Name: Pamuk olarak Agrobacterium Virüs Bağlı Gen susturma Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Öğrenin, pamukta Agrobacterium aracılı VIGS yöntemiyle GrCLA1 gen susturmasını ve albino fenotip gözlemlerini. Bu teknik, gen fonksiyonu çalışmaları için hızlı bir platform sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Dr minnettar. SP Dinesh Kumar ve Yule Liu TRV VIGS vektörler için, Dr. Kenerley Chuck, Terry Wheeler, Jim Starr ve pamuk tohumu sağlayan Bayer CropScience. Bu çalışma PH NSF LS ve NIH tarafından finanse edildi

1. Grow pamuk fideleri <ol><li> Upland pamuk (Gossypium hirsutum) çeşitli Fibermax 832, Phytogen 425RF, Phytogen 480WR ve Deltapine 90 Metro Mix 700 (SunGR, Beavile, WA) içeren tencere (çapı 7 cm) tohumları Sow. </li><li> Bir büyüme odasında 12 saat light/12 saat karanlık fotoperiyodun ° C, 120 μE m -2 G -1 ışık, 23 plastik bir kubbe ile örtülü bir tepsi tencere tutun. </li><li> Kubbenin iki kotiledonlarında ortaya çıkarın. </li><li> Yaklaşık iki hafta sonra, VIGS tayini için iki tam genişletilmiş kotiledonlarında bitkiler kullanın. Bu aşamada, gerçek yaprakları henüz (Şekil 1) ortaya çıkmış değil. </li></ol> 2. GrCLA1 ​​geni taşıyan Construct VIGS vektör <ol><li> G. cDNA kütüphanesi PCR primerleri GrCLA1-F ile 5'-GCCCTTTGTGCATCTTC-3 've GrCLA1-R, 5'-CTCTAGGGGCATTGAAG-3' pamuk Cloroplastos alterados 1 geni (GrCLA1) Amplify raimondii yaprak dokuları. </li><li> EcoRI ve KpnI GrCLA1, PCR ürünleri Digest ve ligasyonu ile pYL156 (pTRV-RNA2) vektör takın. </li><li> 50 mg / Kanamisin ml içeren LB agar plaklarına klonlar Ekran. Restriksiyon enzimi sindirim ve sıralama yapıları olun. </li><li> Elektroporasyon Agrobacterium tumefaciens GV3101 plazmid Transform ve 28 LB sıvı ortamda kurtarmak ° C LB ile plakalar transformants seçin + Kanamisin (50 mg / ml) + Gentamisin (25 mg / ml). Bakteri, -80 ° C ile uzun süreli kullanım için% 25 gliserol içerisinde saklanabilir. </li></ol> 3. VIGS aşılama gerçekleştirin <ol><li> Üç gün önce taşıma pYL192 (TRV) Agrobacterium tumefaciens aşılama, çizgi dondurulmuş gliserol stokları RNA1, pYL156 (TRV): RNA2 (vektör tek başına) ve pYL156 (TRV): 50 mg / Kanamisin ml içeren LB agar plaklarına RNA2-GrCLA1 ve 25 mikrogram / mL Gentamisin. Plakalar için 28 ° C'de 24 saat inkübe edin. </li><li> İki gün önce VIGS infiltrasyon, yukarıdaki plakalardan her inşa için tek bir koloni almak ve içine 5 ml, 50 mg / Kanamisin mL ve 25 mcg / ml Gentamisin ile desteklenmiş LB orta aşılamak; 28 bakteri kültürü büyütün ° C 50 rpm hızında bir rulo davul geceleme. </li><li> 50 ml LB orta (- (4 morfolino)-etan, propan sülfonik asit 2) ve 20 mcM acetosyringone 50 mcg / Kanamisin mL ve 25 mcg / mL Gentamisin, artı 10 mM (MES) ile desteklenmiş bir şişesi için yukarıdaki kültür aktarın. 28 ° C'de 50 rpm hızında bir çalkalayıcı geceleme kültür büyütün. </li><li> Ertesi gün, 5 dakika 4000 rpm'de agro-bakteriyel hücreler aşağı doğru döndürün; 10 mM MgCl 2, 10 mM (MES) ve 200 mcM acetosyringone içeren infiltrasyon tampon kültür yeniden askıya. 