Aktif Hücre Kültürü Şekil Bellek Polimerler

Bu prosedürün genel amacı, hücreleri zamanla değişen bir topografyaya sahip bir substratta kültürlemektir. Bu, önce bir şekil hafızalı polimerin hatırlanabilecek kalıcı bir şekle programlanmasıyla gerçekleştirilir. Şekil hafızalı polimer daha sonra hücrelerin daha sonra kaplandığı geçici bir şekle programlanır.

İşlemin son adımı, sıcaklığı artırarak şekil hafızalı polimerin kalıcı şekline dönmesini tetiklemektir, sonuçta floresan mikroskobu ile hücre davranışında bir değişiklik gösteren sonuçlar elde edilebilir. Merhaba, benim adım Pat Mather. Syracuse Üniversitesi'nde biyomedikal ve kimya mühendisliği profesörü ve Syracuse Biyomalzeme Enstitüsü'nün direktörüyüm.

Bu tekniğin, hücreleri germek için ticari veya özel cihazlara göre ana avantajı, tek bir polimerik sistemde, hücrelere çok çeşitli karmaşık suşlar uygulayabilmemizdir. Benim adım Jay Henderson. Biyomedikal ve Kimya Mühendisliği yardımcı doçenti ve Syracuse Biyomalzeme Enstitüsü üyesiyim.

Bu yöntem, hücrelerin fiziksel ortamlarındaki dinamik değişikliklere nasıl tepki verdiği gibi Mekanobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Benim adım Kevin Davis ve Syracuse Üniversitesi Biyomedikal Mühendisliği ve Kimya Mühendisliği Bölümü'nde doktora öğrencisiyim. Bu yöntem 2D mekanik biyoloji hakkında bilgi sağlayabilse de, doku mühendisliği için 3D şekil değiştiren iskeleler gibi diğer sistemler için de kullanılabilir.

Bu prosedürün başlamasından önce, bir cam slayt, bir milimetre kalınlığında bir Teflon ara parçası ve bir alüminyum plaka kullanarak özel bir kürleme odası hazırlayın. Başlamak için küçük bağlayıcı klipsler kullanarak hazneyi sabitleyin, NOA 63'ü 18 gauge iğne kullanarak Teflon ara parçasındaki bir delikten hazneye enjekte edin. Ardından hazneyi 125 santigrat dereceye ayarlanmış bir sıcak plakaya yerleştirin.

Haznenin ısıtılmasını takiben haznenin beş dakika boyunca eşit bir sıcaklığa ısınmasına izin verin. NOA 63'ü cam yüzeyinden 20 santimetre uzağa bir UV lambası yerleştirerek 6.5 dakika boyunca temin edin. NOA 63'ü hala sıcakken bir tıraş bıçağı kullanarak hazneden çıkarın.

Daha sonra, şekil hafızalı polimeri UV ışığı altında üç saat 40 dakika boyunca doğrudan 125 santigrat derecede sıcak plaka üzerinde kürleyin. NOA 63'ün şekil hafızasını karakterize etmek için, kürlenmiş filmi özelleştirilmiş bir zımba ile sıcak presleyerek bir dambıl örneği hazırlayın. Son olarak, numuneyi çekme fikstürüne sahip dinamik bir mekanik analizöre koyun.

Cihazı kontrollü modu zorlamaya ayarlayın ve test prosedürünü bu videoya eşlik eden yazılı protokolde bulunduğu gibi programlayın. Prosedürün sonucu, izotermal olarak kürlenmiş şekilli hafızalı polimer veya SMP filmdir, CSMP'yi sıcak bir plakaya yerleştirin ve modülü azaltmak ve kesmeyi kolaylaştırmak için sıcaklığı cam geçiş sıcaklığından daha yükseğe ayarlayın. İzotermal olarak kürlenmiş s ve p filminden ayrı numuneler hazırlamak için.

