Name: Düşük Maliyetli Cryo-Işık Mikroskopi Sahne İmalatı İlişkili Işık / Elektron Mikroskopi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Öğrenin, düşük maliyetli bir kriyojenik sahne imalatını ve kriyojenik ışık ile elektron mikroskobisi arasında korelasyonlu görüntüleme yöntemini. Bu yöntem, donmuş hidrate hücrelerde floresan bilgi toplamak için ekonomik ve güvenilir bir çözüm sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, bu çalışmada kullanılan bu maya nesilin erişim sağlamak için Brandon J. Zipp ve Ken B. Kaplan teşekkür etmek istiyoruz. Yazarlar ayrıca Julio Lenin Dominguez-Ramirez videoya ile yardım için teşekkür ederim. JEE NIH fon desteği hibe sayısı 5RC1GM91755 kabul eder.

1. Imalat ve montaj <ol><li> Şekil 1c gösterildiği gibi. 22,96 cm (9 ") pasta pan pan tarafında yaklaşık 2 cm, siyah bir marker kalem, alüminyum heatsink işareti delikleri Not kullanma içinde alüminyum heatsink Yeri: Eğer alüminyum blok (yerel bir hurda metal dükkanı veya çevrimiçi satın <a href="http://www.onlinemetals.com">http://www.onlinemetals.com</a> ) ön delikli gelmez, delik delinmiş ve alüminyum güvence altına almak için 1 adım önce gömme düzenlemek için ihtiyacınız olacak pasta tava blok nitrojen gaz kabarcıkları alüminyum altından kaçmasına izin için, platform ve 4 ekstra delikler blok güvence altına almak için 5 delik. </li><li> Alüminyum ısı lavabonun bulunduğu yere yakın cryo-grid kutusu yerleştirin ve çentik ve her iki tarafın işareti. </li><li> Alüminyum heatsink delikler için, # 17 matkap ucu ve # 35 cryo-Grid kutusu delikler için bir matkap ucu kullanarak her işaretli pozisyon için pilot delikler delin. </li><li> Mount 5 kullanılarak alüminyum heatsink - # 10, 1.9 cm (3 / 4 ") düz kafa oluklu cıvata ve uygun somun gibi 15 - # 10 pullar iki alüminyum blok altında pullar ve arka üçüncü. Her delik Not pasta tava izleme alanı yakınında alüminyum blok Teminatsız çıkıntılar sahne görüntüleme yetenekleri sınırı titreşimler neden olabilir: Tüm montaj cıvataları iyice sıkılmış olduğundan emin olmak için kontrol edin. </li><li> Takın 3 - # 4, 0.95 cm (3 / 8 ") arka cryo-ızgara kutusu montajı olarak hareket pasta tava, oluklu cıvata ve ilgili fındık yuvarlak. </li><li> 4 çubuklarını başka bir tepesinde bir Çubuk ile çiftleri birlikte Teyp. Kek tavada ters kenarlarına Şerit ayırıcılar olarak hareket etmek her çift. </li><li> Islak kek ve pasta alt ve üst yüzey GKD 2 O. ile sırasıyla tava </li><li> Sprey köpük yalıtım iki kat kek tava ile doldurun. Sonraki adıma geçmeden önce her bir katmanı Islatma. </li><li> Köpüğe pasta tava basın. </li><li> Tava baş aşağı çevirin ve ayırıcılar pasta tava başvurun kadar kek tava basın. Kek tava tepesinde herhangi bir ağırlıklı nesne yerleştirin ve tedavi etmek için bir gece bekletin. </li><li> Tırtıklı bıçak ile, aşırı kuru tava kenarından sprey köpük yalıtım kesip çubuklarını kaldırmak. </li><li> Kek pasta pan pan çıkarın. Alüminyum ısı lavabo pasta tava şimdi yalıtılmış ve "kriyojenik sahne" (Şekil 1a) olarak sevk edilecektir. </li><li> Kriyojenik sahne üstünden şeffaf plastik bir panoya (herhangi bir renk ve daha fazla 3 mm kalınlığında) yerleştirin. Siyah bir işaret, tek bir turda cryo-grid çapı yaklaşık 1.5 kat bir daire çizerek cryo-ızgara kutusu montaj konumu ile işaretleyin. 1.9 cm (3 / 4 ") kesip delik delik gördüm. Bu panoya olarak sevk edilecektir" yükleme ekranı "(Şekil 1b). </li><li> Kriyojenik sahne ve objektif lensleri altında doğrudan ısı lavabo mikroskop yer tepesine yeni bir şeffaf panoya koyun. Döndürme gibi siyah bir belirteç ile hedeflerin yolunu işaretleyin. </li><li> Pano kenarından bir yarım daire çıkarmadan işaretlenen hat boyunca kesin. Bu bir yapboz veya video gösterildiği gibi delik birden çok kez gördüm 7,62 cm (3 ") kullanılarak yapılabilir. </li><li> Sonunda çanağı alanı içinde yarım daire uzakta ama yine de 1.9 cm (3 / 4 ") delik kesti. Seviyeleri düşer görüntüleme Bu panoya sevk edilecektir ise sıvı azot dolumu (LN 2) Bu bağlantı noktası olacak "izleme ekranı" (Şekil 1c). </li></ol> 2. Numune Hazırlama <ol><li> 1x10 6 hücre / mL su uygun bir konsantrasyon sentetik tam (SC) medya yetişen günlük faz maya hücreleri sulandırınız. </li><li> Seyreltilmiş maya 2 mL R2 / 1 400 örgü holey karbon kaplı bakır cryo-EM ızgara (SPI Malzemeleri, West Chester, PA) üzerine pipetlenebilir ve emilmesi için 15 saniye izin verilir. </li><li> 2 saniye için yumuşak selüloz doku yırtılmış parça (Kimwipe) ızgara arkasına dokunarak ızgara yüzeyinden uzakta aşırı sıvı Blot. </li><li> Gerekirse, ızgara, 3 su damlaları mcL (1-3 kez), ve kötü uzakta 3. adımda arka blot ile yıkanmalıdır. </li><li> Son yıkama önce, örnek pnömatik dalma dondurucu içine yüklenen ve asılı ızgara adım 2.4 gibi yıkanır. Su yüzeyinden çoğunluğu kaldırmak için yırtık kağıt mendil (Kimwipe) ızgara blot sonra, ızgara sıvı etan soğutmalı LN 2 içine daldı ve bir depolama Not 1 cryo-grid kutusuna aktarılır: önemlidir. numune nemli tutmak için, mümkün olduğunca ince sıvı bir tabaka yüzeyde bırakın. Yanlış blot ya örnek kurumasına veya elektron ışını opak buz terk edecektir. </li></ol> 3. Cryo-Işık Mikroskopi <ol><li> Kriyojenik aşaması ile doldurunLN 2 ve hızlı yükleme ekranı ile (1.9 cm (3 / 4 ") tek delik ile plastik panoya) kapsar . </li><li> Metal parçası A5 açıklanan 3 vida ile monte 1.9 cm (3 / 4 ") yükleme ekranında ve transfer delik içine cryo-grid transfer, LN 2 sıcaklık ulaşır. Sökün cryo-grid onun sahibinin ve iyileştirilmiş erişim için tutucu kaldırmak adım 3.10 kadar ayrı bir Dewar cryo grid sahibi LN 2 altında tutun. cryo-grid kutusu da örnek ızgara ısınmayı önlemek için LN 2 altında tutulmalıdır. </li><li> Yedek sadece alüminyum ısı lavabo üst altında kriyojenik aşamasında LN 2 Not: LN 2 düzeyleri periyodik olarak kontrol ve LN 2 ısı