Name: Biyolojik Sistemleri İyon Konsantrasyon Ölçümü için Floresan Nanopartiküller (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Öğrenin, floresan nanopartiküller kullanarak biyolojik sistemlerde iyon konsantrasyonu ölçümü için sodyum nanosensörlerinin nasıl hazırlandığını. Bu yöntem, hücre içi ve canlı hayvan modellerinde nicel analiz yapmayı mümkün kılar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JMD ve MKB Northeastern Üniversitesi (NSF hibe DGE-0.504.331 NCI ve fon), IGERT Nanotıp Fen ve Teknoloji programı ile finanse edilmektedir. Bu çalışma aynı zamanda Genel Tıp Bilimleri Hibe R01 GM084366 Sağlık Ulusal Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından finanse edildi. Ayrıca Saumya Das ve Boston BIDMC Anthony Rosenzweig hayvan protokol gelişimine yaptığı katkılar için, kardiyak miyositler ve Kevin Nakit sağlamak için teşekkür ederiz.

1. Optode, hazırlanması Optode yapmadan önce, bileşenlerin hacimde kolaylıkla ölçülebilir ve saklanabilir ki bu yüzden ihtiyacı vardır. <ol><li> 50 mg Sodyum İyonofor X (NaIX) flakon ve 50 mg sodyum Tetrakis [3,5-bis (triflorometil) fenil] borat (NaTFPB) her tetrahyrdofuran (THF) büyümüş ve 1.5 ml polistiren santrifüj tüplerine içine aliquoted olacaktır. Kimyasal bir davlumbaz, nakliye flakon THF 1 ml, 50 mg NaIX çözülür ve katı tamamen çözülmüş olduğundan emin olmak için karıştırın. Bu çözüm ul 100 10 ayrı santrifüj tüplerine aktarın. NaTFPB için tekrarlayın. THF, gecede bir kimyasal davlumbaz buharlaşması santrifüj tüplerine etiket ve depolama için 4 derecelik buzdolabı onları yere bırakın. Bu kuru NaIX ve NaTFPB 5 mg alikotları oluşturur. </li><li> 1 ml THF Chromoionophore III (CHIII) çözülür ve 3 ml'lik cam flakon transfer. CHIII nakliye flakon herhangi bir kalıntı CHIII çözülür ve 3 ml'lik cam flakon eklemek için başka bir 1 ml THF ekleyin. Şu anda toplam 2 ml olacak. Teflon kaplı kapaklar ile iki ayrı 1.5 ml cam şişe 1 ml THF çözüm CHIII aktarın. CHIII çözümü son 5 mg / ml konsantrasyonda 4 derece buzdolabında saklayın. </li></ol> Bu alikot ve çözümler optode malzeme yapmak için kullanılır. <ol start="3"><li> Teflon kaplamalı vidalı kapaklı bir 1.5 ml cam şişenin içine Pipet 66 ul bis (2-etilheksil) sebacate (DOS) - Bu optode flakon. DOS viskoz bir çözümdür böylece flakon aktarılır çözüm uygun miktarda sağlamak için dikkat edilmelidir. Hacmi DOS ~ 60 mg karşılık gelir. </li><li> Yüksek molekül ağırlıklı poli (vinil) klorür (PVC) 30 mg tartılır ve optode flakon için bu transferi. </li><li> Şimdi aliquoted işlevsel bileşenleri istenilen optode oluşturmak için optode flakon eklemek. CHIII, NaIX ve NaTFPB göreceli konsantrasyonları sodyum sensörü yanıt belirleyecektir. Bu konsantrasyonları, ideal Kd 150 mM, 10 mM veya ekstrasellüler konsantrasyonları Kd ile konsantrasyonları hücre içi yanıt bir sensör için ayarlanabilir. Ayrıca, büyük olasılıkla, sensörler satıcı ve kalibrasyon kimyasalların toplu değişkenlik toplu kimyasal bileşenleri her yeni parti için doğru tepki oluşup oluşmadığını belirlemek için gerekli olacaktır. Burada genellikle intraselüler sodyum ölçümleri için kullanılan konsantrasyonlarda bir sensör oluşturmak için bir yöntem tarif. </li><li> Kimyasal bir davlumbaz, THF çözüm optode flakon 5 mg / ml CHIII 100 ul aktarın. </li><li> THF 300 ul NaIX 5 mg çözülür ve bu ilişkilendiren NaIX 5 mg optode flakon 300 ul transfer. </li><li> THF 500 ul 5 mg NaTFPB bir kısım çözülür ve 0.1 mg NaTFPB optode flakon, bu ilişkilendiren çözüm 20 ul transfer. </li><li> THF 80 ul optode flakon ekleyin. </li><li> Optode flakon çözüm PVC, DOS 60 mg, 5 mg NaIX NaTFPB, THF 500 ul CHIII 0.5 mg, 0.2 mg 30 mg içerir. PVC kadar yavaşça girdap bu flakon çözünmüş vardır. Optode kırmızı bir renk olmalıdır. THF toplam tutarı ne olursa olsun kullanılan bileşenlerin oranı 500 mcL olmalıdır flakon ekledi. </li><li> NaIX ve NaTFPB alikot kalan THF gecelik ve yeniden-etiket tüp kimyasal doğru miktarda buharlaşmaya bırakın. </li></ol> 2. Nanosensors Oluşturma <ol><li> Pipet 100 ul 10 mg / ml 1,2-Distearoyl-sn-Glycéro-3-Phosphoethanolamine-N - 4 dram cam şişenin içine kloroform [metoksi (polietilenglikol) -550] (PEG-lipit). Kloroform, kimyasal bir davlumbaz buharlaşmaya bırakın. Bu süreç, çözüm, azot gazı veya ev hava ile kurutulması ile hızlandırılmış olabilir. </li><li> Için istenen sulu çözelti PEG-lipit flakon 4 ml ekleyin. Sonicating ucu altından bir