Name: Vero Hücre Kültür Testi ile Alan toplanan Sivrisinekler Enfeksiyon Virüs Algılama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Öğrenin, alandan toplanan sivrisineklerde viral enfeksiyonları Vero hücre kültürü testiyle taramayı. Bu yöntem, dört taksonomik aileden dokuz farklı virüsün tespitine olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz minnetle, Dr önemli katkılar kabul. John Anderson, Andrew Ana ve bu çalışmanın Shirley Tirrell. Bu çalışma Merkezleri Hastalık Kontrol ve Önleme (U50/CCU116806-01-1) ve ABD Tarım Bakanlığı (58-6615-1-218, CONH00768 ve CONH00773) hibe kısmen desteklenmiştir.

1. Sivrisinek sıralama ve kimlik <ol><li> Aşağıdaki prosedürler canlı sivrisinek ile çalışmak için eğitilmiş personel tarafından adanmış bir biyogüvenlik seviye-2 (BSL-2) laboratuar açık bir laboratuvar tezgahı üzerinde yapılmaktadır. &quot;Soğuk zincir&quot; prosedür boyunca korunur. </li><li> 5 dakika boyunca -20 ° C derin dondurucuda sivrisinek toplama torbası koyarak erişkin sivrisinek canlı anestezisi. Kuru buz içeren bir izolasyonlu konteyner Transfer toplama torbası. Kapağını kapatın ve knock-down tam emin olmak için 1-3 dakika boyunca karbon dioksit sivrisinek maruz. </li><li> Kuru buz bir yatağın üzerine yerleştirilen bir ön-soğutulmuş tavada üzerine anestezi sivrisinek dokunun. Plastik kısmı su bardağı ince forseps ve yerinde kullanarak birbirinden ayrı dişi sivrisinekler. Kapak ve ıslak buz üzerinde yer bardak ile kaplayın. </li><li> Stereo diseksiyon mikroskobu (10-60X zoom) yardımı ile dış sivrisinek morfolojisi dayalı açıklayıcı taksonomik tuşlarını kullanarak türlerin sivrisinek tanımlamak elektronik bir soğuk masaya monte edilebilir. </li><li> Bakır BB içeren 2 ml ek kapaklı şişeleri ≤ 50 bireylerin havuza sivrisinek türü tespit birleştirin. Şişeler, benzersiz bir tanımlayıcı ile etiketlenir. </li><li> Tüm sivrisinekler belirlenmesini takiben, şişeleri etiketli torbalara yerleştirilmiş ve kuru buz içeren plastik bir soğutucu düzenlenecek. </li><li> Sivrisinek havuzları virüs testi kadar -80 ° C derin dondurucuda saklayın. </li></ol> 2. Biyogüvenlik sivrisinek virüs izole etmek için düşünceler <ol><li> Aşağıdaki işlemleri 1 çevreleme bu seviyede çalışmak için eğitilmiş personel tarafından bir biyogüvenlik seviye-3 (BSL-3) laboratuvar yapılmaktadır. Laboratuvar olanakları, ekipman, prosedür ve uygulamaları, kurumsal, eyalet ve federal gözetim ve denetimine tabidir. Aşağıdaki protokoller denemeden önce uygun eğitim ve onay isteyin. </li><li> , Tek kullanımlık önlük, eldiven, yüz kalkanları ve solunum gibi her bir işlem için uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE) giyin. </li><li> Çalışma yüzeyleri tamamladıktan prosedürler öncesinde ve sonrasında% 70 alkol ile dezenfekte edin. </li><li> Sınıf II Biyogüvenlik kabini (BSC) hücre kültürleri ve potansiyel olarak bulaşıcı malzeme ele alınır. </li><li> Sivrisinek havuzları bir BSC içine yerleştirilen bir karıştırıcı değirmen homojenize. </li><li> Sivrisinek homojenatlarında sıkı bir aerosol mikrosantrifüj santrifüj. Bu yordamı BSC içinde gerçekleştirilir mümkün değilse işletme ve santrifüj örnekler alınırken, operatör bir maske takmalıdır. </li><li> Pipetler ve BSC (biyogüvenlik kabini) malzeme taşıma pipetlemeyin ipuçları önce otoklav% 10 çamaşır suyu ile ıslatılmış. Tüm laboratuar atık bertarafına kadar önce otoklavlanarak dekontamine. </li></ol> 3. Vero hücrelerinde hazırlanması <ol><li> Çamaşır suyu içeren atık behere konfluent Vero hücreleri (Klon E6) büyük bir doku kültürü balonuna (175 cm 2) Durusu kültür ortamı. </li><li> 5 ml PBS kısım ve hücre tabakası üzerinde ve tüm tek tabaka iyice karşılamak için emin olun balonun kenarları boyunca girdap ekleyerek Vero hücreleri yıkayın. </li><li> Durusu PBS atık behere. </li><li> 2,5 ml tripsin-EDTA ve tüm tek tabaka iyice karşılamak için emin olun hücre tabakası üzerinde girdap ekleyin. </li><li> 37 5 dakika boyunca inkübatörde balon ° C&#39;de,% 5 CO 2. </li><li> Alt yüzeyindeki