lavabo ile sürekli temas sağlamak için görüntüleme işlemi sırasında yenilenmeleri gerekir. Genel olarak, dolum görüntüleme ekranı dolgu bağlantı noktası üzerinden her 10 dakikada oluşur. </li><li> LN 2 Pre-serin cımbız ucu, daha sonra 1.9 cm (3 / 4 ") yükleme ekranı delik kullanarak, cımbız ile alüminyum ısı lavabo düz görüntüleme yüzeye ızgara (ler) aktarmak. </li><li> Yansıyan ışık mikroskobu objektif diyafram altında dikkatlice cryo aşamalı taşımak. </li><li> Yükleme ekranı tepesinde şeffaf izleme ekranı yerleştirin. Sonra yavaş yavaş, görüntüleme ekranı Not altına kaydırarak yükleme ekranı kaldırmak: Bu noktada, örnek, en savunmasız. Mikroskop etrafında bulunan tüm hava akımları da dahil olmak üzere minimize edilmelidir: Yakın bir yerde kapı açma, insanlar geçmiş yürüyüş, solunum, vb Biz bir yüz maskesi giymiş veya bir tedbir olarak mikroskop göz mercekleri altında şeffaf bir yüz maskesi asılı öneririz. </li><li> Cryo kademeli ve düz bir ısı emici izleme alanı örnek için tarama soğuk azot gazı ortama objektif lensleri döndürün. Izgara üzerinde standart parlak bir alan ışık mikroskopi teknikleri odak merkezini bulmak ve genel bir görüntü almak için düşük bir büyütme amacı ile kullanarak. Bu deney için kullanılan ışık mikroskobu lensler ile ilgili Özellikler Deneysel Malzeme bölümünde listelenen Not: LN 2 nesnel lensler ile temas gelmez ve biz, soğutma etkilerinden görüntü veya lenslerin zarar bozulması henüz görmedik. . </li><li> Bir ilgi alanında yüksek büyütmeli Odak ve aydınlık alan, karanlık alan, polarize ışık veya floresan görüntüleme veri almak. Gelecek korelasyon düşük büyütme parlak bir alan görüntü, ilgi alanın konumunu kaydetmek için emin olun. LN 2 dolumu için yukarıda listelenen tüm önlemleri takip edilirse, daha sonra buharlaşan azot pozitif basınç görüntüleme süresi için bir kontaminasyon ortamda (oda nem bağımsız) korumak için yeterli. </li><li> Bittiği zaman, yükleme ekranında görüntüleme ekranın üst üzerinde kaydırarak değiştirin. Yükleme ekranının altında kaydırarak yavaşlatarak görüntüleme ekranı çıkarın. </li><li> Mikroskop cryo sahne çıkarın ve önceden soğutulmuş cımbız, cryo-grid kutusuna geri ızgara transfer. Çevreye karşı mühür ve LN2 Dewar sahibinin, depolama ve gelecekteki görüntüleme için transfer etmek cryo-ızgara kutusu içine cryo grid sahibi vidalayın. </li></ol> 4. Cryo-Elektron Mikroskobu <ol><li> Her zaman sıvı azot sıcaklığında numune tutarken, standart ve yerleşmiş teknikleri, bir cryo-EM transfer sahibinin örnek ızgara içine yerleştirin. </li><li> Transmisyon Elektron Mikroskobu örnek ızgara ile kriyo sahibi yerleştirin. </li><li> Uygun bir düşük büyütme (50 500x, nominal büyütme), örnek ızgara merkezinde bulabilirsiniz. </li><li> Izgara merkezi bakır sekmeleri göreli bir yönünü (Şekil 2'de açıklandığı gibi) belirlemek ve korelasyon için kesin ilgi alanları belirlemek için adım 3,7 'den daha önce toplanan düşük büyütme cryo-LM veri kullanın. </li><li> Mikroskop hizalama, düşük doz cryo-EM görüntüleme ve veri toplama ile devam edin. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Kriyojenik aşamada (Şekil 1a) cryo-LM cryo floresan mikroskopi ve bağlaşık cryo-LM/cryo-EM analiz için veri toplamak için etkili bir yoldur. Şekil 2, düşük ve yüksek büyütme cryo-LM görüntüleri kombinasyonu cryo-EM belirli alanlarda doğrudan referans haritalar oluşturmanıza olanak verir nasıl gösterir. Cryo-LM referans haritası (Şekil 2b), Şekil 3'te gösterildiği gibi tam bölgeleri bulmak için cryo-EM veri toplama sırasında kullanılmıştır. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 Kriyojenik Sahne) kriyojenik sahne düzeni monte w belirtilen bir cryo-grid transferi oluşuri. beyaz bir ok ve bir alüminyum heatsink. Izgaralar, cryo-grid kutusundan LN 2 kapsamında aktarılır ve siyah ok ile gösterildiği gibi doğrudan ısı emici görüntüleme alanına yerleştirilir. B) Görüntü yükleme ekranı ile kriyojenik sahne betimleyen . Bir liman örnekleri aktarmak ve cımbız ile ısı emici örnek izleme alanı cryo-grid örnekleri hareket c) kriyojenik olarak yükleme ekranı delik cryo-Grid kutusu montaj ve eylemleri üzerinden doğrudan yerleştirilir yerinde izleme ekranı ile objektif lensler altında pozisyon sahne. Görüntüleme ekranında özel kesme nesnel lensler kriyojenik aşamada hareket ettirmeden kolayca yerleştirin salıncak sağlar. Örnek alanın uzak görüntüleme ekranındaki delik LN 2 doldurmak gerekirse LN 2 seviyeleri doldurmak için bağlantı noktası olarak görür. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 cryo-LM bağıntılı çalışmalar için gezinme. Maya hücreleri a) Düşük büyütme cryo-LM bir örnek ızgara yapıştırılır. B) 'de aynı görüntü (a) bir ilgi alanı yüksek bir büyütme floresan görüntü ile kaplanmış ve dolu bir portakal çokgen ile örnek ızgara merkezi işareti. Merkezi dört ekstra bir metal sekmesini ve dördüncü açık olan meydanlar, üç bir grup oluşur. Ekstra bir metal sekmesinde üç kare, asimetrik bir merkez oluşturan kısa ve uzun eksenleri hakkında iki çift sekme paylaşın. Bu asimetrik merkez sol üst köşesinde görülebilir ve cryo-LM ve cryo-EM arasında ızgara dönme açısı ve ellilik belirtmek için kullanılır oldu. Faiz, düşük bir büyütme görüntü birçok alanda itibaren işaretlenir ve cryo-EM aynı alanları bulmak için bir referans haritası olarak kullanılır. C), (b) ilgi alanı büyütülmüş floresan cryo-LM görüntü . HTA1-CFP, c-terminal CFP histon işaretleyici, çekirdeğin konum etiketleme yeşil noktalı bir yapı olarak görülebilir. D) karşılık gelen alan cryo-EM görüntü (c) Ölçek bar, 50 mikron temsil eder . <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 cryo-LM ve cryo-EM Korelasyon aynı maya hücreleri betimleyen iki alan görüş (c, f cryo parlak alan (d), cryo-floresans (b, e) ve cryo-EM ile korele 5 mikron). Ölçek bar temsil eder.