laboratuvar jack flakon yerleştirin ve ucu çözümü 7 mm derinliğinde ve 30 saniye kadar düşük sonication güç sonikasyon flakon yükseltmek. Burada ½ inç ucu çapı adım korna ile% 15 genlik kümesi Branson dijital sonifier kullanın. Sulu çözelti herhangi bir çözüm olabilir. Örneğin, biz trizma tabanı ile 10 mM HEPES pH 7,2 sensörleri yanıt belirlemek için. </li><li> Çözüm sonicated edilirken, 0.6 ml mikrosantrifüj tüp diklorometan 50 ul optode malzeme 50 ul karıştırın. Hatta karışmasını sağlamak için pipet ile karıştırın. </li><li> 3 dakika boyunca sonikasyon sonifier kontrolü ayarlayın. Sonication başlatın ve sonicating ise çözüm pipet içine çeker ve bir hızlı, hatta enjeksiyon 100 ul çözüm dağıtım flakonuna optode karışımı çözümü eklemek. Çözüm mavi, Depe açmalısınızkullanılan sulu çözelti bulgu. </li><li> Sonication sonra yaklaşık 30 saniye boyunca devam sonicating ucu çözüm derin yaklaşık 2 mm jack böylece düşürmek için izin verin. Bu çözüm havalandırmak için başlamalıdır ve çözüm opak hale gelecektir. Bu adım, kalan THF ve diklorometan çözüm kaldırmak için yardımcı olur. </li><li> Sonication tamamlandıktan sonra, 5 ml enjektör içine nanosensor çözüm yukarı çekin. 0.2 mikron şırınga filtresi takın ve nanosensor çözüm vidalı üst kapak ile bir cam şişenin içine dağıtmak. Az 10 mM sodyum içerir ve yaklaşık 9 yıldan az bir pH değerine sahiptir sulu bir çözüm ise çözüm, berrak ve mavi olmalıdır. Aksi takdirde, hiçbir renk ya da pembe olmalıdır. </li></ol> 3. Nanonsensor yanıt Belirlenmesi Bu yöntem, hücre içi sodyum ölçmek için tasarlanmış nanosensors yanıtı belirlemek için kullanılır. Ekstrasellüler sodyum konsantrasyonu nanosensors için farklı konsantrasyonlarda kullanılması önerilir. <ol><li> 10 mM HEPES (0 Na) ve 10 mM HEPES (1 M Na) ve pH Bu çözümlerin her biri 7.2 trizma tabanı kullanarak 1M sodyum klorür (NaCl) stok çözümleri olun. 0, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 mM NaCl konsantrasyonları: çözümleri oluşturmak için 50 ml konik santrifüj tüplerine 0 Na ve 1 M Na stok çözümleri karıştırın. </li><li> Yanıtı belirlemek için bir optik alt 96 plaka kullanın. Her bir sütun 3 kuyu sodyum konsantrasyonu 100 ul ekleyin. Bu 3 x 10 kuyu bir dizi üretecek. </li><li> Her biri için de 100 taze hazırlanmış nanosensors ul ve bir mikroplak flüorometre yük ekleyin. Biz Moleküler Cihazlar SPECTRAmax M3 kullanın. </li><li> Aşağıdaki dalga boylarında her iyi okuyun: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Tahrik olma (nm) </td><td> Emisyon (nm) </td><td> Cut-Off (nm) </td></tr><tr><td> 488 </td><td> 570 </td><td> 530 </td></tr><tr><td> 488 </td><td> 670 </td><td> 610 </td></tr><tr><td> 639 </td><td> 680 </td><td> 665 </td></tr></tbody></table> Her bir dalga boyunda nanosensor yoğunluğu sodyum konsantrasyonuna bağlıdır. Dalga boyu kullanımı uygulamaları bağlıdır. Intrasellüler yavaş dinamikleri ölçümleri için, biz, 488 nm/570 nm (uyarma / emisyon) ve oranı iki dalga boyları için bize izin ve gürültüyü azaltmak 488 nm/670 nm kullanın. <ol start="5"><li> Geleneksel olarak, optode veri bir değerlere dönüştürülür: a = (I - I min) / (I max - I min), belirli bir sodyum konsantrasyonu yoğunluğu nerede, ben min yanıt ölçümlerde en düşük yoğunluk ve ben max yanıt ölçümleri en yüksek yoğunluğu. Yoğunluk oranı, 670 nm yoğunluğu veya α ile 680 nm'de yoğunluğu bölünmüş 570 nm ya dönüştürün. </li><li> -1 'Den sıfır sodyum konsantrasyonu günlük, günlük sodyum konsantrasyonu karşı α çizmek için, Excel veya Menşei genellikle laboratuarda kullanılan ya komplo yazılımı kullanın. Bir sigmoid eğri yanıt sığdır. Eğri, sensör en iyi şekilde karşılık verir konsantrasyon temsil = 0.5 α az sodyum konsantrasyonunun hesaplanması. </li><li> Nanosensors ilgi sodyum konsantrasyonu etrafında optimal cevabı oluşturmak için optode CHIII, NaIX ve NaTFPB oranı ayarlayın. </li></ol> 4. Hücre içi görüntüleme <ol><li> Hücre içi ölçümler için, suda 5 mg / ml glikoz nanosensors yapılır ve hücrelerin içine microinjected. </li><li> Büyü ya da bir bardak alt yemek veya bir bardak lamel alt ile bir görüntüleme odası hücreleri aktarmak. </li><li> Net medya ya da Tyrode çözümü hücrelerin inkübe edin. Görüntüleme odası veya çanak Epifloresans bir mikroskop üzerine monte edin. Biz Zeiss LSM 7 konfokal mikroskop kullanıyoruz. </li><li> Bir pipet çektirmesi ile kılcal cam çekin. Biz son bir ucu çapı yaklaşık 300-500 nm, 1 mm OD, 0.78 