hücreleri çıkarmak için yavaşça sallamak ve girdap şişesi. Hücreleri kolayca kaydırarak; hücreleri kolayca kaydırarak yoksa ek bir 1-5 dakika inkübe edin. </li><li> 5 Minimal Essential Medya mL (MEM),% 5 fetal sığır serumu (FBS), serolojik pipetlemeyin kullanarak ve pipetlemeyin ekle yukarı ve aşağı hücre kümeleri break up için 10-20 kez. </li><li> Toplam hacmi 22.5 mL için ek bir 15 mL MEM,% 5 FBS ekleyin ve iyice karıştırın. </li><li> 40 küçük doku kültürü şişeleri (25 cm 2) dik iki rafları (20 şişeler / raf) olarak yerleştirin. </li><li> Biyogüvenlik kabini içinde şişelerin bulunduğu raflara yerleştirin ve şişe kapakları önünde yerleştirerek, şişesi kapakları kaldırmak. </li><li> MEM,% 5 FBS serolojik pipetlemeyin kullanarak her balona 4 mL koyun. </li><li> Her balona (~ 01:06 bölme oranı) şişesi kapakları değiştirin 0.5 mL askıya hücreleri koyun. </li><li> Geri kalan hücre süspansiyonu (~ 2.5 mL) içeren orijinal büyük doku kültürü şişesi,% 5 FBS MEM, 50 ml ekleyin ve inkübatör şişeyi geri. Aynı büyük doku kültürü şişesi 5 pasajlar yeniden kullanılabilir ve daha sonra yeni bir balon değiştirmek için set-up olmalıdır. </li><li> Yığınlar halinde tepsiye yerleştirin küçük doku kültürü şişeleri. Medya düzgün flaks alt kapsadığını emin olmak için Swirl tepsi. </li><li> 37 kuvöz küçük şişeler ° C,% 5 CO 2 ve% 80-90 konfluent kadar bir gecede büyümek yerleştirin. </li></ol> 4. Sivrisinek havuzları hazırlanması <ol><li> Sivrisinek havuzları test işlemleri sırasında soğuk tutun. Önceden soğutulmuş kullanın.rafları ve dondurucu karıştırıcı değirmen kasetleri, buz reaktifler ve soğutmalı santrifüj sivrisinek havuzları işleme. </li><li> Yeri tüpler önceden soğutulmuş dondurucu raf sivrisinek içeren ve 1 - 1,5 ml PBS-G sivrisinekler, her tüp. </li><li> Dondurucu karıştırıcı değirmen kaset al. Sonra her kaset içine koyun ve 24 tüplü karıştırıcı değirmen güvenli. </li><li> 4 dakika 25 devir / saniye örnekleri homojenize. Mikser değirmen sivrisinek dokuyu bozan, yüksek hız ve her tüp içinde bir metal BB tüpler sallar. </li><li> 7,000 rpm hızında 6 dakika için borular santrifüjleyin. </li><li> Dondurucu raflar yerleştirmek tüpler Vero hücre içine inoküle kadar. </li></ol> 5. Sivrisinek havuzu homojenatlarında Vero hücreleri Aşılanması <ol><li> Yeterli confluency ve hücre sağlığını sağlamak için her bir serinin en az bir doku kültür şişelerinde inverted mikroskop altında kontrol edin;% 80-90 kapsama alanı hakkında bekliyoruz. </li><li> Hat kadar her sivrisinek havuzu karşılık gelen üyelik numaraları ile bir raf ve etiket şişeler 20 küçük doku kültürü şişeleri. </li><li> Kapaklar ve atık behere doku kültürü şişeleri medya süzün en gevşetin. Balonuna yeterli medya tamamen kat hücre tek tabaka bırakın. </li><li> Ilgili doku kültürü balona her işlenmiş sivrisinek havuzu süpernatant kısım 100μL. </li><li> Kültür şişesi kapağı yerine takın ve sıkın. </li><li> 35-40 rpm&#39;de 5 dakika (oda sıcaklığı) çalkalamalı kültür şişeler düz yatırın. </li><li> 20 doku kültürü şişeleri BSC bir raf ve yerinde dik pozisyona dönün. </li><li> Bir seferde 3 doku kültürü şişeleri Sır, serolojik bir pipet kullanarak her bir balona 4 mL büyüme ortamı dağıtmak; kapakları yerine. </li><li> Pipet ucu kültür şişelerinde boyun veya dudak temas etmediğinden emin olun. Temas şişesi ile yapılır, gerektiğinde pipet uçları değiştirin. </li><li> 37 inkübe doku kültürü şişeleri ° C,% 5 CO 2. </li></ol> 6. Vero hücreleri virüs büyüme Eleme <ol><li> Ekran, 3-7 gün sonrası aşılama, viral enfeksiyon belirtileri, sitopatik etki (CPE), doku kültürü şişeler inoküle. </li><li> Görme şişeler bükerek, CPE ve / veya kirlenme hücre kültürleri incelemek ve medya inceleyerek balonun altındaki havuzları. Hücrelerin CPE sırasında bozulabilir ya da büyüme, maya, mantar, veya bakteriyel kontaminasyon nedeniyle medya bulutlu görünecektir. </li><li> Ters bir mikroskop altında bulutlu medya sergi hücre kültürleri yeniden inceleyin. Virüsler hücreleri deforme olmaya ve kültür şişeler düşebileceği