<ol><li>Dubochet, J., Adrian, M., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+biological+speciments%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitrified biological speciments.</a> Trends Biochem. Sci. 10, 143-146 (1985).</li>
<li>Plitzko, J. M., Rigort, A., Leis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+cryo-light+microscopy+and+cryo-electron+tomography%3A+from+cellular+territories+to+molecular+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Correlative cryo-light microscopy and cryo-electron tomography: from cellular territories to molecular landscapes.</a> Curr Opin Biotechnol. 20, 83-89 (2009).</li>
<li>Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-fluorescence+microscopy+facilitates+correlations+between+light+and+cryo-electron+microscopy+and+reduces+the+rate+of+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching.</a> J Microsc. 227, 98-109 (2007).</li>
<li>Lepper, S., Merkel, M., Sartori, A., Cyrklaff, M., Frischknecht, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+quantification+of+the+effects+of+blotting+for+correlation+of+light+and+cryo-light+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Rapid quantification of the effects of blotting for correlation of light and cryo-light microscopy images.</a> J Microsc. 238, 21-26 (2010).</li>
<li>Sartori, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+microscopy%3A+bridging+the+gap+between+fluorescence+light+microscopy+and+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography.</a> J Struct Biol. 160, 135-145 (2007).</li>
<li>McDonald, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+high-pressure+freezing+preparation+techniques+for+correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+same+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues.</a> J Microsc. 235, 273-281 (2009).</li>
<li>van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+correlative+cryo-fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+applied+to+whole+mitochondria+in+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells.</a> Eur J Cell Biol. 88, 669-684 (2009).</li>
<li>Gaietta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+and+electron+microscopic+imaging+of+connexin+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking.</a> Science. 296, 503-507 (2002).</li>
<li>Sosinsky, G. E., Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Gaietta, G. M., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+for+correlated+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Markers for correlated light and electron microscopy.</a> Methods Cell Biol. 79, 575-591 (2007).</li>
</ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarının beyan ederim.