mm ID cam kahverengi p-97 alevli bir Sutter kullanın. </li><li> Dolgu nanosensor, bir şırınga ve Hamilton iğne kullanarak çözüm, ya da bir mikrotip yükleyici ve bir pipet pipet. </li><li> Pipet bir micromanipulator bağlı bir basınç kontrollü enjeksiyon sistemine bağlı bir tutucunun içine monte edin. Burada bir Burleigh EXFO PCS 6000 mikromanipülatör ve medikal sistemler şirketi enjektör kullanın. </li><li> Hücrenin üstüne pipet Alt ve sitoplazma içine, bazen de delmek için membran manipülatör tutucu "tap" için gereklidir. Nanosensor çözüm enjekte edilir ve hızlı pipet geri. </li></ol> 5. in vivo görüntüleme Tüm işlemler, Northeastern Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır . <ol><li> Nanosensorsin vivo olarak, ekstrasellüler görüntüleme fosfat tamponlu tuz ve sodyum konsantrasyonu 135 mM sodyum optimal bir yanıt var ayarlanabilir. </li><li> Enjeksiyon set-up ve floresan nanosensors farelerde görüntüleme için, IVIS Lumina II ve ilişkili anestezi ünitesi kullanır. Indüksiyon ve görüntüleme odaları dezenfekte edin. Indüksiyon odasına yerleştirin CD1 çıplak farelerin (yaklaşık 20g) ve izofluran için bunları ortaya çıkarmak. Uygulandığında izofluran ve oksijen akış hızı yüzde farelerin türleri ve ağırlığına bağlı olarak değişir. Fareler tamamen anestezi olmak için bekleyin. </li><li> Fareler anestezi sonra fareler, indüksiyon odası ve yerden görüntüleme odasına çıkarın. Fareler anestezi altında tutun. Her fare için, istenilen enjeksiyon alanları dezenfekte edin. </li><li> Tüm hava kabarcıklarını çıkarmak için emin olun nanosensors 10 mcL ile steril bir 31G insülin enjektörü doldurun. </li><li> Forseps kullanarak, istenilen enjeksiyon yerinde fare sırtı boyunca cilt kat küçük bir kavramak. Cilt açgözlü iken, yukarı gelecek şekilde eğim ve cilde paralel iğne ile cilt içine şırınga takın. </li><li> Sensörler enjekte önce, bir kan damarı içine iğne takılı olduğundan emin olmak için şırınga pistonu geri çekin. Sonra, yavaşça iğne doğru hareket eder ve deri içinde bir cep oluşturmak için sol. Bu sensörleri enjeksiyon yerinde sızıntı neden geri basınç en aza indirecektir. Sensörler enjekte şırınga ve yavaşça çıkarın. </li><li> Enjeksiyon yerinde hafifçe basınç uygulayın ve enjeksiyon yerinde dışarı sızdırılmış olabilir herhangi bir çözüm silerek temizleyin. Bu cilt içine enjekte sensörlerden gelen floresan en aza indirecektir. </li><li> Istenen enjeksiyon alanların sayısı ulaşana kadar tekrarlar 5.7 ile 5.4 adım. Arka sağ ve sol tarafta eşit aralıklı altı enjeksiyon siteleri tavsiye edilir. Iğne deri içine eklemek için zor olur, her bir fare için, iğneler değiştirin. İğneler fareler arasında paylaşılan olmamalıdır. Fareler arasında hastalık bulaşma veya çapraz kontaminasyon en aza indirecektir. </li><li> Görüntüleme sodyum floresan sensörleri için, en yakın 640 nm/680 nm (uyarma / emisyon) nanosensors spektrumu uyumlu ve aynı zamanda cilt otofloresans en aza indirmek filtre setlerini kullanarak farelerde aydınlık ve floresan görüntü kazanır. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2896/2896fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 sodyum beş farklı nanosensor setleri cevabı eğrileri. Her set CHIII, NaTFPB, PVC ve DOS aynı miktarda ama NaIX değişen miktarlarda farklı optode formülasyonları nanosensors temsil eder. Veri 639/680 nm şiddetlerini kullanarak α değerlere dönüştürülür. Veri Kökeni kullanarak monte sigmoid eğri, açıklık için atlanmış 3, hata çubukları ortalama. Bu yanıt eğrisi, maksimum kullanılan sodyum konsantrasyonu 500 mM oldu. Sodyum sodyum nanosensors Kd 10 mM (turuncu elmas) hakkında 150 mM (siyah kareler) arasında değişmekteydi. <img src="/files/ftp_upload/2896/2896fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 yenidoğan kardiyak miyositler Injected. Hücreler, coverglass kültür mikroskop üzerine monte edilmiş ve sodyum nanosensors ile enjekte edildi. Floresan (639 nm uyarım), aydınlık ve bindirme gösterilir. Not bazı sensör kümeleme oluşur, ancak hücreleri sensörleri sitoplazmada her tarafına nüfuz etmiş ve hiçbir nükleer yükleme var, normal morfoloji var. <img src="/files/ftp_upload/2896/2896fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 sodyum nanosensors farelerin Subkutan enjeksiyon. Çıplak farelerin subkutan uzaya sodyum nanosensors Dokuz farklı enjeksiyonları yapıldı. Parlak bir alan ve floresan görüntüleri (640/680), üst üste.

