Vero Hücre Kültür Testi ile Alan toplanan Sivrisinekler Enfeksiyon Virüs Algılama

Bu prosedürün genel amacı, sahada toplanan sivrisineklerin Vero hücre kültürü testi ile viral enfeksiyon açısından taranmasıdır. İlk olarak, sahada toplanan sivrisinekler türlerine göre ayrılır. Ardından sivrisinekler, bir karıştırıcı değirmen kullanılarak homojenize edilir.

Sivrisinek homojenatları hazırlandıktan sonra, viral testlere hazırlık amacıyla Vero hücreleri kültüre edilir; ardından her bir Vero hücre kültürü, beş dakika boyunca çalkalayıcı üzerinde tutulan tek bir sivrisinek homojenatı ile inoküle edilir ve virüslerin çoğalmasına izin vermek için 37 °C'de inkübe edilir. Son olarak, kültürler virüs kaynaklı sitopatik etkilerin kanıtları açısından görsel olarak incelenir. Bu tekniğin R-T-P-C-R gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, sivrisineklerin hücre kültüründe büyüyebilen çok çeşitli viral ajanlar açısından taranmasına olanak tanımasıdır.

Bu yöntem, farklı sivrisinek türlerinin virüs iletimini desteklemedeki rolleri gibi tıbbi entomoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Aşağıdaki prosedür için biyogüvenlik seviyesi iki olan bir tesis kullanın. Canlı sivrisineklerin bulunduğu toplama torbasını, onları anestezi etmek için -20 °C'de 15 dakika boyunca bekletin.

Böcekler anestezi altına alındıktan sonra, torbayı kuru buz içeren yalıtımlı bir kaba aktarın ve tam nakavt sağlamak için sivrisinekleri bir ila üç dakika boyunca karbondioksite maruz bırakın. Ardından, sivrisinekleri kuru buz yatağı üzerindeki önceden soğutulmuş bir kaba yerleştirin. İnce uçlu pens kullanarak dişi böcekleri tanımlayın ve onları plastik porsiyon kaplarına aktarın.

Ağız parçaları ve antenler incelenerek dişiler erkeklerden ayırt edilebilir. Kapları kapatın ve ıslak buz üzerine yerleştirin. Elektronik bir soğutma tablasına monte edilmiş bir stereo diseksiyon mikroskobu ve taksonomik bir anahtar kullanın.

Her bir sivrisinek havuzunun türünü belirleyin; aynı türdeki sivrisinekleri, içinde bir bakır bilye bulunan, etiketli iki mililitrelik snap kapaklı tüplere yerleştirin. Tüpler doldukça, tek bir tüpte 50 bireye kadar havuzlama yapılabilir. Tüpleri, kuru buz üzerindeki bir strafor kutu içindeki etiketli torbalara yerleştirin.

Tüm sivrisinekler tanımlandıktan sonra, homojenizasyona kadar -80 °C'de saklanabilirler. Bu prosedür için biyogüvenlik seviyesi 3 bir tesis kullanın ve sınıf iki biyogüvenlik kabininde çalışın. Tüp başına yaklaşık 1 mL PBSG ekleyin ve sivrisinek içeren tüpleri önceden soğutulmuş bir mikser değirmen kasetinin içine yerleştirin.

Doldurulmuş kaseti bir mikser değirmene sabitleyin ve sivrisinek havuzlarını saniyede 25 döngü hızında dört dakika boyunca homojenleştirin. Sivrisinekler homojenleştirildikten sonra, tüpleri aerosol sızdırmaz soğutmalı bir mikro santrifüje aktarın ve santrifüjleyin. Sivrisinek homojenatını 7.000 RPM'de altı dakika boyunca santrifüjleyin.

Santrifüj işleminden sonra tüpler, virüs testine kadar -80 °C'de saklanabilir. Konfluen farrow hücreleri içeren T 1 75 flaskındaki kültür ortamını, çamaşır suyu içeren bir atık beheri içerisine boşaltın. Flaska 5 mL PBS ekleyin ve PBS'yi atık beherine boşaltmadan önce hücreleri eşit şekilde yıkayın.