<p class="jove_content"&gt; Bizim kriyojenik sahne ve numune hazırlama teknikleri, cryo-LM ve cryo-EM arasında bağıntılı çalışmalar da dahil olmak üzere, ancak bunlarla sınırlı olmayan yaklaşımlar geleneksel oda sıcaklığı üzerinde birçok faydaları sergilerler: hızlı sabitleme<sup&gt; 1,2</sup&gt; Photobleaching azaltılmış<sup&gt; 3</sup&gt; Ve cryo-EM önce örnek bütünlüğünü tarama<sup&gt; 4,5</sup&gt; Ya da kimyasal tespiti / gömme<sup&gt; 6</sup&gt;. Cryo-EM veri toplama için darboğazlardan biri TEM örnek aktarımı ve görüntü uygun bölgelerde bulmak için ızgaranın her iki tarama için gerekli zaman. Cryo-LM hızlı veri toplama ile<sup&gt; 5</sup&gt; Zaman iyi hücreleri bulmak harcanan büyük ölçüde azaltılabilir. Böylece, hem zaman ve paradan tasarruf ve öncesi tarama ve cryo-LM ilgi alanlarının haritalanması bu darboğaz azaltmak.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Daha pahalı ya da karmaşık kriyojenik aşamalarında daha yüksek çözünürlüklü cryo-LM görüntüleme izin verebilir. Ancak, burada fabrikasyon aşamasında daha pek çok uygulama için yeterli. Cryo-LM görüntüleme ve örnek ızgara transferleri metin ve video açıklandığı gibi dikkatle yapılması halinde, tam kirlenme ücretsiz görüntüleme yapılabilir. Bu yöntem, aynı hücre, organel ya da makromoleküler kompleksi floresan ve elektron mikroskobu verileri doğrudan bir ilişki karbon destek dağınık ya da ince bir doku bölümünde içinde yer sağlar<sup&gt; 7</sup&gt;. Bu kriyojenik sahne değer bir bütün olarak ışık mikroskobu alanına cryo-LM/cryo-EM korelatif çalışmaların ötesine uzanan dikkat edilmelidir. Bu kriyojenik aşamada hassas örnekleri ve fluorofor boyalar / lekeleri için uygundur<sup&gt; 8</sup&gt; Quantum noktaları veya floresan etiketli proteinlerin<sup&gt; 9</sup&gt; Paraformaldehid glutaraldehit ve oda sıcaklığında kimyasal fiksasyon ve gömme sırasında kararsız olabilir. Sonuç olarak, biz bu kriyojenik aşamada, önce maliyet ve yetersiz erişim deterred edilmiştir cryo-LM, ilgilenenler daha yüksek erişim sağlayacağını umuyorum.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; Sorun Giderme Cryo-Işık Mikroskopi</em</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; 1. Örnek Adsorpsiyon:</em&gt; Farklı örnekleri karbon destek değişken adsorbsiyon özellikleri gösterebilir. Destek ızgaraları gibi sürekli karbon, holey karbon veya numune desteği için formvar kaplı ızgaraları gibi diğer türleri kullanmak gerekli olabilir. Ayrıca, örnek ızgara ve karbon yüzey bakır çubuk bağlayıcı ise, karbon yüzey kimyası, ızgara ıslatıcı ile inkübe veya parlaklık örnek ek önce boşaltma ayarlamak için gerekli olabilir.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; 2. Sahne istikrar:</em&gt; Titreşim fark ederseniz, büyük olasılıkla ağırlığı yerine LN2 köpürme aşırı örnek aşamasına kaynaklanmaktadır. Kriyojenik aşamada ek bir ağırlık, bazen düşük frekanslı titreşimleri, standart 3-eksenli seyahat mikroskop sahne boyunca iletmek için neden ve bulanıklık aracılığıyla görüntüleme olumsuz etkileyebilir. Bu videoda gösterildiği gibi, mikroskop altında çift vida silah ile ayarlanabilir bir mini asansör veya ayarlanabilir bir adaptör ile seyahat aşamasında destekleyen kolayca düzeltilebilir. Her ikisi de bu ayarlanabilir destek mekanizmaları seyahat aşamasında olmayan bir hareketli kısmı ile etkileşime girer ve bu nedenle hala görüntüleme için gerekli olarak X ve Y ekseni çeviri izin verir.</p