neden olacaktır. Görünür kirleticiler, örneğin maya, diğer bakteri, mantar ya da ağır sivrisinek enkaz, hücre kültürleri 0.22μM şırınga filtresi sayesinde orijinal sivrisinek havuzu geçerek yeniden test edilmektedir. </li><li> Aseptik serolojik bir pipet kullanarak etiketli cryotubes virüs pozitif hücre kültürleri medya 1-2 mL dağıtılıp. </li><li> Virüs kültürler -80 saklanan ° C uygun tanı testleri ile tespit kadar. </li></ol> 7. Reaktiflerin hazırlanması <ol><li> MEM,% 5 FBS. 4 L gg H 2 0 son bir hacmi 37.6 gr toz MEM eritin. Çözüm medya şişe ve otoklavda 500 ml alikotları içine koyun. Çözüm soğuduğunda, aseptik her bir şişe 26 ml ısı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu, 5.2 mL L-Glutamine, 5.2 ml anti-biotic/mycotic ve 10.4 ml% 7.5 sodyum bikarbonat ekleyin. 4 ° C saklayınız </li><li> PBS-G. 16 g NaCl, 0,4 g KCI, 2.3 g Na 2 HPO 4, 0.4 g KH 2 PO 4, ve% 0.5 fenol Red 4 ml, 1000 ml dd H 2 0 içine çözülür . 2 N NaOH (gerekirse) 7,1-7,4 pH ayarlayın. Ayrı bir beher, ısı 600 kaynamaya H 2 0 ml. Hot-plate çıkar, 10 gr jelatin ekleyin ve çözülür. PBS çözüm çözünmüş jelatin solüsyonu ekleyin ve 2 L dd H 2 O. ile son ses seviyesini ayarlamak 100 ml solüsyon şişeleri ve otoklav içine koyun. Çözüm soğuduğunda, aseptik olarak 42.8 mL ısı ile inaktive edilmiş tavşan serumu ve 1.4 mL anti-biotic/mycotic ekleyin. 4 ° C saklayınız </li><li> PBS hücre yıkayın. 400 mL gg H 2 O. 50 ml 10X Dulbecco&#39;nun PBS 2 N NaOH ile pH 7.1 &#39;e ayarlayın. Dd H 2 O. ile 500 mL son ses seviyesini ayarlayın 0.2uM vakum filtre ünitesi ile filtre çözüm. 5 ml alikotları 8 ml vidalı kapaklı tüpler içine koyun. 4 ° C saklayınız </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar 4 taksonomik ailelerden gelen virüslerin Dokuz farklı 1997-2010 (Tablo 1) Connecticut eyalet çapında sürekli gözetim sırasında toplanan sivrisinekler kurtarıldı. Bu virüsler Beş insan hastalığı, Batı Nil virüsü ve doğu at ensefaliti virüsü olan en önemli patojenlerin neden olduğu bilinmektedir. Yeni keşifler toplanan sivrisinekler WNV ilk izolasyonKuzey Amerika, 1999 2 2005 4 2000 3 kuzeydoğu ABD&#39;de Potosi virüsün ilk izolasyon, ve New England&#39;da La Crosse virüsünün ilk izolasyon. <table border="1"><tbody><tr><td> Virüs </td><td> Aile </td><td> No izole </td><td> No yerlerde </td><td> No yıl denetliyor </td><td> Insan hastalığı </td><td> Refs. </td></tr><tr><td> Batı Nil virüsü </td><td> Flaviviridae </td><td> 1.002 </td><td> 94 </td><td> 12 </td><td> Orta şiddetli, ateş, ensefalit </td><td> 2,5 </td></tr><tr><td> Doğu at ensefaliti virüsü </td><td> Togaviridae </td><td> 292 </td><td> 41 </td><td> 10 </td><td> Şiddetli, ensefalit </td><td> 6,7 </td></tr><tr><td> Highlands J virüsü </td><td> Togaviridae </td><td> 178 </td><td> 39 </td><td> 11 </td><td> Bilinmiyor </td><td> 6 </td></tr><tr><td> Jamestown Kanyon virüsü </td><td> Bunyaviridae </td><td> 305 </td><td> 74 </td><td> 14 </td><td> Hafif ve orta şiddette, ateş, menenjit </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Potosi virüs </td><td> Bunyaviridae </td><td> 259 </td><td> 76 </td><td> 4 </td><td> Bilinmiyor </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Cache Valley virüs </td><td> Bunyaviridae </td><td> 114 </td><td> 51 </td><td> 8 </td><td> Iki belgelenmiş durumda şiddetli, ateş, nörolojik hastalık Hafif </td><td></td></tr><tr><td> Trivittatus virüs </td><td> Bunyaviridae </td><td> 83 </td><td> 21 </td><td> 11 </td><td> Bilinmiyor </td><td></td></tr><tr><td> La Crosse virüsü </td><td> Bunyaviridae </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> Orta şiddetli, ensefalit </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Flanders virüs </td><td> Rhabdoviridae </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 2 </td><td> Bilinmiyor </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1. Virüsler Vero hücre kültürü yöntemi ile alanında toplanan sivrisinekler algılandı. Sivrisinekler 1997-2010 Connecticut eyalet çapında gözetim sırasında toplanmıştır.

