Biyolojik Sistemleri İyon Konsantrasyon Ölçümü için Floresan Nanopartiküller

Aşağıdaki deneyin genel amacı, in vitro ve in vivo uygulamalar için sodyum nanosensörleri üretmektir. Bu, nanosensörler için sensör bileşenlerini içeren bir opto karışımı hazırlanarak gerçekleştirilir. İkinci adımda, opto eklendiğinde nanosensör oluşumuna olanak sağlamak amacıyla, sürfaktan sulu çözelti içinde homojen olarak dağıtılana kadar sonike edilir.

Ardından, çözeltide nanosensörleri oluşturmak için opto karışımı, sonikasyon altında sulu sürfaktan karışımına eklenir. Bu video, sensör yanıtının ayarlanabilir olduğunu göstermektedir. Sensörler kardiyak miyositlere mikroenjeksiyonla verilebildiği gibi, farelere deri altına da enjekte edilebilir.

Bu tekniğin floresan indikatör boyalar gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, sensörleri fizyolojik çevreyle uyumlu bir dinamik aralığa göre ayarlayabilmemiz, daha geniş bir analit yelpazesini ölçebilmemiz ve kantitatif analiz için rasyonel ölçümler gerçekleştirebilmemizdir. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler zorluk yaşayabilirler çünkü sensörler üretildikten sonra onları biyolojik bir ortama yerleştirmek göz korkutucu görünebilir. Optodlar hazırlanmadan önce, yazılı protokole uygun olarak kuru sodyum iyon four x kuru sodyum TFPB ve chromo four three stokları önceden hazırlanmalıdır.

Bir çeker ocak içerisinde, tüm materyalleri 1,5 mililitrelik bir cam vialde birleştirin. Teflon kaplı vidalı kapak kullanarak, tüm PVC çözünene kadar vialle hafifçe vorteksleyin. Çözelti kırmızı görünmelidir.

4 g'lık bir cam şişeye 10 mg/mL PEG lipid'den 100 µL ekleyerek nanosensörleri hazırlamaya başlayın. Ardından, 10 mM HEPES gibi istenen sulu çözeltiden 4 mL ekleyin.

Laboratuvar krikosu kullanarak bir sonikasyon ucunu vial içine yedi milimetre kadar daldırın ve 30 saniye boyunca düşük sonikasyon gücü uygulayın. Eşit karışımı sağlamak için, pipet yardımıyla 0,6 mililitrelik bir tüp içerisinde 50 µL opto materyal ile 50 µL diklormetanı birleştirin. Ardından, üç dakikalık bir sonikasyon işlemine başlayın.

Sonikasyon başladığında, pipet ucunu daldırıp tüm hacmi tek bir hızlı ve düzenli enjeksiyonla boşaltarak 100 µL opto karışımı ekleyin. pH yediye yükselirse ve çözeltideki kalıntı THF ve diklorometanı uzaklaştıracak sodyum yoksa çözelti maviye dönecektir. Sonikasyon ucunu iki milimetre derinliğe getirin.

Kalan üç dakika geçtiğinde, çözelti opak hale gelecektir. Sonikasyon tamamlandığında, nanosensör çözeltisini beş mililitrelik bir şırıngaya çekin. Bir filtre takın ve nanosensör çözeltisini vidalı kapaklı bir cam şişeye aktarın.

Nanosensörün duyarlılığının ölçülebileceği, kademeli olarak artan sodyum konsantrasyonlarına sahip 10 çözelti hazırlayarak başlayın. Sıfır molar ve bir molar sodyum stok çözeltilerini 50 mililitrelik konik tüplerde birleştirin. Ardından, optik tabanlı 96 kuyucuklu bir plakada, her bir sodyum konsantrasyonundan 100 mikrolitreyi bir sütundaki üç kuyucuğa ekleyin.

Ardından, her bir kuyucuğa taze hazırlanmış nanosensörlerden 100 µL ekleyin, plakayı bir mikroplaka florimetresine yerleştirin ve kullanılan kromofor için ideal olan eksitasyon, emisyon ve cutoff dalga boylarını girin. Ölçülen dalga boylarının seçimi uygulamaya bağlıdır. Bu dalga boyları, hücre içi hızlı dinamik ölçümler veya gürültü azaltma imkanı sağlar.

Alfa değerlerini elde etmek için, 570 nanometredeki yoğunluğun 670 nanometre veya 680 nanometredeki yoğunluğa oranını hesaplayın. Alfa değerlerini, sodyum konsantrasyonunun logaritmasına karşı grafikleyin. Sıfır sodyum konsantrasyonunun logaritmasını eksi bir olarak belirleyin.