S ve p filmini bir ustura ile istenen numune boyutuna kadar kesin. Geçici şekil birkaç farklı şekilde düzeltilebilir. Burada. Geçici bir topografyayı kabartmak için ısıtılabilen ve soğutulabilen plakalara sahip bir tezgah üstü hidrolik pres kullanılır.

İlk olarak, PLA'ların sıcaklığını tg'nin üzerindeki bir sıcaklığa ayarlayın. Bu gösteri için, geçici bir paralel oluk şekli üretmek için bir vinil plak üzerinde epoksinin kürlenmesiyle bir kabartma yapıldı. Kabartma makinesi diğer malzemelerden ve farklı topografyalarla yapılabilir, ancak NOA 63'ten daha sert olmalıdır.

Kabartma sıcaklığında, s ve p örneklerini kabartma makinesinin üzerine bakacak şekilde yerleştirin. Ardından numuneleri ve kabartmayı prese yerleştirin. Isıtma PLA'ları arasında temas sağlamak için yaklaşık 100 kilo paskal ön yük uygulayın ve numunelerin homojen bir sıcaklığa ulaşmasını sağlamak için numuneler yaklaşık beş dakika bekletin.

Düzgün bir sıcaklığa ulaşıldığında, numunelere bir ila altı megapaskal uygulayın ve bir dakika bekleyin. SMP kırılacak. Daha büyük bir stres uygulanırsa.

Daha küçük genliklere sahip topografyaları tanıtmak için daha küçük gerilimler uygulayın. Basınç uygulandıktan sonra, pres plakalarının su soğutma özelliğini kullanarak sıcaklığı TG'nin altına düşürün. Sıcaklık tg'nin altına düştüğünde, aktif hücre kültürü deneyine başlamadan önce uygulanan kuvveti kaldırın.

Biyolojik güvenlik kabininin UV ışığı, numuneleri sterilize etmek için kullanılır. Numuneleri kapaksız steril kaplara yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirin ve UV ışığını altı saat boyunca açın. Ardından numuneleri yüzü yukarı bakacak şekilde yeni steril kaplara çevirin.

UV ışığını altı saat daha açın. Numunelerin, hücrelerle kaplanmadan önce nispeten kararlı bir duruma dengelenmesi gerekir. Numuneleri 96 oyuklu bir plakaya yerleştirin ve 150 mikrolitre tam büyüme ekleyin.

Kuyu başına orta. İstenilen kısmi geri kazanıma ulaşana kadar plakayı% 5 CO2 ile 30 derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Bu gösteri için, hücreleri hizalamak için yeterince büyük bir genlik üretmek için numuneler 30 saat inkübe edilir.

Kısmi geri kazanım sağlandıktan sonra, numuneler hücrelerle kaplanabilir. Numuneleri yeni bir 96 kuyulu plakaya yerleştirin. Daha sonra buradaki örneklerin her birine 150 mikrolitre hücre çözeltisi ekleyin, C3 H 10 t ve buçuk.

Çoğu embriyonik fibroblast, mililitre başına 20.000 hücrede kullanılır. İzole edilmiş hücreler elde etmek için, hücrelerin 30 santigrat derecede 9,5 saat inkübe ederek geçici topografyaya yapışmasına ve yayılmasına izin verin. Bir sonraki tahlil, geçişten önce numuneleri çıkararak ve numunelerin boyama ve floresan görüntülemesini gerçekleştirerek hücre morfolojisini analiz edin.

Bu malzeme, spektrumun uzak kırmızı ucundaki UV ve görünür aralık floro dörtlülerinin çoğunda otofloresan sergiler, örneğin Alexa Fluor 6 47, numunelerin geri kazanılmasını tetiklemek için arka planı azaltmak, plakayı 37 santigrat derece inkübatöre taşımak ve 19 saat boyunca kültüre devam etmek için önerilir. Bu, malzemenin geri kazanılmasına ve hücrelerin morfolojilerini yeni topografyaya uyarlamasına izin verir. İnkübasyonu takiben, filamentli aktin görüntüleme için fallin gibi uygun boyaları uygulayın.