<ol><li>Adrogue, H. J., Madias, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyponatremia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Hyponatremia.</a> N Engl J Med. 342, 1581-1589 (2000).</li>
<li>Kim, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BACE1+regulates+voltage-gated+sodium+channels+and+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">BACE1 regulates voltage-gated sodium channels and neuronal activity.</a> Nat Cell Biol. 9, 755-764 (2007).</li>
<li>Dubach, J. M., Lim, E., Zhang, N., Francis, K. P., Clark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((in+vivo+sodium+concentration+continuously+monitored+with+fluorescent+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">in vivo sodium concentration continuously monitored with fluorescent sensors.</a> Integr Biol (Camb). , (2010).</li>
<li>Minta, A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+cytosolic+sodium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for cytosolic sodium.</a> J Biol Chem. 264, 19449-19457 (1989).</li>
<li>Dubach, J. M., Harjes, D. I., Clark, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-selective+nano-optodes+incorporating+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Ion-selective nano-optodes incorporating quantum dots.</a> Journal of the American Chemical Society. 129, 8418-8418 (2007).</li>
<li>Dubach, J. M., Harjes, D. I., Clark, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+ion-selective+nanosensors+for+intracellular+analysis+with+improved+lifetime+and+size%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Fluorescent ion-selective nanosensors for intracellular analysis with improved lifetime and size.</a> Nano Letters. 7, 1827-1831 (1021).</li>
<li>Schaffar, B., Wolfbeis, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sodium-selective+optrode%5BTitle%5D)+AND+%22Mikrochim+Acta+III%22%5BJournal%5D)">A sodium-selective optrode.</a> Mikrochim Acta III. III, 109-109 (1989).</li>
<li>Seiler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+sodium-selective+optode+membranes+based+on+neutral+ionophores+and+assay+of+sodium+in+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of sodium-selective optode membranes based on neutral ionophores and assay of sodium in plasma.</a> Clin Chem. 37, 1350-1355 (1991).</li>
<li>Zhujun, Z., Mullin, J., Seitz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sensor+for+sodium+based+on+ion-pair+extraction+and+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Optical sensor for sodium based on ion-pair extraction and fluorescence.</a> Anal Chim Acta. 184, 251-251 (1986).</li>
<li>Bakker, E., Buhlmann, P., Pretsch, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carrier-Based+Ion-Selective+Electrodes+and+Bulk+Optodes.+1.+General+Characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Carrier-Based Ion-Selective Electrodes and Bulk Optodes. 1. General Characteristics.</a> Chem Rev. 97, 3083-3132 (1997).</li>
<li>Dubach, J. M., Das, S., Rosenzweig, A., Clark, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+sodium+dynamics+in+isolated+cardiomyocytes+using+fluorescent+nanosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Visualizing sodium dynamics in isolated cardiomyocytes using fluorescent nanosensors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16145-16150 (2009).</li>
<li>Harjes, D. I., Dubach, J. M., Rosenzweig, A., Das, S., Clark, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-Selective+Optodes+Measure+Extracellular+Potassium+Flux+in+Excitable+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Rapid+Communications%22%5BJournal%5D)">Ion-Selective Optodes Measure Extracellular Potassium Flux in Excitable Cells.</a> Macromolecular Rapid Communications. 31, 217-221 (2010).</li>
<li>Balaconis, M. K., Billingsley, K. L., Dubach, J. M., Clark, H. A. Pittsburgh Conference on Analytical Chemistry and Applied, , Forthcoming.</li>
<li>Park, E. J., Brasuel, M., Behrend, C., Philbert, M. A., Kopelman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+optical+PEBBLE+nanosensors+for+real-time+magnesium+ion+concentrations+inside+viable+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Ratiometric optical PEBBLE nanosensors for real-time magnesium ion concentrations inside viable cells.</a> Anal Chem. 75, 3784-3791 (2003).</li>
<li>Frangioni, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((in+vivo+Near-Infrared+Fluorescence+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Op+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">in vivo Near-Infrared Fluorescence Imaging.</a> Curr Op Chem Biol. 7, 626-634 (2003).</li>
</ol>