<ol><li>Chosewood, L. C., Wilson, D. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChosewood%2C+LC+%22Biosafety+in+Microbiological+and+Biomedical+Laboratories%22">Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories</a>. , 5 edn, U.S. Government Printing Office. (2007).</li>
<li>Anderson, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+West+Nile+virus+from+mosquitoes%2C+crows%2C+and+a+Cooper%27s+hawk+in+Connecticut%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of West Nile virus from mosquitoes, crows, and a Cooper's hawk in Connecticut.</a> Science. 286, 2331-2333 (1999).</li>
<li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolations+of+Potosi+virus+from+mosquitoes+%28Diptera%3A+Culicidae%29+collected+in+Connecticut%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Isolations of Potosi virus from mosquitoes (Diptera: Culicidae) collected in Connecticut.</a> J Med Entomol. 42, 875-881 (2005).</li>
<li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+genetic+variant+of+La+Crosse+virus+%28Bunyaviridae%29+isolated+from+New+England%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">A new genetic variant of La Crosse virus (Bunyaviridae) isolated from New England.</a> Am J Trop Med Hyg. 75, 491-496 (2006).</li>
<li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Vossbrinck, C. R., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+West+Nile+virus+in+Connecticut%2C+USA%3A+a+five+year+analysis+of+mosquito+data+1999-2003%5BTitle%5D)+AND+%22Vector+Borne+Zoonotic+Dis%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of West Nile virus in Connecticut, USA: a five year analysis of mosquito data 1999-2003.</a> Vector Borne Zoonotic Dis. 4, 360-378 (2004).</li>
<li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Tirrell-Peck, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+isolations+of+eastern+equine+encephalitis+and+highlands+J+viruses+from+mosquitoes+%28Diptera%3A+Culicidae%29+during+a+1996+epizootic+in+southeastern+Connecticut%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Multiple isolations of eastern equine encephalitis and highlands J viruses from mosquitoes (Diptera: Culicidae) during a 1996 epizootic in southeastern Connecticut.</a> J Med Entomol. 35, 296-302 (1998).</li>
<li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eastern+equine+encephalitis+virus+in+mosquitoes+and+their+role+as+bridge+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Eastern equine encephalitis virus in mosquitoes and their role as bridge vectors.</a> Emerg Infect Dis. 16, 1869-1874 (2010).</li>
<li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Armstrong, P. M., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolations+of+Jamestown+Canyon+virus+%28Bunyaviridae%3A+Orthobunyavirus%29+from+field-collected+mosquitoes+%28Diptera%3A+Culicidae%29+in+Connecticut%2C+USA%3A+a+ten-year+analysis%2C+1997-2006%5BTitle%5D)+AND+%22Vector+Borne+Zoonotic+Dis%22%5BJournal%5D)">Isolations of Jamestown Canyon virus (Bunyaviridae: Orthobunyavirus) from field-collected mosquitoes (Diptera: Culicidae) in Connecticut, USA: a ten-year analysis, 1997-2006.</a> Vector Borne Zoonotic Dis. 8, 175-188 (2008).</li>
<li>Lennette, E. H., Lennette, D. A., Lennette, E. T. Chapter 11. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeaty%2C+BJ+%22Diagnostic+Procedures+for+Viral%2C+Rickettsial%2C+and+Chlamydial+Infections%22">Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial, and Chlamydial Infections</a>. , American Public Health Association. 189-212 (1995).</li>
<li>Karabatsos, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKarabatsos%2C+N+%22International+Catalogue+of+Arboviruses+Including+Certain+Other+Viruses+of+Vertebrates%22">International Catalogue of Arboviruses Including Certain Other Viruses of Vertebrates</a>. , American Society of Tropical Medicine and Hygiene. (1985).</li>
<li>Lanciotti, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+west+nile+virus+from+human+clinical+specimens%2C+field-collected+mosquitoes%2C+and+avian+samples+by+a+TaqMan+reverse+transcriptase-PCR+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of west nile virus from human clinical specimens, field-collected mosquitoes, and avian samples by a TaqMan reverse transcriptase-PCR assay.</a> J Clin Microbiol. 38, 4066-4071 (2000).</li>
<li>Lambert, A. J., Martin, D. A., Lanciotti, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+North+American+eastern+and+western+equine+encephalitis+viruses+by+nucleic+acid+amplification+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of North American eastern and western equine encephalitis viruses by nucleic acid amplification assays.</a> J Clin Microbiol. 41, 379-385 (2003).</li>
</ol>

