Aktif Hücre Kültürü Şekil Bellek Polimerler

Bu prosedürün genel amacı, hücreleri zamanla değişen bir topografyaya sahip bir substratta kültüre etmektir. Bu işlem, öncelikle bir şekil hafızalı polimerin hatırlanabilen kalıcı bir şekle programlanmasıyla gerçekleştirilir. Şekil hafızalı polimer daha sonra, hücrelerin daha sonra üzerine ekileceği geçici bir şekle programlanır.

Prosedürün son adımı, sıcaklığı artırarak şekil hatırlamalı polimerin kalıcı şekline dönmesini tetiklemektir; sonuç olarak floresan mikroskobu aracılığıyla hücre davranışındaki değişikliği gösteren bulgular elde edilebilir. Merhaba, ben Pat Mather. Syracuse Üniversitesi'nde biyomedikal ve kimya mühendisliği profesörü ve Syracuse Biyomalzemeler Enstitüsü direktörüyüm.

Bu tekniğin, hücreleri germek için kullanılan ticari veya özel cihazlara göre temel avantajı, tek bir polimerik sistem içinde hücrelere çok çeşitli kompleks gerinimler uygulayabilmemizdir. Benim adım Jay Henderson. Biyomedikal ve Kimya Mühendisliği bölümünde yardımcı doçentim ve Syracuse Biyomalzemeler Enstitüsü'nün bir üyesiyim.

Bu yöntem, hücrelerin fiziksel ortamlarındaki dinamik değişikliklere nasıl tepki verdiği gibi Mekanobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Benim adım Kevin Davis; Syracuse Üniversitesi Biyomedikal Mühendisliği ve Kimya Mühendisliği Bölümü'nde doktora öğrencisiyim. Bu yöntem 2D mekanik biyoloji hakkında içgörü sağlayabildiği gibi, doku mühendisliği için 3D şekil değiştiren iskeleler gibi diğer sistemler için de kullanılabilir.

Bu prosedüre başlamadan önce; bir lam, bir milimetre kalınlığında bir Teflon ara parçası ve bir alüminyum plaka kullanarak özel bir kürleme odası hazırlayın. Odayı küçük ataçlarla sabitleyin; ardından 18 gauge bir iğne kullanarak, Teflon ara parçadaki bir delikten NOA 63'ü odanın içine enjekte edin. Sonrasında odayı 125 °C'ye ayarlanmış bir sıcak plakaya yerleştirin.

Kabin ısıtmasının ardından, kabinin beş dakika boyunca tekdüze bir sıcaklığa ulaşmasını bekleyin. Bir UV lambasını cam yüzeyden 6,5 santimetre uzağa yerleştirerek NOA 63'ü 20 dakika boyunca kürleyin. NOA 63'ü, henüz sıcakken bir jilet yardımıyla kabinden çıkarın.

Ardından, şekil hafızalı polimeri 125 °C sıcaklıktaki sıcak plaka üzerinde doğrudan UV ışığı altında üç saat 40 dakika boyunca kürleyin. NOA 63'ün şekil hafızasını karakterize etmek için, kürlenmiş filmi özel bir zımba ile sıcak presleyerek bir dumbbell numune hazırlayın. Son olarak, numuneyi çekme aparatlı bir dinamik mekanik analizöre yerleştirin.

Cihazı kuvvet kontrollü moduna getirin ve bu videoya eşlik eden yazılı protokolde belirtilen test prosedürünü programlayın. Prosedürün sonucu, izotermal olarak kürlenmiş şekil bellekli polimer veya SMP filmdir; modülü düşürmek ve kesimi kolaylaştırmak için CSMP'yi bir ısıtıcı plaka üzerine yerleştirin ve sıcaklığı cam geçiş sıcaklığının üzerine ayarlayın. İzotermal olarak kürlenmiş SMP filmden bireysel numuneler hazırlamak için.

s ve p filmi bir jilet yardımıyla istenen numune boyutuna göre kesin. Geçici şekil birçok farklı yöntemle sabitlenebilir. Burada, geçici bir topografya oluşturmak (kabartma yapmak) için ısıtılabilen ve soğutulabilen plakalara sahip bir masaüstü hidrolik pres kullanılmıştır.