Hücreleri yıkadıktan sonra, 2,5 mililitre tripsin EDTA ekleyin ve hücrelerin ayrılması için flaskı 37 °C ve %5 CO2'de beş dakika inkübe edin. Hücreler ayrıldığında, beş mililitre MEM ekleyin ve varsa topakları dağıtmak için hücreleri pipetle birkaç kez aşağı yukarı çekin. Ardından 15 mililitre daha MEM ekleyin.

40 adet T 25 flask'ı biyogüvenlik kabini içindeki iki raf üzerine yerleştirin ve flask kapaklarını çıkarıp her flask'ın hemen önüne koyun; steril bir pipet kullanarak her flask'a dört mililitre MEM ekleyin. Ardından 0,5 mililitre süspanse vary hücreleri ekleyin ve flaskların kapaklarını kapatın. Flaskları bir tepsi üzerine istifleyin ve besiyerinin flask tabanlarını homojen bir şekilde kapladığından emin olmak için nazikçe çalkalayın.

Kültürleri 37 °C'de ve %5 CO2 ortamında gece boyunca veya hücreler %80 ila %90 konfluense ulaşana kadar inkübe edin. İnkübatörden 20 adet küçük flask çıkarın ve bunları her bir sivrisinek havuzuna karşılık gelen erişim numaralarıyla etiketleyin. Her flasktaki besiyerinin çoğunu, hücre monotabakasını kaplayacak kadar besiyeri bırakarak atık kabına boşaltın.

Her bir sivrisinek homojenatından 100 µL süpernatantı ilgili şekilde etiketlenmiş erlene aktarın ve erlenlerin ağzını sıkıca kapatın. Süpernatantlar aktarıldıktan sonra, erlenleri 35 ile 40 RRP M değerine ayarlanmış bir çalkalayıcıya beş dakika boyunca yerleştirin. Erlenleri tekrar biyogüvenlik kabinine alın ve her birine dört mL büyüme besiyeri ekleyin.

Flaskların kapaklarını kapatın ve 37 °C'de, %5 CO2 ortamında üç ila yedi gün boyunca inkübe edin. Kültürler taramaya hazır olduğunda, önce medyayı görsel olarak inceleyin. Bulanık medya, viral kaynaklı sitopatik etkileri veya diğer mikroplarla kontaminasyonu ya da her ikisini birden gösterir; bulanık medya sergileyen kültürleri ters ışık mikroskobu altında inceleyin.

Virüsler tipik olarak hücrelerin deforme olmasına ve kültür balonlarından ayrılmasına neden olur. Bakteri, maya veya mantar kontaminasyonu tespit edilirse veya kültür yoğun sivrisinek kalıntıları içeriyorsa, orijinal sivrisinek havuzunu 0.22 mikronluk bir şırıngadan süzdükten sonra yeniden test edin. Diğer mikroorganizmalarla kontamine olmamış virüs pozitif kültürlerden bir ila iki mililitre medyumu, aseptik olarak filtreleyerek etiketli kriyotüplere aktarın.

Virüs içeren örnekleri, bu analizle uygun tanısal testler gerçekleştirilene kadar minus 80 degrees Celsius'ta saklayın. 1997'den 2010'a kadar süren sürekli bir eyalet çapındaki sürveyans döneminde Connecticut'ta toplanan sivrisineklerden, dört taksonomik aileye ait dokuz farklı virüs türü izole edilmiştir. Eastern equine encephalitis virus ve West Nile Virus dahil olmak üzere bu virüslerin bir kısmı insanlarda hastalığa yol açtığı bilinmektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, viral hücre kültürü testi ile viral enfeksiyon açısından sivrisineklerin nasıl ayrılacağı, işleneceği ve taranacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.