Özel reaktifler ve ekipman Tablo: <table border="1"><tbody><tr><th> Isim </th><th> Şirket </th><th> Katalog # </th><th> Yorumlar </th><th> Maliyet </th></tr><tr><td> 1 - 22,86 cm (9 &quot;) eğimli kenarı ile pasta tava </td><td> İyi Cook </td><td></td><td> Yerel bakkal </td><td> 4,39 $ </td></tr><tr><td> 1 - 22,86 cm (9 &quot;) kek tava </td><td> İyi Cook </td><td></td><td> Yerel bakkal </td><td> 4,93 $ </td></tr><tr><td> Çubuklarını, 4 çift </td><td></td><td></td><td> Yerel bakkal </td><td> 0,50 $ </td></tr><tr><td> 1 - Büyük sayfalar sprey köpük </td><td> Büyük sayfalar </td><td></td><td> Yerel nalburdan </td><td> 5,98 $ </td></tr><tr><td> 1 - 4cm x8cm x1cm alüminyum blok </td><td></td><td></td><td> Yerel nalburdan veya metal hurda bahçesinde </td><td> $ 10.00 </td></tr><tr><td> 5 - # 10 1.91 cm (3 / 4 &quot;) düz başlı civatalar w / fındık oluklu </td><td></td><td></td><td> Yerel nalburdan </td><td> 0,98 $ </td></tr><tr><td> 3 - # 4: 0.95 cm (3 / 8 &quot;) Yivli cıvata w / fındık </td><td></td><td></td><td> Yerel nalburdan </td><td> 0,98 $ </td></tr><tr><td> 15 - # 10 pullar </td><td></td><td></td><td> Yerel nalburdan </td><td> 0,98 $ </td></tr><tr><td> 2 - şeffaf plastik clipboards </td><td></td><td></td><td> Yerel ofis mağaza </td><td> 6,84 $ </td></tr><tr><td> 1 - Cryo-EM grid sahibi </td><td> Ted Pella </td><td> 160-41 </td><td></td><td> N / A </td></tr><tr><td> 1 - Cryo-EM ızgara kutusu taşıma çubuğu </td><td> Ted Pella </td><td> 160-46 </td><td></td><td> N / A </td></tr><tr><td> 1 - R2 / 1 holey karbon film, 400-örgü bakır cryo-EM destek ızgara </td><td> SPI Malzemeleri </td><td> 4340C-XA </td><td></td><td> N / A </td></tr></tbody></table> Deneysel malzemeleri <ol><li> Maya zorlama: Hta1-CFP: Kaplan laboratuar KanMX6: Kan (KSC-3382: Mata, ura3-52, lys2-801, ade2-101, trp1-Δ63 his3-Δ200 leu2-Δ1 Hta1-CFP: UC Davis). </li><li> Cryo-Işık Mikroskopi: Cryo-ışık mikroskobu görüntüleri Leica DFC310 FX CCD kamera ile Leica DM4000M yansıtan mikroskop alındı. Parlak Alan, Karanlık Alan ve Floresans görüntüleri ya HCX PL FLUOTAR 5x 0.15 NA hava amacı, bir HCX PL FLUOTAR 10x 0.30 NA hava amacı, PL FLUOTAR 50x 0.55 NA hava amacı veya NPLAN 100x 0.75 NA hava amacı ile satın alındı. Parlak Alan ve Dark Alan görüntüler, ışık kaynağı olarak 12V 100W tungsten lamba kullanılır. Filtre Küp Floresans için bir EL6000 UV lamba kaynağı Leica JC1 (BP 480/30 DM LP 505, SF BP 535/40 ve LP 580 Ex.F.) ile birlikte kullanılır. </li><li> Cryo-Transmisyon Elektron Mikroskopi: Cryo-EM görüntüler Gatan 626 cryo-devret tutucu (Gatan ABD) kullanan 200 keV bir JEM-2100-FEG Transmisyon Elektron Mikroskobu (JEOL, Japonya) işletim satın alındı. Mikroskobu, 50, 200, 1.200 ve 4.000 x 4.096 x 4.096 piksel Tietz CCD kamera (TVIPS, Gauting, Almanya) nominal büyütmelerde kaydedildi. </li></ol>

düşük maliyetli cryo-işık mikroskopi sahne İmalatı İlişkili işık / elektron mikroskopi

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

Cryo ışık mikroskobu (cryo-LM) ve kriyo-elektron mikroskobu kavrama (cryo-EM) hücresel dinamikleri ve ultrastrüktür anlamak için bir çok avantaj teşkil etmektedir. İlk olarak, hücreler her iki teknikleri için yakın bir doğal ortamda görüntülü olabilir. Vitrifikasyon süreci nedeniyle, ikinci numunelerin hızlı fiziksel immobilizasyon ziyade yavaş kimyasal sabitleme tarafından korunur. Üçüncü olarak, görüntüleme cryo-LM ve cryo-EM ile aynı örnek, &quot;temsili numuneler&quot; bir karşılaştırma yerine, tek bir hücre veri korelasyon sağlar. Bu faydalar, önceki çalışmalardan elde edilen iyi bilinen edilirken, bağlaşık cryo-LM ve cryo-EM kalır yaygın kullanımı, satın alma ya da uygun bir kriyojenik ışık mikroskobu sahne binasının gider ve karmaşıklığı nedeniyle sınırlı. Burada montaj göstermek ve yerel donanım ve bakkallarda bulunan parçalar ile 40 $ &#39;dan az herhangi bir laboratuarda imal edilebilir bir ucuz kriyojenik sahne kullanımı. Bu cryo-LM aşaması uzun çalışma mesafesi hava hedefleri ile donatılmış yansıyan ışık mikroskopları ile kullanmak için tasarlanmıştır. Bağıntılı cryo-LM ve cryo-EM çalışmaları için, biz örnek destekleyen olarak karbon kaplı standart 3 mm cryo-EM ızgaraları kullanmak uyum sağlar. Izgara örnek adsorblama sonra, örnek sırlama ve aktarma / ızgara taşınması için daha önce belirlenmiş protokoller çok tekniği görüntüleme izni için takip edilmektedir. Sonuç olarak, bu kurulum yansıyan bir ışık mikroskobu ile, herhangi bir laboratuvar dondurulmuş sulu örneklerin doğrudan bağıntılı görüntüleme erişim sağlar.

Biz en çok yansıyan ışık mikroskopları uyacak şekilde tasarlanmış düşük maliyetli kriyojenik sahne imalat göstermektedir. Bu laboratuvar dahili kriyojenik aşamada cryo-ışık ve cryo-elektron mikroskobu arasındaki verimli ve güvenilir bir bağlaşık görüntüleme sağlar.

Düşük Maliyetli Cryo-Işık Mikroskopi Sahne İmalatı İlişkili Işık / Elektron Mikroskopi

Kriyo-ışık mikroskobisi (cryo-LM) ve kriyo-elektron mikroskobisinin (cryo-EM) birleştirilmesi, hücresel dinamiklerin anlaşılması açısından bir dizi avantaj sunmaktadır...