Vero hücre kültürü testi virüs bir çeşitlilik için ekran alan toplama sivrisinekler için etkili bir yöntem olarak hizmet vermektedir. Bu özellikle hedef bir veya bir kaç ilgi virüslerin moleküler yöntemler tezat. Ayrıca, Vero hücre kültürü tahlil eşit değilse, RT-PCR 7 daha hassas ve gelecek çalışmalar için referans koleksiyonu saklanır virüs izolatları ile bize sunuyor bulduk . Bununla birlikte, hücre kültürü sistemleri, birçok durumda uygun olmayabilir. Bu yaklaşım, ek masraf ve BSL-3 laboratuvar virüslerin...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif / ekipman Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog Numarası </th></tr><tr><td> Fetal sığır serumu </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 16140 </td></tr><tr><td> Anti-biotic/mycotic </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 15240 </td></tr><tr><td> Sodyum bikarbonat, NaHCO 3,% 7.5 Soln. </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 25080 </td></tr><tr><td> L-Glutamine 200mm 100x </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 25030 </td></tr><tr><td> Toz gerekli minimum orta (MEM) </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 11700 </td></tr><tr><td> 10X Dulbecco&#39;nun Kullanıcı PBS </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 14080 </td></tr><tr><td> Tripsin-EDTA </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 15400 </td></tr><tr><td> Tavşan serumu </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 16120 </td></tr><tr><td> Vero Hücreleri (Klon E6) </td><td> ATCC </td><td> CRL-1586 </td></tr><tr><td> Küçük doku kültürü matara, havalandırmalı kapakları, 25 cm 2 </td><td> Falcon - Becton Dickinson </td><td> 353112 </td></tr><tr><td> Büyük doku kültürü matara, havalandırmalı kapakları, 175 cm 2 </td><td> Falcon - Becton Dickinson </td><td> 353108 </td></tr><tr><td> Bakır kaplı BB, 4.5 mm </td><td> Crosman </td><td> 0767 </td></tr><tr><td> Mikser Mill </td><td> Retsch </td><td> MM300 </td></tr><tr><td> Isopack dondurucu raflar </td><td> Eppendorf </td><td> 022510240 </td></tr></tbody></table>