İlk olarak, PLA'ların sıcaklığını tg değerinin üzerinde bir sıcaklığa ayarlayın. Bu demonstrasyon için, paralel oluklardan oluşan geçici bir form elde etmek amacıyla bir vinil plak üzerine epoksi kürlenerek bir kabartıcı hazırlanmıştır. Kabartıcı diğer malzemelerden ve farklı topografyalarda yapılabilir, ancak NOA 63'ten daha sert olmalıdır.

Kabartma sıcaklığında, s ve p örneklerini yüzleri aşağı bakacak şekilde kabartma makinesine yerleştirin. Ardından örnekleri ve kabartma makinesini prese yerleştirin. Isıtıcı PLA'lar ile örnekler arasında temas sağlamak için yaklaşık 100 kilo pascalcals ön yükleme uygulayın ve örneklerin tekdüze bir sıcaklığa ulaşması için yaklaşık beş dakika bekleyin.

Homojen bir sıcaklığa ulaşıldığında, numunelere bir ila altı megapaskal basınç uygulayın ve bir dakika boyunca bekletin. SMP kırılacaktır. Eğer daha yüksek bir stres uygulanırsa.

Daha küçük amplitüdlere sahip topografyalar oluşturmak için daha düşük stresler uygulayın. Basınç uygulandıktan sonra, pres plakalarının su soğutma özelliğini kullanarak sıcaklığı TG'nin altına düşürün. Sıcaklık tg'nin altına indiğinde, aktif hücre kültürü deneyine başlamadan önce uygulanan kuvveti kaldırın.

Biyolojik güvenlik kabininin UV ışığı, örnekleri sterilize etmek için kullanılır. Örnekleri kapaksız steril kaplara yüzleri aşağı gelecek şekilde yerleştirin ve UV ışığını altı saat boyunca açık tutun. Ardından örnekleri, yüzleri yukarı bakacak şekilde yeni steril kaplara aktarın.

UV ışığını altı saat daha açık tutun. Örneklerin, hücrelerle ekim yapmadan önce nispeten kararlı bir duruma gelmesi gerekir. Örnekleri 96 kuyucuklu bir plakaya yerleştirin ve 150 µL tam büyüme ortamı ekleyin.

Kuyu başına besiyeri. İstenen kısmi geri kazanım sağlanana kadar plakayı %5CO2 içeren 30 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Bu gösterim için, hücreleri hizalamak amacıyla yeterince büyük bir genlik oluşturmak için örnekler 30 saat boyunca inkübe edilmiştir.

Kısmi geri kazanım sağlandıktan sonra, örneklere hücre ekimi yapılabilir. Örnekleri yeni bir 96 kuyucuklu plakaya yerleştirin. Ardından her bir örneğe 150 µL hücre solüsyonu ekleyin, C3 H 10 t ve yarım.

Embriyonik fibroblastların çoğu mililitre başına 20.000 hücre olacak şekilde kullanılır. İzole hücreler elde etmek için, hücrelerin geçici topografyaya tutunup yayılmasına izin vermek amacıyla 30 °C'de 9,5 saat inkübe edin. Ardından, örnekleri çıkararak boyama ve floresan görüntüleme işlemlerini gerçekleştirip geçiş öncesinde hücre morfolojisini analiz edin.

Bu materyal, UV ve görünür ışık spektrumunun büyük bir kısmında otofloresans sergiler; arka planı azaltmak için spektrumun uzak kırmızı ucundaki Alexa Fluor 647 gibi floroforların kullanılması önerilir. Örneklerin toparlanmasını tetiklemek için plakayı 37 °C'lik bir inkübatöre taşıyın ve kültüre 19 saat boyunca devam edin. Bu işlem, materyalin toparlanmasına ve hücrelerin morfolojilerini yeni topografyaya uyarlamasına olanak tanır. İnkübasyonun ardından, filamentöz aktin görüntüleme için phalloidin gibi uygun boyalar uygulayın.