1.5 kültürü OD 600 ayarlayın. </li><li> 3 saat boyunca oda sıcaklığında tezgah kültür bırakın. </li><li> Agrobacterial infiltrasyon önce yumruk kotiledonlarında delip olmadan 25 G iğne ile pamuk bitkileri kotiledonlarında alt. Kotiledon her bölümünde (Şekil 2) Bir veya iki delik (doku yumuşaklık bağlıdır) delikli edildi. </li><li> 1:1 oranında RNA2 GrCLA1; el karışımı 1 kullanarak yaralama siteleri aracılığıyla kotiledonlarında alt sızmak: RNA1 ve pYL156 (TRV): RNA2 veya pYL156 (TRV) pYL192 Agrobacterial kültür süspansiyon (TRV) karıştırın ml iğnesiz şırınga (Şekil 3). </li><li> Bitkilerin plastik bir kubbe ile örtün ve loş ışık koşulu altında gece boyunca oda sıcaklığında sızmış bitkiler bırakın. </li><li> Bitkilerin büyüme oda sıcaklığı 23 transfer ° C, 120 μE m -2 S 12 saat 12 saat ışık / karanlık döngüsünü -1 ışık. </li></ol> Not: bitkiler, 23 ° C veya cam sera (25-28 ° C) ya altında VIGS çalışır. (23 - 25 ° C) sıcaklığın nispeten düşük olduğunda, aşılama için daha kolay ve fenotip ile karşılaştırıldığında daha yüksek (28-30 ° C) ya da dalgalanma sıcaklık üniforma daha fazla. Bir kubbe ile bitkileri kapsayan VIGS daha verimli hale getirir. <ol start="10"><li> 7 ~ 8 gün infiltrasyon susturma fenotip inceleyin. PYL156 (TRV) tarafından susturuldu bitkilerin gerçek yaprakları: RNA2-GrCLA1 ​​albino fenotip (Şekil 4) görüntülemek için başladı. Agrobacteria taşıma pYL156 (TRV) ile infiltre bitki: RNA2 kontrol olarak hizmet vermektedir. </li><li> Kontrolü ve susturulması pamuk bitkileri izole edilen RNA ile ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) kullanarak endojen genlerin ekspresyon seviyesi inceleyerek gen susturulması verimliliği olun. </li></ol> Not: TRV geniş bir konak yelpazesine sahiptir ve bildirilmesi gereken bir patojen olarak VIGS-ed bitki karantina koşulları ve bitkilerin altında tutulmalıdır düzgün otoklavlanabilir ve deneyleri sonra imha edilmelidir. 4.Temsilcisi Sonuçlar: Agrobacterial karışımı ile el-infiltrasyon yaklaşık iki hafta sonra GrCLA1 ​​susturulması kaynaklanan albino fenotip açıkça gerçek yaprakları gözlendi. Susturulması verimliliği 50'den fazla tesisleri ile birden fazla deneylerde hemen hemen% 100 ulaşır. Susturuldu bitkilerin yaprakları yaşlı yapraklar (Şekil 4) yeni bir mozaik ile gelişmekte olan bir düzgün dağıtılmış ve çok güçlü bir albino fenotipi gösterir. <img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 Agrobacterial infiltrasyon için kullanılan iki tam genişletilmiş kotiledonlarında iki hafta eski aşama hakkında bir pamuk fide. <img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 Agrobacterial geçişlerini kolaylaştırmak için bir 25 G iğne kullanarak pamuk bitkileri alt kotiledonlarında üzerinde küçük delikler Delme. <img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 yaralama siteleri aracılığıyla pamuk kotiledonlarında içine Agrobacterial karışımı El infiltrasyon iğnesiz bir şırınga kullanarak <img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 Albino fenotip pamuk bitkileri susturuldu VIGS çıktı. Dört çeşitlerin gösterilmiştir. A) Fibermax 832 B) Phytogen 480WR C) Phytogen 425RF D) Deltapine 90.