Nanosensors oluşumu, 10 dakikadan daha optode çözümü yapıldıktan sonra artık almalı ve PEG lipid kurutulur. Optode sadece ihtiyaç duyulan hızlı zaman yapılabilir değil, ancak 4 derece C saklandığı zaman, bu ay için kararlı olabilir. Nansensors, bir kez kuruldu, haftada en az bir çözüm kararlı olduğunu göstermiştir. Ancak, ışıktan nanosensors bloke ederek bu zaman içinde photobleaching önlemek için dikkat edilmelidir 6 sodyum nanosensors göstermiştir iken, optodes edilmiştir gibi potasyum ve klorür. 10,12 gibi en biyolojik ilgili iyonları Ayrıca glukoz gibi küçük moleküller için bu teknolojiyi daha da genişlettik yarattı. 13 Farklı analitler izlemek için nanosensors üreten yanı sıra, bu nanosensors çoğu biyolojik deneyler faydalı kılan diğer değişiklikler için uygun. Örneğin, yüzey kaplama, poli (etilen glikol), bu durumda kolayca suda çözünür A&#39;nın herhangi bir molekül ile değişmiş olabilir. Bu farklı uygulamalar veya hedefler için bu nanopartiküller functionalizing imkanı sağlar. Nanoparçacıkların boyutu, yüzey kaplama, sonication yoğunluğu veya kullanılmış olan solvent değiştirerek ayarlanabilir. Kalsiyum floresan göstergeler, hücre içi kalsiyum sinyalizasyonu belirlenmesinde çok değerli olan, ancak, hiçbir sodyum hassas boyalar aynı ideal özelliklere sahiptir. Optode görüntüleme iyonları intraselüler yıldır geliştirilmekte olan alternatif bir yöntem sağlamak için tasarlanmıştır nanopartiküller 14 Biz umarım sodyum sinyalizasyon hücresel fonksiyonları ve nasıl etkilediğini anlamak için bir araç sağlayacaktır intrasellüler sodyum görüntüleme için özel nanosensors oluşturmak için bu, daha önceki araştırma üzerine inşa bazı hastalıklara neden sinyal değişiklikler. In vivo olarak floresan nanosensors kullanımı, gerçek zamanlı izleme analitler kan çekilir. 3 Sodyum ve yukarıdaki teknoloji tabanlı glikoz nanosensors sırasıyla, sodyum ve glikoz değişiklikleri izlemek gösterilmiştir gibi diğer yöntemlere göre minimal invaziv bir alternatif sunuyor in vivo. 3,13 Ancak, şu anda bu yöntem bir izleme aracı olarak sınırlamalar var. Örneğin, sensörler cilt arka otofloresans en aza indirmek için 15 İkinci yeterince yakın kızılötesi kızıla doğru kaydırılır bir yelpazede fluorofor içermelidir, mevcut enjeksiyon tekniği bu neden olabilir nanosensors tek tip enjeksiyon üretmek değil enjeksiyon derinlemesine değişimi gibi hataları. Bu kısıtlamalara rağmen, bu floresan nanosensors geliştirilmesi ve başarılı bir gösteri bu sensörler hastanın sağlık izlenmesi için paha biçilmez bir araştırma aracı ve yöntemi yapabilir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Ürün Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog Numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> IVIS Lumina II Enstrüman Paketi </td><td> Kaliper Yaşam Bilimleri </td><td> 126273 </td><td></td></tr><tr><td> CD-1 Çıplak Fareler </td><td> Charles River </td><td> Gerilme Kodu: 086 </td><td> Immünyetmezligi </td></tr><tr><td> İnsülin şırıngaları </td><td> BD </td><td> 328438 </td><td> 3 / 10 cc mL, 8mm, 31G </td></tr><tr><td> Yüksek Moleküler Ağırlık PVC </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DOS </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CHIII </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaTFPB </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaIX </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> İnce duvarlı kapiller cam </td><td> Sutter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> PEG lipid </td><td> Avanti Polar lipidler </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1: Bu prosedürde kullanılan kimyasallar ve ekipmanların bir listesini sağlar. Listede olmayan tüm ortak kimyasallar Sigma firmasından satın alınmıştır.