Şimdi yanıta sigmoid bir eğri uydurun ve bu eğriden alfa değerinin 0.5 olduğu sodyum konsantrasyonunu hesaplayın. Bu, sensörün optimal yanıt verdiği sodyum konsantrasyonunu temsil eder. Bu bilgiyi kullanarak, optimal sodyum konsantrasyonuna sahip nanosensörler oluşturmak için opto içindeki sodyum iono four x sodyum TFPB ve chromo iono four three oranını ayarlayın.

Örneğin, dört adet 10'un sodyum miktarlarıyla değişen, farklı opto formülasyonlarını temsil eden beş farklı nanosensör setinin hero yanıt eğrileri. Hücre içi görüntüleme için, hücre besiyerini Tyro çözeltisi gibi şeffaf bir besiyeri ile değiştirin ve hücreleri bir görüntüleme haznesine aktarın. Şimdi, çekilmiş bir cam pipeti, suda 5 mg/mL glikoz ile hazırlanmış nanosensör çözeltisiyle geri doldurun.

Ardından pipeti bir mikromanipülatöre monte edin ve basınç kontrollü bir enjeksiyon sistemine bağlayın. Pipeti hücrenin üzerine ve sitoplazmanın içine doğru indirin. Membranı delmek için bazen manipülatör tutucusuna hafifçe vurmak gerekebilir.

Birkaç yüz picolitre nanosensör çözeltisi enjekte edin ve pipeti hızla geri çekin. Bir anestezi odası kullanarak bir CD-1 çıplak fareyi izofloran ile anesteziye alın. Fare anestezi altına girdikten sonra, fareyi dezenfekte edilmiş görüntüleme odasına yerleştirin.

Ardından, steril 31 gauge bir insülin şırıngasını, 10 millimolar PBS içindeki uygun KD değerine sahip 10 microliter nanosensör ile doldurun. Pens kullanarak tüm hava kabarcıklarını giderdiğinizden emin olun. Deriyi kavrarken, farenin sırtında istenen enjeksiyon bölgesi boyunca küçük bir deri kıvrımını tutun.

Şırıngayı, eğik ucu yukarı bakacak ve iğne cilde paralel olacak şekilde cilde yerleştirin. İğnenin bir kan damarına girmediğinden emin olmak için şırınga pistonunu geri çekin. Geri basıncı minimize etmek için, cilt içinde bir cep oluşturacak şekilde iğneyi nazikçe sağa ve sola hareket ettirin.

Ardından sensörleri enjekte edin ve şırıngayı nazikçe çıkarın. Enjeksiyon bölgesine hafifçe bastırın ve enjeksiyon bölgesinden dışarı sızmış olabilecek herhangi bir solüsyonu silin. Genellikle, sırt boyunca eşit aralıklı altı enjeksiyon yapılır.

Farklı fareler üzerinde işlem yapılacaksa, hastalık iletimini ve çapraz kontaminasyonu minimize etmek için iğneyi değiştirin. Enjeksiyonlardan sonra, nanosensörlerin eksitasyon emisyon spektrumuna yakından uyan filtre setlerini kullanarak parlak alan ve floresan görüntüler elde edin. Bu işlem aynı zamanda derinin otofloresansını da minimize eder.

Bu neonatal kardiyak miyositler bir lamel cam üzerinde kültüre edilmiş ve sodyum nanosensörleri ile enjekte edilmiştir. Bu floresan görüntü 639 nanometre eksitasyon dalga boyunda alınmıştır. Bu, aynı hücrelerin aydınlık alan görüntüsüdür ve bu da ikisinin üst üste bindirilmiş halidir.

Bir miktar sensör kümelenmesi meydana gelmiştir, ancak hücreler normal morfolojiye sahiptir. Sensörler sitozole yayılmış olup nükleer yükleme görülmemektedir. Parlak alan ve floresan görüntünün bu üst üste bindirmesi, çıplak bir farenin deri altı boşluğuna yapılmış dokuz farklı sodyum nanosensör deri altı enjeksiyonunu göstermektedir.

Masten nanosensörlerinin üretimi, doğru şekilde gerçekleştirildiğinde dakikalar içinde tamamlanabilir ve tersinir gerçek zamanlı analit akışını ölçmek için herhangi bir araştırmaya uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, biyolojik bir ortamda kantitatif ölçümler yapmak için nanosensörlerin hücre içi veya deri altı boşluğa nasıl yükleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.