<ol><li>Chen, Z. J., Scheffler, B. E., Dennis, E., Triplett, B. A., Zhang, T., Guo, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+sequencing+cotton+%28Gossypium%29+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Toward sequencing cotton (Gossypium) genomes.</a> Plant Physiol. 145, 1303-1310 (2007).</li>
<li>Dinesh-Kumar, S. P., Anandalakshmi, R., Marathe, R., Schiff, M., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-induced+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Virus-induced gene silencing.</a> Methods Mol Biol. 236, 287-294 (2003).</li>
<li>Hamilton, A. J., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+species+of+small+antisense+RNA+in+posttranscriptional+gene+silencing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants.</a> Science. 286, 950-952 (1999).</li>
<li>Burch-Smith, T. M., Anderson, J. C., Martin, G. B., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+and+advantages+of+virus-induced+gene+silencing+for+gene+function+studies+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants.</a> Plant J. 39, 734-746 (2004).</li>
<li>Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-induced+gene+silencing+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Virus-induced gene silencing in tomato.</a> Plant J. 31, 777-786 (2002).</li>
<li>Estevez, J. M., Cantero, A., Romero, C., Kawaide, H., Jimenez, L. F., Kuzuyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+expression+of+CLA1%2C+a+gene+that+encodes+the+1-deoxyxylulose+5-phosphate+synthase+of+the+2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate+pathway+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the expression of CLA1, a gene that encodes the 1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase of the 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 124, 95-104 (2000).</li>
<li>Mandel, M. A., Feldmann, K. A., Herrera-Estrella, L., Rocha-Sosa, M., Leon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLA1%2C+a+novel+gene+required+for+chloroplast+development%2C+is+highly+conserved+in+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">CLA1, a novel gene required for chloroplast development, is highly conserved in evolution.</a> Plant J. 9, 649-658 (1996).</li>
<li>Gao, X., Wheeler, T., Li, Z., Kenerley, C., He, P., Shan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+GhNDR1+and+GhMKK2+compromised+cotton+resistance+to+Verticillium+wilt%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Silencing GhNDR1 and GhMKK2 compromised cotton resistance to Verticillium wilt.</a> Plant J. 66, 293-305 (2011).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

VIGS, endojen genlerin ifade geçici olarak aşağı vurma işlevsel genomik analiz güçlü bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Bu çalışmada, biz TRV tabanlı bir ikili vektör kullanan bir Agrobacterium VIGS geliştirdi. Pamuk CLA1 (GrCLA1) gen susturma etkinliğini izlemek için görsel bir belirteci olarak geliştirilmiştir. Biz sürekli gen susturulması verimliliği% 100, yaklaşık iki hafta yazılan infiltrasyon başlayarak, test tüm çeşitleri gerçek yaprakları üzerinde görülen albino fenotip gösterdiği elde edilmiştir. Ancak <e...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifler ve ekipmanları Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog / seri numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Rulo davul </td><td> Glas-Col, LLC. </td><td> 099A TC108 </td><td> Agro-bakteri kültürü </td></tr><tr><td> Kuvöz </td><td> Sheldon Üretim, Inc. </td><td> 01046209 </td><td> Agro-bakteri kültürü </td></tr><tr><td> UV / VIS Spektrofotometre </td><td> Beckman Coulter </td><td> Model: DU530 </td><td> Ölçüm OD </td></tr><tr><td> Gene Verici </td><td> BioRad </td><td> Model: 1652076; Seri: 154BR3880 </td><td> Elektroporasyon </td></tr><tr><td> Verici Kontrolörü </td><td> BioRad </td><td> Model: 1652098; Seri: 232BR4833 </td><td> Elektroporasyon </td></tr><tr><td> Micropulser Elektroporasyon küvet </td><td> BioRad </td><td> 165-2081 </td><td> Elektroporasyon </td></tr><tr><td> 1 ml Şırınga </td><td> BD Biosciences </td><td> 30962 </td><td> Agro-bakteri, Aşılama </td></tr><tr><td> Metro Mix 700 </td><td> SUNGR </td><td> SKU # 553.001 </td><td> Büyüyen fide </td></tr><tr><td> Terra Cotta pot </td><td> TOPlastics </td><td> GPS 3001B2 </td><td> Büyüyen fide </td></tr><tr><td> MES monohidrat </td><td> USB </td><td> 18886 </td><td> Sızma tampon </td></tr><tr><td> Acetosyringone </td><td> Sigma </td><td> D134406 </td><td> Sızma tampon </td></tr></tbody></table>