Merhaba, ben David Carlson; Kaliforniya Üniversitesi Davis kampüsünde, Biyokimya ve Moleküler Biyoloji bölümündeki James Evans laboratuvarında yüksek lisans öğrencisiyim. Bu videoda, korelatif kriyojenik ışık ve elektron mikroskobu için basit ve etkili bir kriyojenik ışık tablasının nasıl kurulacağını göstereceğim. Bir kriyojenik tabla; şeffaf bir görüntüleme penceresinden, objektif lensler için bir boşluktan, bir sıvı azot girişinden, numuneyi görüntülemek için bir ısı emiciden ve bir numune transfer tertibatından oluşur.Kullanılan malzemelerin çoğu yerel bir hırdavat ve marketten satın alınmıştır. Bu malzemeler; dokuz inçlik bir boru tavası, dokuz inçlik bir kek tavası, dört çift yemek çubuğu, yüksek dolgulu sprey köpük, 10 numara civatalar için montaj delikleri açılmış 4 cm x 8 cm x 1 cm boyutlarında bir alüminyum blok, üç adet 10 numara 3/4 inç düz başlı yivli civata ve somun, üç adet 4 numara 3/8 inç yuvarlak yivli civata ve somun, 15 adet 10 numara pul, iki adet şeffaf plastik sekreterlik, su ve Ted Pella'dan satın alınabilen bir cryo EM grid kutusu tutucusu ve taşıma çubuğundan oluşmaktadır.Pasta tabağını, objektif lenslerin altına, mikroskop tablasına yerleştirin. Alüminyum bloğu tabağın kenarına yakın bir yere koyun ve alüminyumun yüzeyine odaklayın. Objektif lenslerin pasta tabağının kenarı üzerinde serbestçe içeri ve dışarı sallanabildiğini kontrol edin.Eğer değilse, alüminyum bloğu yeniden konumlandırın ve tekrar kontrol edin. Alüminyum bloğun konumu belirlendiğinde, montaj cıvatalarının yerlerini bir markörle işaretleyin. Kriyojenik ızgara kutusunu alüminyum bloğun yanına yerleştirin ve bir markörle, çentiğin konumunu ve kriyojenik ızgara kutusunun her bir yanını, cıvataların yerleşim düzenini petri kabının yüzeyine kaydederek belgeleyin.17 numara matkap uçları kullanarak işaretlenmiş her bir noktanın üzerine keskin bir vida ve çekiç yardımıyla başlangıç delikleri açın. Alüminyum bloğun montajı için delikleri delin. Kenarları düzeltmek için her bir deliği yuvarlatın.Ardından, kriyojenik ızgara kutusunun montajı için delikleri delmek ve yuvarlatmak amacıyla 35 numara matkap ucu kullanarak pasta tabağını hazırlayın ve delin. Alüminyum blok üzerindeki deliklere 10 numara üç çeyrek inç düz başlı yivli cıvataları yerleştirin ve her bir alüminyum bloğun üzerine iki adet 10 numara SAE pulu yerleştirin.Pasta tabağı üzerindeki montaj delikleri. Ardından, her bir cıvatayı başlatmak için bloğu parmaklarınızla yerleştirin ve bir matkapla sıkın. Pasta tabağını ters çevirin, her bir cıvataya 10 numara bir pul yerleştirin ve bunları bir somunla sabitleyin.Tüm somunların sıkıca sabitlendiğinden emin olmak için bir İngiliz anahtarı kullanın. Ardından, turtalık kabının arkasından, dört numaralı yuvarlak başlı yivli civataları kriyojenik ızgara kutusu montaj deliklerinden yerleştirin ve turtalık kabının üst kısmından bir somunla sabitleyin.Kriyo sahnesinin üst kısmı tamamlandıktan sonra, hem plastik panonun hem de sıvı Azotun yokluğunda kriyo ızgara kutusunun nasıl transfer edileceğini gösteriyoruz. Ardından, yalıtım köpüğü kalıbının hazırlıklarına başlıyoruz. Yemek çubuklarını ikişerli demetler halinde bantlayarak başlayın.Ardından, her bir yemek çubuğu demetini kek kalıbının kenarına karşılıklı gelecek şekilde bantlayın. Yemek çubuğunun amacı, köpük yalıtımının tekdüze bir kalınlıkta olmasını sağlamaktır. Sonra, kek kalıbını ve pay kaplarının alt yüzeyini suyla ıslatın.Kek kalıbının tüm tabanına tek bir katman "great stuff" sprey köpük sıkarak başlayın ve üzerine su püskürtün. İkinci bir katman "great stuff" sprey köpük ekleyin ve tekrar su püskürtün.Turta tabağını kek kalıbına eşit ve sıkı bir şekilde bastırın. Birleştirilmiş kapları ters çevirin ve kapların üzerine ağır bir ağırlık yerleştirin. Köpüğün gece boyunca kürlenmesine izin verin.Köpük kürlendikten sonra, tabağı serbest bırakmak için tırtıklı bir bıçak kullanın ve tabağın yanlarındaki fazla köpüğü temizleyin. Yemek çubuğundan yapılan ara parçaları çıkarın ve tart kalıbını kek kalıbından ayırın. Köpük, tart kalıbına yapışık kalmalıdır.Ardından, kriyojenik sahneyi objektif lensin altına yerleştirin ve üzerine plastik bir sekreterlik koyun. Bir marker kalemle, objektif lenslerin içeri ve dışarı doğru hareket ederken izlediği yolu çizin. Petri kabının kenarına yakın olan yarım dairenin dışında bir yere X işareti koyun.İkinci panoyla, kalabalık ızgara kutusu bağlantı noktasını işaretleyin. Üç çeyrek inçlik panç ve matkap kullanarak kalabalık ızgara kutusu için deliği açın, diğer panoya bastırın. Üç çeyrek inçlik panç ile X şeklindeki boşluğu kesin.