vero hücre kültür testi ile alan toplanan sivrisinekler enfeksiyon virüs algılama

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Sivrisinekler Batı Nil virüsü, dang virüs ve chickungunya virüs gibi önemli insan patojenleri de dahil olmak üzere bir dizi farklı virüsler iletir. Bu virüslerin çoğu endemik aralıklarında yoğunlaştı ve yeni bölgeler için genişletilmiş, bu tehditlere yanıt vermek için, etkin bir gözetim ve kontrol programları gerektiren var. Virüs etkinliğini izlemek için bir strateji endemik sitelerinden çok sayıda sivrisinek toplama ve viral enfeksiyon için test içerir. Bu makalede, biz nasıl işleneceğini süreci tanımlamak ve Vero hücre kültürü yöntemi ile bulaşıcı bir virüs için sivrisinek alanında toplanan ekran. Sivrisinekler tuzak konumu ve türlerine göre sıralanır ve ≤ 50 bireyler içeren havuza gruplandırılmıştır. Pooled örnekleri karıştırıcı değirmen ve sulu faz konfluent Vero hücre kültürlerinde (Klon E6) üzerine inoküle kullanarak tamponlu salin içinde homojenize edilir. Hücre kültürleri 3-7 sonrası aşılama ve hücre kültüründe yetişen herhangi bir virüs uygun tanı testleri tarafından belirlenen gün sitopatik etki izlenir. Bu yaklaşımın kullanılması, Connecticut, ABD toplanan sivrisinekler 9 farklı virüsler izole var, ve bunlar arasında, 5 insan hastalığa neden olduğu bilinmektedir. Bu virüsler Üç (Batı Nil virüsü, Potosi virüs ve La Crosse virüsü), Kuzey Amerika ya da 1999 yılından bu yana New England bölgesi için yeni kayıtlar temsil eder. Geniş bir çeşitlilik virüs tespit yeteneği hem sivrisinek nüfus yılında kurulan ve yeni çıkan virüslere izlenmesi için kritik öneme sahiptir.