biyolojik sistemleri İyon konsantrasyon Ölçümü için floresan nanopartiküller

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Vücut boyunca sıkı regüle iyon homeostaz dehidrasyon gibi zayıflatıcı devletlerin önlenmesi için gereklidir. Buna karşılık 1, hücresel düzeyde hızlı iyon akıları Uyarılabilir hücreler aksiyon potansiyelleri başlatmak için gerekli olan 2 Sodyum düzenleme, hem de önemli bir rol oynar Bu durumlarda, ancak hiçbir yöntem in vivo 3 ve 4 kalsiyum probları gibi benzer detaylı sonuçlar vermemektedir intrasellüler sodyum probları, sodyum düzeyleri sürekli olarak izlenmesi için var . Bu boşlukları doldurmak için bir çaba, floresan nanosensors, sodyum konsantrasyonları in vitro ve in vivo olarak izleyebilmesi için geliştirilmiştir. 5,6 Bu sensörler, iyon seçici optode teknoloji tabanlı ve sodyum özel tanıma yumuşatıcı polimerik partiküllerin oluşur 7-9 mekanistik elemanları, pH-duyarlı fluorophores ve katkı gömülüdür. sodyum tanıma elemanı sensör içine sodyum ayıklar. 10 Bu çıkarma neden olan sensör içinde şarj tarafsızlığını korumak için bir hidrojen iyonu serbest bırakmak için pH-duyarlı fluorofor neden floresan bir değişiklik. Sodyum sensörler hücre içi yüksek konsantrasyonlarda bile, potasyum üzerinde geri dönüşümlü ve sodyum için seçici. 6 çapı yaklaşık 120 nm ve biyouyumluluk vermek için polietilen glikol ile kaplanmıştır . Mikroenjeksiyon teknikleri kullanarak, sensörler, kardiyak miyositler dayak zamansal ve mekansal sodyum dinamiklerini izlemek için gösterilmiş olan hücrelerin sitoplazma içine teslim edilebilir. Ayrıca 11 enjekte edildiğinde, aynı zamanda in vivo olarak sodyum konsantrasyonları gerçek zamanlı değişiklikler izlenir subkutan farelere 3 Burada, ayrıntılı olarak açıklamak ve floresan sodyum nanosensors imalatı için metodoloji göstermek ve kısaca bizim laboratuvar nanosensors kullanır biyolojik uygulamalar göstermektedir: sensörler hücre içine mikroenjeksiyon ve sensörler farelere subkutan enjeksiyon .

Laboratuarda üretilen Floresan nanopartiküller fizyolojik homeostazı sırasında sinyalizasyon ve interstisyel sıvı sırasında hücre gibi biyolojik sistemler görüntüleme iyon konsantrasyonları ve iyon akıları için kullanılır.

