikroskop (AFM) konsol functionalize bir protokol sunuyoruz. AFM tarafından tek çifti T hücreli dendritik hücre bağlayıcılığı araştırması ve makrofajların gerçek zamanlı hücresel tepkisi ile AFM tarafından floresans görüntüleme ile tek bir katı parçacığın izlenmesi için prosedürler gösterilmektedir.

Tek-T hücreleri veya tek parçacık Immünolojik tek hücreli kuvvet spektroskopisi ile Atomic Force mikroskop Cantilevers functionalization

Bu protokol, yüzlerce mikrobiyal hücre üzerinde AFM ölçümlerini otomatikleştirmeyi amaçlamaktadır. İlk olarak, mikroplar PDMS damga mikroyaplarına hareketsiz hale getirilir ve daha sonra yüzlerce hareketsiz hücre üzerinde kuvvet spektroskopisi ölçümleri otomatik olarak yapılır.

Yüzlerce C. albicans Hücresinde Biyo-Atomik Kuvvet Mikroskop Ölçümlerinin Otomasyonu

Atomik Kuvvet Mikroskopisi-Kızılötesi Spektroskopi (AFM-IR), bakteriyel çalışmalar için güçlü bir platform sağlayarak nano ölçekli çözünürlük elde etmeyi sağlar. Her ikisi de, hücre altı değişikliklerin haritalandırılması (örneğin, hücre bölünmesi üzerine) ve kimyasal bileşimin karşılaştırmalı çalışmaları (örneğin, ilaç direncinden kaynaklanan) bakterilerde tek bir hücre düzeyinde yapılabilir.

Atomik Kuvvet Mikroskopisi, Tek Bakteri Kimyasını Araştırmak için Bir Araç Olarak Kızılötesi Spektroskopi ile Birleştirildi

Burada, izole embriyonik zebra balığı hücrelerinin hücre içi mekanik özelliklerini optik bir tuzakla doğrudan kuvvet ölçümü ile üç boyutlu hapsetmede araştırmak için bir protokol sunuyoruz.

Optik Cımbız Kullanarak Hapsetmede Hücre Altı Mekaniğinin Doğrudan Kuvvet Ölçümleri

Bu çalışma, sitoplazmaya verilen manyetik mikroboncuklar yoluyla hücre çekirdeğine doğrudan mekanik kuvvet uygulamak ve eşzamanlı canlı hücre floresan görüntülemesi yapmak için yeni bir protokol sunmaktadır.

Çekirdek Mekanobiyolojisini Incelemek için 3D Manyetik Kuvvet Aktüatörü ve Çok Fonksiyonlu Floresan Görüntülemeyi Birleştirmek

Burada, atomik kuvvet mikroskobunun (AFM) bakteriyel karakterizasyonu için basit ve hızlı bir yöntem olarak uygulanmasını sunuyoruz ve bakteri boyutu ve şekli, bakteri kültürü biyofilmleri ve nanopartiküllerin bakterisitler olarak aktivitesi gibi ayrıntıları analiz ediyoruz.

Morfolojik Gözlem ve Bakteriyel Hücre Hasar Analizi için Hızlı Bir Teknik Olarak Temas Modu Atomik Kuvvet Mikroskobu

XY düzleminde filamentli siyanobakteriyel görselleştirme için basit ve erişilebilir bir yöntem sunuyoruz. Düşük erime noktalı bir agaroz matrisi kullanıldı ve bölünmede yer alan proteinlerin görüntülerinin dikey bir yönde elde edilmesine izin verildi. Bu nedenle, bu metodoloji herhangi bir filamentli organizmaya ve farklı protein türlerine uygulanabilir.

Filamentli Siyanobakterilerde Hızlandırılmış Mikroskopi Analizi için Dikey İmmobilizasyon Yöntemi

Öğrenin bakterileri jelatin kaplı mika üzerinde immobilize ederek atomik kuvvet mikroskobisi ile sıvı ortamda canlı görüntüleme yöntemini. Bu teknik Gram-pozitif ve Gram-negatif bakterilerin yüksek çözünürlüklü analizi için güvenilir bir protokol sunar.

Atomik Kuvvet Mikroskopi Görüntüleme Bakteriyel İmmobilizasyon

Daha fazla video keşfet