Biz süreci için bir metodu tanımlar ve ekran alanında toplanan Vero hücre kültürü yöntemi ile virüs bir çeşitliliğe sivrisinekler. Bu tekniği kullanılarak, Connecticut toplanan sivrisinek 4 taksonomik ailelerden gelen 9 farklı virüsler tespit ettik.

Vero Hücre Kültür Testi ile Alan toplanan Sivrisinekler Enfeksiyon Virüs Algılama

Sivrisinekler, Batı Nil virüsü, dengue virüsü ve chikungunya virüsü gibi önemli insan patojenleri de dahil olmak üzere çok sayıda farklı virüsü bulaştırırlar. Birçok...

Bu prosedürün genel amacı, sahada toplanan sivrisineklerin Vero hücre kültürü testi ile viral enfeksiyon açısından taranmasıdır. İlk olarak, sahada toplanan sivrisinekler türlerine göre ayrılır. Ardından sivrisinekler, bir karıştırıcı değirmen kullanılarak homojenize edilir.Sivrisinek homojenatları hazırlandıktan sonra, viral testlere hazırlık amacıyla Vero hücreleri kültüre edilir; ardından her bir Vero hücre kültürü, beş dakika boyunca çalkalayıcı üzerinde tutulan tek bir sivrisinek homojenatı ile inoküle edilir ve virüslerin çoğalmasına izin vermek için 37 °C'de inkübe edilir. Son olarak, kültürler virüs kaynaklı sitopatik etkilerin kanıtları açısından görsel olarak incelenir. Bu tekniğin R-T-P-C-R gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, sivrisineklerin hücre kültüründe büyüyebilen çok çeşitli viral ajanlar açısından taranmasına olanak tanımasıdır.Bu yöntem, farklı sivrisinek türlerinin virüs iletimini desteklemedeki rolleri gibi tıbbi entomoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Aşağıdaki prosedür için biyogüvenlik seviyesi iki olan bir tesis kullanın. Canlı sivrisineklerin bulunduğu toplama torbasını, onları anestezi etmek için -20 °C'de 15 dakik

detection-infectious-virus-from-field-collected-mosquitoes-vero-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Alphavirus uyum sistemlerini kullanarak in vitro ve erişkin sivrisinek floresan gazetecilere ifade etmek için yöntemler açıklanmıştır. Bu teknik, yerine ya da ek olarak bir muhabir ilgi herhangi bir protein ifade etmek için adapte olabilir.

Alphavirus uyum Sistemi: Sivrisinek Vektörler Enfeksiyon görselleştirme için Araçlar

Source: Huang, D., et al. Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes. J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates the step-by-step procedure for the in vitro isolation of mosquito-associated viruses from mosquito homogenates using fibroblast-like mammalian cells.

Isolation of Mosquito-Associated Virus from Mosquito Homogenate

Bu videoda, Zika Virüsü Nekahet Serumu kullanılarak Dang virüsü enfeksiyonunun antikora bağlı artışını (ADE) ölçmek için yapılan bir test gösterilmektedir. Tahlil, yeşil bir floresan proteini kodlayan Dang muhabiri viral partiküllerini (RVP'ler) kullanır. Zika Virüsüne karşı serum antikorları, bir kompleks oluşturmak için RVP'lerle çapraz reaksiyona girer. Bağlı antikorlar, akış sitometrisi kullanılarak tespit edilen Fc reseptörünü eksprese eden hücreler tarafından RVP alımını arttırır.

Viral Enfeksiyonun Antikora Bağlı Artışını İncelemek İçin Bir İn Vitro Test

Ortaya çıkan bir patojen olan Zika Virüsü (ZIKV), fetal gelişimsel anormallikler ve mikrosefali ile bağlantılıdır. Etkili bir enfeksiyöz hücre kültürü sisteminin kurulması, ZIKV replikasyonu çalışmalarının yanı sıra aşı ve ilaç geliştirme çalışmaları için de çok önemlidir. Bu çalışmada ZIKV ile ilgili çeşitli virolojik analizler gösterilmiş ve tartışılmıştır.