Biyolojik Sistemleri İyon Konsantrasyon Ölçümü için Floresan Nanopartiküller

Vücut genelinde sıkı bir şekilde düzenlenen iyon homeostazı, dehidrasyon gibi yıpratıcı durumların önlenmesi için gereklidir.1 Buna karşılık, hızlı iyon...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, in vitro ve in vivo uygulamalar için sodyum nanosensörler üretmektir. Bu işlem, nanosensörler için sensör bileşenlerini içeren bir opto karışımı hazırlanarak gerçekleştirilir. İkinci adımda, opto eklendiğinde nanosensör oluşumuna olanak sağlamak amacıyla, homojen bir dağılım için sürfaktan sulu çözelti içinde sonikasyona tabi tutulur.Ardından, çözelti içinde nanosensörleri oluşturmak için opto karışımı, sonikasyon altında sulu sürfaktan karışımına eklenir. Bu video, sensör yanıtının ayarlanabilir olduğunu göstermektedir. Sensörler, kardiyak miyositlere mikroenjeksiyonla aktarılabileceği gibi, farelere deri altı şeklinde de enjekte edilebilir.Bu tekniğin floresan indikatör boyalar gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, sensörleri fizyolojik ortama uygun bir dinamik aralığa ayarlayabilmemiz, daha geniş bir analit yelpazesini ölçebilmemiz ve kantitatif analiz için rasyometrik ölçümler gerçekleştirebilmemizdir. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, sensörler üretildikten sonra bunları biyolojik bir ortama yerleştirme aşamasında zorluk yaşayabilirler. Opto üretimine geçmeden önce, yazılı protokol uyarınca kuru sodyum iyonu four x, kuru sodyum TFPB ve chromo four three stokları hazırlanmalıdır.Bir çeker ocak içerisinde, tüm malzemeleri 1,5 mililitrelik bir cam viyale aktarın. Teflon kaplı vidalı bir kapak kullanarak, tüm PVC çözünene kadar viyali hafifçe vorteksleyin. Çözeltinin kırmızı renkte görünmesi gerekir.4 g'lık bir cam şişeye 10 mg/mL PEG lipid'den 100 µL ekleyerek nanosensörlerin hazırlanmasına başlayın. Ardından, 10 mM HEPES gibi istenen sulu çözeltiden 4 mL ekleyin.Bir laboratuvar krikosu kullanarak sonikasyon ucunu flakona yedi milimetre derinliğe kadar daldırın ve 30 saniye boyunca düşük sonikasyon gücü uygulayın. Eşit karışım sağlamak için bir pipet yardımıyla 0,6 mililitrelik bir tüpte 50 mikrolitre optik materyal ile 50 mikrolitre diklorometanı birleştirin. Ardından, üç dakikalık bir sonikasyon işlemi başlatın.Sonikasyon başladığında, pipet ucunu daldırarak ve tüm hacmi tek bir hızlı, eşit enjeksiyonla boşaltarak 100 µL opto karışımı ekleyin. pH yediye yükselirse ve çözeltideki kalıntı THF ve diklorometanı uzaklaştıracak sodyum yoksa çözelti maviye dönecektir. Sonikasyon ucunu iki milimetre derinliğe getirin.Kalan üç dakika geçtikçe çözelti opaklaşacaktır. Sonikasyon tamamlandığında, Nanosensör çözeltisini beş mililitrelik bir şırıngaya çekin. Bir filtre takın ve nanosensör çözeltisini vidalı kapaklı bir cam şişeye aktarın.Nanosensörün hassasiyetinin ölçülebileceği, sodyum konsantrasyonu kademeli olarak artan 10 çözelti hazırlayarak başlayın. Sıfır molar ve bir molar sodyum stok çözeltilerini 50 mililitrelik konik tüplerde birleştirin. Ardından, optik tabanlı 96 kuyucuklu bir plakada, her sodyum konsantrasyonundan 100 mikrolitreyi bir sütundaki üç kuyucuğa ekleyin.Ardından, her bir kuyucuğa taze hazırlanmış 100 µL nanosensör ekleyin, plakayı bir mikroplaka florimetresine yerleştirin ve kullanılan kromofor için ideal olan eksitasyon, emisyon ve kesme (cutoff) dalga boylarını girin. Ölçülen dalga boylarının seçimi uygulamaya bağlıdır. Bu dalga boyları, hücre içi hızlı dinamik ölçümler veya gürültü azaltma imkanı sağlar.Alfa değerlerini elde etmek için, 570 nanometredeki yoğunluğun 670 nanometre veya 680 nanometredeki yoğunluğa oranını hesaplayın. Alfa değerlerini, sodyum konsantrasyonunun logaritmasına karşı grafiğe dökün. Sıfır sodyum konsantrasyonunun logaritmasını eksi bir olarak belirleyin.Şimdi yanıta sigmoid bir eğri uydurun ve bu eğriden, alfa değerinin 0.5 olduğu sodyum konsantrasyonunu hesaplayın. Bu, sensörün optimal şekilde yanıt verdiği sodyum konsantrasyonunu temsil eder. Bu bilgiyi kullanarak, optimal sodyum konsantrasyonuna sahip nanosensörler oluşturmak için opto içindeki sodyum iono four x sodyum TFPB ve chromo iono four three oranını ayarlayın.Örneğin, yalnızca dört 10 sodyum miktarının farklı olduğu, farklı opto formülasyonlarını temsil eden beş farklı nanosensör setinin hero yanıt eğrileri. Hücre içi görüntüleme için, hücre ortamını Tyro çözeltisi gibi şeffaf bir ortamla değiştirin ve hücreleri bir görüntüleme haznesine aktarın. Şimdi, çekilmiş bir cam pipeti, suda beş miligram/mililitre glikoz ile hazırlanmış nanosensör çözeltisiyle geri doldurun.Ardından pipeti bir mikro manipülatöre monte edin ve basınç kontrollü bir enjeksiyon sistemine bağlayın. Pipeti hücrenin üzerine ve sitoplazmanın içine doğru indirin. Membranı delmek için manipülatör tutucusuna hafifçe vurmak bazen gerekli olabilir.Birkaç yüz picoliter nanosensör çözeltisi enjekte edin ve pipeti hızla geri çekin. Bir anestezi odası kullanarak isoflorine ile bir CD1 çıplak fareyi anestezi altına alın. Fare anesteziye girdiğinde, fareyi dezenfekte edilmiş görüntüleme odasına yerleştirin.Ardından, steril 31 gauge bir insülin şırıngasını, 10 millimolar PBS içinde uygun KD değerine sahip 10 µL nanosensör ile doldurun. Pens kullanarak tüm hava kabarcıklarını çıkardığınızdan emin olun. Fareyi tutarken, istenen enjeksiyon bölgesinde farenin sırtı boyunca küçük bir deri katı tutun.Şırıngayı, eğimli ucu yukarı bakacak ve iğne cilde paralel olacak şekilde cilde yerleştirin. Ardından, iğnenin bir kan damarına girmediğinden emin olmak için şırınga pistonunu geri çekin. Geri basıncı en aza indirmek için, cilt içinde bir cep oluşturacak şekilde iğneyi nazikçe sağa ve sola hareket ettirin.Ardından sensörleri enjekte edin ve şırıngayı nazikçe çıkarın. Enjeksiyon bölgesine hafifçe baskı uygulayın ve enjeksiyon bölgesinden sızmış olabilecek herhangi bir solüsyonu silin. Genellikle sırt boyunca eşit aralıklarla altı enjeksiyon yapılır.Farklı farelerde uygulama yapılıyorsa, hastalık bulaşmasını ve çapraz kontaminasyonu minimize etmek için iğneyi değiştirin. Enjeksiyonların ardından, nanosensörlerin eksitasyon emisyon spektrumuyla yakından eşleşen filtre setlerini kullanarak parlak alan ve floresan görüntüler elde edin. Bu işlem aynı zamanda cildin otofloresansını da minimize eder.Bu neonatal kardiyak miyositler bir lam üzerine kültüre edilmiş ve sodyum nanosensörleri ile enjekte edilmiştir. Bu floresan görüntü, 639 nanometre uyarım dalga boyunda alınmıştır. Bu, aynı hücrelerin parlak alan görüntüsüdür ve bu da ikisinin üst üste bindirilmiş halidir.Bazı sensör kümelenmeleri meydana gelmiş olsa da hücreler normal morfolojiye sahiptir. Sensörler sitozol boyunca yayılmış olup nükleer yükleme görülmemektedir. Aydınlık alan ve floresan görüntünün bu üst üste bindirilmiş hali, çıplak bir fareyle deri altı boşluğuna yapılan dokuz farklı sodyum nanosensör deri altı enjeksiyonunu göstermektedir.Masten nano-sensörlerin fabrikasyonu, uygun şekilde gerçekleştirildiğinde dakikalar içinde tamamlanabilir ve tersinir gerçek zamanlı analit akışını ölçmek için herhangi bir araştırmaya uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, biyolojik bir ortamda kantitatif ölçümler yapmak için nano-sensörlerin hücre içi veya deri altı boşluğa nasıl yükleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

fluorescent-nanoparticles-for-measurement-ion-concentration

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu yazıda, nasıl bir otomatik tarama konfokal mikroskop kullanılarak bir yüzeye immobilize bireysel DNA molekülleri izleri FRET elde açıklar.