pamuk olarak agrobacterium virüs bağlı gen susturma testi

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Pamuk (Gossypium hirsutum), dünya çapında en önemli bitkileri biridir . , Yeni çeşitlerin moleküler ıslahı konusunda önemli çabalar yapılmıştır. Genomu, gen çoğaltılması ve poliploidi, genetik transformasyon 1 uzun büyüme döngüsü ve inatçılıklarıyla büyük boyutu nedeniyle büyük olasılıkla modern bitki türleri, en gerisinde kalmıştır pamuk büyük ölçekli gen fonksiyonel analiz edilmiştir . Yüksek pamuk üretilen fonksiyonel genetik / genomik çalışma kolaylaştırmak için, pamuk gen fonksiyonlarını değerlendirmek için hızlı ve etkili bir geçici testleri geliştirmek için çalışırlar. Virüs Bağlı Gen susturma (VIGS), viral çoğalma 2,3 bastırmak için ana Post-transkripsiyonel gen susturma (PTGS) dayalı olarak geliştirilen güçlü bir tekniktir. Agrobacterium VIGS Solanaceae, Arabidopsis ve baklagil türlerinin ikiçeneklilerin türlerin geniş bir yelpazede başarıyla uygulanan ve biçeneklilerin türler arpa, buğday ve mısır, çeşitli fonksiyonel genomik çalışmalar için 3,4 dahil olmuştur. Bu hızlı ve verimli bir yaklaşım bitki dönüşüm önler ve fonksiyonel fazlalık üstesinden, özellikle çekici ve dönüşüm için uygun değildir pamuk gibi bitki türleri işlevsel genomik çalışmaları için uygundur. Bu çalışmada, pamuk Agrobacterium VIGS sisteminin ayrıntılı protokol rapor. Çeşitli viral VIGS vektörleri arasında, tütün çıngırak virüsü (TRV) ev sahipliği yapan geniş bir yelpazede işgal etti ve henüz hosts5 hafif belirtiler üretmek tüm bitki boyunca kuvvetlice yaymak mümkün. Susturulması verimliliği, GrCLA1 ​​alterados 1 geni (AtCLA1) pamuk, CLA1 gen kloroplast gelişimi 6 yer almaktadır klonlanmış ve VIGS ikili vektör pYL156 takılı olan ve önceki çalışmalar göstermiştir Arabidopsis Cloroplastos bir homolog gen izlemek için AtCLA1,-fonksiyon kaybı, verimlilik susturmak için mükemmel bir görsel belirteç sağlayarak, gerçek yaprakları 7 bir albino fenotip sonuçlandı . Yaklaşık iki haftada sonrası Agrobacterium infiltrasyon, albino fenotip çoğaltılan tüm deneylerde% 100 susturulması verimliliği ile, gerçek yaprakları görünmeye başladı. Susturulması endojen gen ekspresyonu RT-PCR analizleri ile de teyit edilmiştir. Önemli ölçüde, susturulması kuvvetli Texas çeşitli ticari olarak yetiştirilen çeşitler de dahil olmak üzere, test edilen tüm çeşitlerin meydana gelebilir. Bu hızlı ve verimli Agrobacterium VIGS tahlil pamuk genom düzeyinde gen fonksiyonları hızlı bir şekilde büyük çaplı bir analiz için çok güçlü bir araç sağlar.

Agrobacterium pamuk virüs indüklenen gen susturulması (VIGS) tahlil için ayrıntılı protokol sunuyoruz. Tütün çıngırak virüsü (TRV) türetilen VIGS vektörler, pamuk GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 geninin RNA susturma ikna etmek için konuşlandırıldı. Susturulması GrCLA1 ​​kaynaklanan albino fenotip fide aşamasında aşılama sonrası 2 hafta içinde gözlenmiştir.

Pamuk olarak Agrobacterium Virüs Bağlı Gen susturma Testi

Pamuk (Gossypium hirsutum), dünya çapındaki en önemli ürünlerden biridir. Yeni çeşitlerin moleküler ıslahı üzerine önemli çalışmalar yapılmıştır. ...