Üç inçlik bir panç ve sütunlu matkap ile birkaç kez keserek yarı dairesel alanı çıkarın; böylece imalat tamamlanmış olur. Numune hazırlığı için gereken malzemeler arasında bir kryo grid kutusu ve taşıma çubuğu cımbızları, kryo grid kutusu transfer bloğu, kimyasal temizleme bezi, soğutma kabı, sıvı etan kabı, 400 mesh R2/1 delikli karbon EM gridleri, strafor kutu ve pnömatik dondurucu (plunge freezer) bulunur. Strafor kutuyu, kryo grid kutusunu, transfer bloğunu, soğutma kabını ve sıvı etan kabını sıvı azot ile dikey olarak soğutun.Ardından, kriyogrid kutusunu kriyogrid kutusu transfer bloğuna yerleştirin. EM gridini karbon yüzeyi yukarı bakacak şekilde cımbızla tutun. Gridin üst kısmına, mL başına 2x10⁶ hücre konsantrasyonundaki hücre süspansiyonundan iki mikrolitre uygulayın.Cımbızı pnömatik piston üzerine yerleştirin ve yırtılmış bir parça kimyasal temizleme bezini EM ızgarasının arka tarafına tutarak ızgara yüzeyindeki sıvıyı çekin ve sıvı etan bulamacı içine daldırın. Izgarayı hızlıca sıvı etandan sıvı azota taşıyın ve bir kriyojenik ızgara kutusuna yerleştirin. Kriyojenik sahneyi kullanmak için, önce kabı sıvı azotla doldurarak başlayın ve üzerini bir sekreterle kapatın.Kriyogrid kutusunu plastik panodaki boşluktan geçirdikten sonra, kutudan bir grid çıkarın ve bunu alüminyum bloğun görüntüleme yüzeyine yerleştirin. Kriyojenik sahne mikroskop üzerinde konumlandırıldıktan sonra, ikinci panoyu birincinin üzerine yerleştirin ve dikkatlice birinci panoyu dışarı kaydırın.Objektif lenslerini yerleştirin ve mikroskobu normal şekilde kullanın. Üç metal sekme ile belirtilen ızgara merkezini bulmak için tarama ve düşük büyütme ile başlayın. Burada, 50 x büyütmede odaklama yapın.Izgarayı kaplayan camsı buzun ince bir tabakasının floresansa dönüştüğünü görebilirsiniz. CFP histon markerının hücrenin çekirdeğine lokalize olduğunu görebilirsiniz. Ardından objektifi 100 x ile değiştiriyorum ve tekil maya hücrelerine odaklanıyorum.Kriyo sahnesini mikroskoptan çıkarmak için, birinci panoyu ikincisinin üzerine yerleştirin ve alttaki panoyu dikkatlice dışarı kaydırın. Kriyo sahnesini mikroskoptan çıkarın ve panodaki boşluğu kullanarak ızgarayı kriyo ızgara kutusuna geri yerleştirin. Son olarak, kriyo ızgara kutusu taşıma çubuğunu kutuya vidalayın ve daha sonra incelenmek üzere sıvı azota aktarın.Elektron mikroskobunda sahne kararlılığı oldukça önemlidir. Mikroskopi çalışmaları sırasında, sistemimizdeki görüntü kararsızlığının çoğunun, kriyojenik sahnenin mikroskop sahnesine eklediği ağırlıktan kaynaklandığını tespit ettik. Sıvı azot bulunmadığında, alüminyum bloğa odaklanıldığında yüksek düzeyde kararsızlık görülebilmektedir.Mikroskop tablasının önüne destek eklenerek dengesizlik büyük ölçüde azaltılmıştır. Burada, mikroskop tablası ile tabanı arasına yerleştirdiğim ayarlanabilir bir vida mekanizmasından oluşan bir destek yapısını gösteriyorum. Ek desteğin faydası, dengesizliğin sıvı azot kabarcıklarından değil, eklenen ağırlıktan kaynaklandığını gösteren kryo ışık mikroskopisinde de görülmektedir.Gördüğünüz gibi, bu kriyojenik ışık sahnesi, dondurulmuş hidrate hücrelerin floresan bilgilerini toplamak için uygun maliyetli ve kullanışlı bir yöntemdir. Aydınlık alan ve karanlık alan taraması, homojen buz alanlarının haritalanmasını sağlar. Bu ilgi çekici bölgeleri belirledikten sonra, bu örnekte bir CFP histon markörü olan, ilgilenilen proteinleri işaretlemek için kullanılan floresan kanalını kullanabiliriz.Kriyo floresan görüntüler yakalandıktan sonra, aynı gridi ve kareyi haritalandırmak ve bulmak için düşük büyütmeli görüntüleri kullanabilir, böylece aynı hücreleri kriyo-elektron mikroskobunda görüntüleyebiliriz. Gördüğünüz gibi, bu kriyo ışık düzeneği, dondurulmuş hidrojen örneklerinin floresan görüntülerini toplamak için kullanışlı ve düşük maliyetli bir yoldur. Aynı bölge, standart kriyo EM transfer ve görüntüleme teknikleri izlenerek kriyo EM ile de gözlemlenebilir.Bu durumda, kriyolüminesans ışık mikroskopisi verileri, korelatif çalışma için kesin bölgeyi belirlemeye yarayan bir referans haritası görevi görür. Bu aşama; in vitro makromoleküler kompleks reaksiyonlarındaki tüm hücreler, izole organeller veya doku ince kriyokesitler dahil olmak üzere birçok numune türünün korelatif görüntülemesinde uygulanabilir. İzlediğiniz için teşekkürler, umarım bu kriyolüminesans ışık mikroskopisi aşamasını bizim kadar yararlı bulursunuz.