Zika Virüs Bulaşıcı hücre kültürü sistemine ve<em&gt; İn Vitro</emİnterferonların&gt; profilaktik etkisi

Geçerli Zika, chikungunya ve dang virüs karmaşık numune hazırlama ve pahalı araçları gerektirir ve düşük kaynak ortamlarda kullanmak zor tespit etmek için teşhis multiplexed. Algılamak ve yüksek duyarlılık ve özgüllük ile bu virüs ayırt etmek için hedef özgü strand displaceable probları ile izotermal amplifikasyon kullanan bir tanı gösteriyoruz.

Çoğaltılmış izotermal amplifikasyon Zika, Chikungunya ve dang 1 tespit etmek için teşhis platformu dayalı

Burada, Abdovirüs çoğaltma ve Abdovirüs çoğaltma kısıtlamak 2) ökaryotik ana faktörler teşvik 1) virüs kodlanmış immunomodulators tanımlamak için protokolleri mevcut. Floresan ve ışıldama dayalı yöntemlerin araştırmacılar hızla düşük sinyal noise oranları ile basit deneyleri Abdovirüs çoğaltma nicel veriler elde etmek için izin verir.

Araçlar Viral Immunomodulators ve ana bilgisayar Antiviral faktörler tanımlanması için eleme olarak Abdovirüs enfeksiyonlar

Sunulan protokol, Aedes aegypti sivrisinek popülasyonlarının Zika gibi belirli bir virüs için vektör yeterliliğini bir muhafaza ortamında belirleyebilir.

Zika Virüsü Kullanan Aedes aegypti Sivrisineklerinde Vektör Yetkinlik Analizleri

Bu protokol, sivrisineklerde tükürük bezi sporozoitlerini tespit etmek için sandviç enzime bağlı bir immünosorbent testini tanımlar. Kolayca bulunabilen monoklonal antikorları kullanan yöntem, Plasmodium falciparum veya Plasmodium vivax taşıyan sivrisineklerin uygun maliyetli, yüksek verimli tespitini sağlar. Yöntem, vektör araştırmaları da dahil olmak üzere sıtma bulaşma araştırmaları için uygundur.

Enzime Bağlı İmmünosorbent Testi Kullanılarak Anofel Sivrisineklerinde Plasmodium Sporozoitlerin Tespiti

Oral beslenme ve intratorasik enjeksiyon enfeksiyonunu içeren bu metodoloji, midgut ve / veya tükürük bezi bariyerlerinin arbovirüs enfeksiyonu üzerindeki etkisini etkili bir şekilde değerlendirebilir.

Yetişkin Sivrisineklerde Oral Beslenme ve Mikroenjeksiyon ile Deneysel Viral Enfeksiyon

Dizileme teknolojilerinin yaygın kullanımı nedeniyle sivrisineklerde çok sayıda yeni virüs benzeri sekans bulunmuştur. Omurgalı ve sivrisinek hücre hatlarını kullanarak virüsleri izole etmek ve büyütmek için etkili bir prosedür sunuyoruz; bu, sivrisinek kaynaklı ve sivrisineğe özgü virüsler de dahil olmak üzere sivrisinekle ilişkili virüsler üzerine gelecekteki çalışmaların temelini oluşturabilir.

Sahada Toplanan Sivrisineklerden Sivrisinek İlişkili Virüs İzolasyonu

Mevcut protokol, Zika virüsünün (ZIKV) Vero Afrika yeşil maymun böbrek hücrelerinde yayılımını ve 24 oyuklu ve 96 oyuklu (yüksek verimli) formatlarda hücre bazlı kolorimetrik immüno-tespit yöntemleri kullanılarak ZIKV'nin miktar tayinini açıklamaktadır.

Virüs Yayılımı ve Hücre Bazlı Kolorimetrik Miktar Tayini

Öğrenin, alandan toplanan sivrisineklerde viral enfeksiyonları Vero hücre kültürü testiyle taramayı. Bu yöntem, dört taksonomik aileden dokuz farklı virüsün tespitine olanak tanır.

Vero Hücre Kültür Testi ile Alan toplanan Sivrisinekler Enfeksiyon Virüs Algılama

Daha fazla video keşfet