Yüzey immobilize Biyomoleküller Tek Molekül Floresans Ölçümler için Otomatik Sistem

Damlacık tabanlı mikroakışkan platformları kHz oranları ucuza pikolitrelik, kendi kendine bölümlere damarları oluşturmak mümkün olduğundan yüksek kapasiteli deney için umut vaat eden adaylardır. Hızlı, hassas ve yüksek çözünürlüklü floresans spektroskopik yöntemleri ile entegrasyon sayesinde, bu sistemler içinde üretilen bilgilerin büyük miktarda verimli, ayıklanır, harnessed ve kullanılan olabilir.

Mikroakışkan damlacık platformları için Floresan algılama yöntemleri

Dielektrik düşük güç optik hapsi aşağıdaki kurulum yaklaşımı ayrıntıları metal film bir çift nanohole kullanarak nanopartiküller.

Nanopartiküllerin Optik Yakalama

Bu videoda, nanosensörler kullanarak gıda ve su numunelerindeki bakteriyel kirleticileri tespit etmek için kullanılan bir teknik gösterilmektedir. Hedef patojenik bakteriler, manyetik gevşeme ve floresan emisyon modalitelerinin bir kombinasyonu ile tespit edilir.

Manyeto-floresan nanosensörler kullanarak bakteriyel kontaminasyonu tespit etme

Akış sitometresi ile bağışık hücrelerin tanımlanmış alt grupları ile nanopartikül etkileşim analizi.

Sitometrisi ile Primer İmmün hücre alt Floresan Nanoparçacık Etkileşimleri Algılama

Tek flüoroforlar FIONA'sı kullanarak nanometre hassasiyetle lokalize edilebilir. Burada FIONA tekniğin bir özet bilgi ve nasıl Fiona deneyleri tarif edilir.

Bir nanometre Hassasiyet Floresans Görüntüleme (Fiona)

in vivo görüntüleme için floroforların kullanımı, opsonizasyon, hızlı klirens, düşük saptama hassasiyeti ve konakçı üzerindeki sitotoksik etkiler nedeniyle büyük ölçüde sınırlanabilir. Floroforların lipozomlardaki film hidrasyonu ve ekstrüzyon ile kapsüllenmesi, floresan söndürme ve korumaya yol açar, bu da yüksek algılama hassasiyeti ile in vivo görüntülemeyi mümkün kılar.

Aracı Olarak bir lipozomal-kapsüllü Yakın-Kızılötesi floroforun Floresan-söndürme İn Vivo Optik Görüntüleme

Bu el yazması, floresan işaretli nanopartiküllerin doğrudan canlı hücrelerde endositozundan sonra hücre içi gen ekspresyonunun saptanmasına izin veren yeni bir tekniği tanımlamaktadır. Yöntem, hücrelerin manipülasyonunu gerektirmez ve hedef gen veya türe göre sınırlı değildir.

Floresan etiketli Nanopartiküller kullanma Fare, İnsan ve domuz Menşe Canlı hücreler hücre içi Gen İfade Algılama

pH'ya duyarlı bir florofor ile bir membran proteinin hücre dışı alanını Etiketleme, superecliptic pHluorin (SEP), hücre içi lokalizasyonu, sentezleme ve trafik saptanmasına olanak sağlamaktadır. Görüntüleme toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) proteinleri Eylül-etiketli periferal ER ve plazma membranı protein seviyelerinin ölçümü sağlar.

pHluorin etiketli Reseptör kullanarak Subselüler Yerelleşme ve Ticareti Monitör

Burada, kuantum nokta nanoboncukların (QDNB) hazırlanması ve QDNB bazlı yanal akış immünoassay şeritleri kullanılarak hastalık biyobelirteçlerinin tespiti için bir protokol açıklıyoruz. Test sonuçları, UV ışığı aydınlatması altında kalitatif olarak değerlendirilebilir ve 15 dakika içinde bir floresan şerit okuyucu kullanılarak kantitatif olarak ölçülebilir.

Kuantum Noktaları Nano Boncuklara Dayalı Floresan Yanal Akış İmmünoassay

Öğrenin, floresan nanopartiküller kullanarak biyolojik sistemlerde iyon konsantrasyonu ölçümü için sodyum nanosensörlerinin nasıl hazırlandığını. Bu yöntem, hücre içi ve canlı hayvan modellerinde nicel analiz yapmayı mümkün kılar.

Biyolojik Sistemleri İyon Konsantrasyon Ölçümü için Floresan Nanopartiküller

Daha fazla video keşfet