low-cost-cryo-light-microscopy-stage-fabrication-for-correlated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Lensfree optik tomografi &lt;1 um arasındaki konumsal bir çözünürlüğe sahip bir üç-boyutlu mikroskopi tekniktir x &lt;1 um x 15-100 mm arasında geniş bir görüntüleme-hacmi içinde, sırasıyla, x, y ve z, boyutları, içinde &lt;3...

Çok açılı Aydınlatma ve Pixel Super çözünürlüklü istihdam Lensfree On-chip Tomografik Mikroskopi

Biz yüksek hızlı 3D canlı hücre floresan ışık mikroskobu ve yüksek çözünürlüklü kriyo-elektron tomografi birleştiren bir karşılıklı mikroskopi yöntemi açıklanmaktadır. Biz burada görüntüleme, dinamik ana HeLa hücreleri ile etkileşime küçük bir HIV-1 parçacıkların bağıntılı yöntemin özelliği göstermektedir.

Dinamik Etkileşimler 3D Yapısal Analiz için karşılıklı Mikroskopi

Burada, hem şeklin hem de moleküler hizalamanın doğrudan lazer yazma kullanılarak nanometre ölçeğinde doğrulukla tasarlanabildiği 3D polimerik mikro/nano yapılar üretiyoruz. Çeşitli sıvı kristal elastomer mikro yapılarının ışık kaynaklı deformasyonu mikroskobik ölçekte kontrol edilebilir.

Serbest biçimli Işık Aktüatörler - Mikroskobik Ölçeğinde imalat ve çalıştırma Kontrolü

Bağdaşık ışık elektron mikroskobu (CLEM) yöntemi daha önce ışık mikroskobu (LM) tarafından seçilen hücrelerdeki görüntü virüs kaynaklı hücre içi yapılar elektron mikroskobu (EM) yoluyla uygulanır. LM ve EM virüs ana bilgisayar etkileşimlerin tümleşik bir görünüm elde etmek için hibrid görüntüleme yaklaştıkça birleştirilir.

Cryo-immobilize hücreler yapılarda bağdaşık ışık elektron izleme ve Viral Protein Imaging mikroskobu (CLEM) ilişkili

Çip tabanlı süper çözünürlüklü optik mikroskopi floresan mikroskobu için yeni bir yaklaşım dır ve maliyet etkinliği ve iş akışı avantajları sunuyor. Burada TIRF mikroskobu ve lokalizasyon tabanlı süper çözünürlüklü mikroskopi için çip hazırlama ve görüntüleme protokolleri gösterilmiştir.

Fotonik Çip Kullanarak Yüksek İşLeç Toplam İç Yansıma Floresansı ve Direkt Stokastik Optik Rekonstrüksiyon Mikroskobu

Bu protokol, kriyo yapısına sahip aydınlatma mikroskopisi kullanılarak biyolojik kriyo ile korunmuş örneklerin nasıl görüntülenerek görüntülenlerin ortaya koyduğunu göstermektedir. U2OS hücrelerinin sitoskeletonlarını görüntüleyerek metodolojiyi gösteriyoruz.

Kriyojenik Olarak Korunmuş Hücrelerden Kriyo-Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskobik Veri Toplama

Kriyo-elektron tomografisi için dalma dondurulmuş biyolojik örneklerden vitreus ızgara üzerinde lamel üretmek için odaklanmış iyon ışını frezeleme kullanımı.

Kriyo-Elektron Tomografisi için Çift Işınlı Taramalı Elektron Mikroskobu Kullanarak Vitreus Biyolojik Numunelerinden Lamel Hazırlanması

Protokol, standart bir floresan mikroskobunda oksijenasyonlarının ve hücre ölümlerinin çok parametrik analizini kullanarak biyobaskı için yüksek verimli sferoid üretimini tanımlar. Bu yaklaşım, sferoidlerin yaşayabilirliğini kontrol etmek ve 3D doku, tümör mikroçevresi ve başarılı (mikro) doku biyofabrikasyonunun modellenmesinde önemli olan standardizasyonu gerçekleştirmek için uygulanabilir.

Çok Hücreli Sferoidlerin Uygun Fiyatlı Oksijen Mikroskobu Destekli Biyofabrikasyonu

Geniş bantlı titreşimsel toplam frekans üretimi (VSFG) görüntülerinin yanı sıra parlak alan, ikinci harmonik üretim (SHG) görüntüleme modaliteleri elde etmek için çok modlu, hızlı bir hiperspektral görüntüleme çerçevesi geliştirilmiştir. Kızılötesi frekansın moleküler titreşimlerle rezonans olması nedeniyle, simetriye izin verilen numunelerin mikroskobik yapısal ve mezoskopik morfoloji bilgisi ortaya çıkar.

Çizgi Taramalı Titreşimli Toplam Frekans Oluşturma Mikroskobu Kullanılarak Multimodal Doğrusal Olmayan Hiperspektral Kimyasal Görüntüleme

Bu protokol, tek objektifli, hafif tabakalı bir floresan mikroskobunun nasıl oluşturulacağını ve hücre iskeleti ağlarını görselleştirmek için kullanımını ayrıntılı olarak açıklar.

Hücre iskeleti ağlarının görselleştirilmesi için özelleştirilebilir, tek objektifli, ışık tabakalı floresan mikroskobunun tasarımı ve inşası

Bu iş akışı, kriyojenik üç tesadüfi görüntüleme platformu kullanarak küçük (eksenel kapsamda &lt;1 μm) ve nadir (hücre başına 1 kopya) floresan etiketli biyolojik yapıları hedefleyen lamel üretimini mümkün kılar. Bu platform, floresan mikroskobu, odaklanmış iyon ışını frezeleme ve taramalı elektron mikroskobunu tek bir odak konumunda birleştirir ve frezeleme sırasında eş zamanlı floresan mikroskobuna olanak tanır.

Hücrelerin Hedeflenen Frezelenmesi için Kriyojenik Tesadüfi Floresan, Elektron ve İyon Işını Mikroskobu Kullanan İş Akışı

Öğrenin, düşük maliyetli bir kriyojenik sahne imalatını ve kriyojenik ışık ile elektron mikroskobisi arasında korelasyonlu görüntüleme yöntemini. Bu yöntem, donmuş hidrate hücrelerde floresan bilgi toplamak için ekonomik ve güvenilir bir çözüm sunar.

Düşük Maliyetli Cryo-Işık Mikroskopi Sahne İmalatı İlişkili Işık / Elektron Mikroskopi

Daha fazla video keşfet