Son adım olarak, hücreler görüntülenebilir; burada gösterilen yeni topografya, tek bir NOA 63 kürlemesinin kütle tek yönlü şekil hafızasıdır. Yıldız işaretinin deneysel kürleme başlangıcını belirttiği işlem üç kez tekrarlanmıştır. NOA 63, mükemmel şekil hafıza özelliklerine sahip, şeffaf, camsı bir katıdır.

Bu vakada, materyal kürlenmiş olup depolama modülündeki düşüşün başlangıcından belirlendiği üzere 51,1 °C'lik homojen bir TG göstermektedir. Burada görülen gerinim düşüşü, ölçülen tg değerinde meydana gelmektedir. Uygulanan %4,7'lik gerinimin büyük bir kısmı, 20 °C'lik boşaltma sonrası %89,3'lük bir sabitleme oranına karşılık gelecek şekilde sabitlenmiştir. Sabitlenen gerinim daha sonra ısıtma sırasında nispeten dar bir sıcaklık aralığında %84,4'lük bir oranla geri kazanılmıştır.

Tüm eğrilerin neredeyse tamamen aynı yolu izlediği görülerek, şekil hafıza performansının üç döngüye kadar herhangi bir bozulma göstermediği kanıtlanmıştır. Geçici topografyanın genliği, 30 °C'de 30 saat boyunca zamanla azalmaktadır. 30 °C'de.

Genlik, burada zaman sıfırında belirtildiği üzere yaklaşık %50 oranında azaltılmıştır. Sonraki 9,5 saat boyunca %10 daha azalmaktadır. Sıcaklığın 37 °C'ye yükseltilmesiyle geri kazanım tetiklendiğinde; kullanılan kabartıcı ve 4,9 MPa'lık bir kabartma gerilimi için genlik, 9,5 saat içinde başlangıç genliğinin %0,5'ine düşmektedir.

Bu durum, 13 µm kanallardan neredeyse düz bir yüzeye doğru gerçekleşen fonksiyonel bir değişime karşılık gelir. Bu polimer, hücre kültürü koşulları altında 30 ile 37 °C sıcaklık aralığında geri kazanım sağlar. Bu durum, kültür ortamından su alımından kaynaklanmaktadır; su polimeri plastikleştirerek Tg değerini düşürür ve böylece 51 °C olan kuru Tg değerinin altındaki sıcaklıklarda geri kazanımın gerçekleşmesine olanak tanır.

Aktif hücre kültürü substratlarının kullanımıyla kontrol edilen bir hücre davranışı örneği, geçici oluklu substratlar üzerindeki hücre iskeleti organizasyonundaki değişimdir. Toparlanma tetiklenmeden önce, aktin mikrofilamentleri olukların yönüne göre hizalanır. Sıcaklık artışıyla gerçekleşen toparlanmanın ardından, mikrofilamentler yeniden organize olmuş ve rastgele yönelmişlerdir.

Aksine, statik, düz veya statik oluklara sahip kontrol örnekleri, sıcaklık artışından sonra yeniden organize olmazlar. Bu prosedürü uygularken; kürleme odasının geometrisinin, polimerin geçiş sıcaklığının, gerinim sabitleme yönteminin ve polimerin kendi bileşiminin, bu prosedürü takip eden kendi deneyinizde istenen geçişi sağlamak için ayarlanabileceğini unutmamak önemlidir. Gelişiminden sonra, substrattan gelen mekanik stimülasyona yanıt olarak gen ekspresyonunun nasıl değiştiği gibi ek soruları yanıtlamak için gerçek zamanlı PCR gibi diğer yöntemler kullanılabilir.

Bu teknik, hücre mekanobiyolojisi alanındaki araştırmacıların hücre iskeletini, yeniden düzenlenmeyi ve yumuşak madde fiziğini iki boyutta incelemelerinin yolunu açmıştır. Çalışmamıza gösterdiğiniz ilgi için teşekkür eder, izlediğiniz için teşekkürler.