Son adım olarak, hücreler burada gösterilen yeni topografyada görüntülenebilir, tek bir NOA 63 tedavisinin toplu tek yönlü şekil hafızasıdır. Yıldız işaretinin deneysel başlangıcın tedavi edildiğini gösterdiği yerde üç kez tekrarlanır. NOA 63, mükemmel şekil hafızası özelliklerine sahip şeffaf, camsı bir katıdır.

Bu durumda, malzeme kürlendi ve depolama modülü düşüşünün başlangıcından itibaren belirlendiği gibi 51.1 santigrat derece tek tip bir TG gösterdi. Burada görülen gerinim düşüşü ölçülen tg'de meydana gelir. Uygulanan %4.7'lik gerinimin büyük bir yüzdesi, %89.3'lük bir sabitleme oranına karşılık gelen 20 santigrat derece boşaltıldıktan sonra sabitlendi. Sabit gerinim daha sonra ısıtma sırasında nispeten küçük bir sıcaklık aralığında %84.4'lük bir oranda geri kazanıldı.

Şekil hafızası performansı, neredeyse tamamen aynı yolu izleyen tüm eğrilerin kanıtladığı gibi, üç döngüye kadar herhangi bir bozulma göstermedi. Geçici topografyanın genliği zamanla 30 santigrat derecede 30 saat azalır. 30 santigrat derecede.

Genlik yaklaşık% 50 oranında azaltılmıştırburada sıfır zamanında belirtilmiştir. Önümüzdeki 9,5 saat içinde %10 daha azaltır. Sıcaklığın 37 santigrat dereceye çıkarılmasıyla geri kazanım tetiklendiğinde, genlik, kullanılan kabartma makinesi için 9,5 saat içinde ilk genliğin% 0,5'ine ve 4,9 megapaskal kabartma gerilimine düşer.

Bu, 13 mikrometre oluğun neredeyse düz bir yüzeye işlevsel bir şekilde değiştirilmesine karşılık gelir. Bu polimer, hücre kültürü koşulları altında 30 ila 37 derece sıcaklık aralığında geri kazanılır. Bunun nedeni, kültür ortamından su alımıdır, su plastiği, tg'yi düşüren ve 51 derecelik kuru TG'nin altındaki sıcaklıklarda geri kazanıma izin veren polimeri boyutlandırır.

Aktif hücre kültürü substratlarının kullanılmasıyla kontrol edilen bir hücre davranışının bir örneği, geçici yivli substratlar üzerindeki hücre iskeleti organizasyonundaki bir değişikliktir. Geri kazanım tetiklenmeden önce, aktin mikro filamentleri olukların yönü boyunca hizalanır. Sıcaklık artışı ile geri kazanımdan sonra, mikro filamentler yeniden düzenlendi ve rastgele yönlendirildi.

Tersine, statik, düz veya statik oluklara sahip kontrol numuneleri, sıcaklık artışından sonra yeniden düzenlenmez. Bu prosedürü denerken, kürleme odasının geometrisinin, polimerin geçiş sıcaklığının, gerinim sabitleme yönteminin ve polimerin kendisinin bileşiminin, kendi deneyinizde istenen geçişi elde etmek için ayarlanabileceğini hatırlamak önemlidir. Gerçek zamanlı PCR gibi diğer yöntemler, geliştirildikten sonra substrattan gelen mekanik stimülasyona yanıt olarak gen ekspresyonunun nasıl değiştiği gibi ek soruları yanıtlamak için kullanılabilir.

Bu teknik, hücre mekanobiyolojisi alanındaki araştırmacıların hücre hücre iskeleti, yeniden düzenleme ve yumuşak madde fiziğini iki boyutta araştırmalarının yolunu açtı. Çalışmalarımıza gösterdiğiniz ilgi için teşekkür eder ve izlediğiniz için teşekkür ederiz.