Bu prosedürün genel amacı, gen fonksiyonunu incelemek için pamukta agrobacterium aracılı virüsle indüklenen gen susturma deneyi geliştirmektir. Bu işlem, öncelikle pamuk fidelerinin 10 günlük ile iki haftalık evreye kadar büyütülmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, pamuk kloroplast rados 1 geni, tütün tıkırtı virüsü tabanlı bir VIGS vektörüne klonlanır.Üçüncü adım, P-T-R-V-R-N-A one ve P-T-R-V-G-R-C-A one içeren agrobacterium kültürlerini hazırlamaktır. Son adım, agrobacterium kültürlerini pamuk kotiler yapraklarına el ile inoküle etmektir. Nihayetinde, yaklaşık iki hafta sonra pamuk bitkilerinin gerçek yapraklarında albino fenotipinin gözlemlenmesiyle gen susturma sonuçları gösterilebilir.Bu tekniğin transformasyon gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, VIG'lerin pamukta gen fonksiyonu çalışmaları için hızlı ve verimli bir platform sunmasıdır. Bu yöntem, pamukta genom çapında gen fonksiyonunun hızlı ve geniş ölçekli analizi için güçlü bir araç olabilirken, diğer önemli ürün türlerine de uygulanabilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, agrobacterium kültürlerinin ve pamuk koza uçlarının el ile inokülasyonunun zor olması nedeniyle güçlük çekebilirler.Bu yöntem, virüs kaynaklı gen susturma için pamuk fideleri yetiştirmek gibi, pamuk genetiği ve genomikleri alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Birkaç adet yedi santimetrelik saksıya metro mix 700 ekleyin ve doldurulmuş saksıları bir tepsiye yerleştirin. Ardından, fiber max 8 3 2 phyto, gen 4, 2 5, RF phyto, gen four 80 WR ve delta pine 90 gibi birkaç upland pamuk çeşidinin tohumlarını ekin.Hazırlanan saksılarda, saksıyı içeren tepsiyi plastik bir kubbe ile kapatın ve tepsiyi 23 °C sıcaklığın, 120 µE m⁻² s⁻¹ ışık şiddetinin ve 12 saat aydınlık, 12 saat karanlık fotoperiyodun olduğu bir büyüme odasına yerleştirin; üç ila dört gün sonra, iki kotiledon ortaya çıktığında plastik kubbeyi kaldırın. Pamuk bitkilerinin, iki adet tamamen açılmış kotiledon geliştiği ancak gerçek yaprakların henüz ortaya çıkmadığı aşamaya gelene kadar yaklaşık 10 gün boyunca büyümesine izin verin; ardından bitkiler virüsle tetiklenen gen susturma analizi için kullanıma hazır hale gelecektir.Bu klonlama prosedürleri, pamuk bitkilerinin tam genişleme aşamasına ulaştığı iki haftalık süre boyunca gerçekleştirilmelidir. İlk olarak, yazılı protokolde belirtilen primerleri kullanarak, standart PCR prosedürlerine uygun olarak CACI remondi yaprak dokularından elde edilen bir cDNA kütüphanesindeki pamuk kloroplastları one genini amplifiye edin. Ardından, GCA one PCR ürününü, enzim üreticisinin protokollerine uygun olarak Eco R one ve K PN one ile sindirin.500 baz çiftlik PCR ürününü bir etidyum bromür jelinde görüntüleyin. Bandı kesip çıkartın ve DNA'yı ekstre edin, ardından saflaştırılmış PCR ürününü PYL 1 56 vektörüne ligeyin. T4 DNA Ligaz kullanarak, ligelenmiş vektörü kompetan e coli hücrelerine transforme edin ve ardından transforme edilmiş hücrelerin 10 ila 50 µL'sini, mililitre başına 50 µg kanamisin içeren LBA agar plaklarına yayın.Plakayı 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün plakadan koloniler seçin ve bunları mililitrede 50 µg kanamisin içeren 2 mL LB besiyerinde gece boyunca büyütün; bakterileri santrifüj ile hasat edin ve standart prosedürlere göre DNA izolasyonlarını gerçekleştirin. Plazmit DNA'yı saflaştırmak için konstrüktleri restriksiyon enzimi sindirimi ve dizileme ile doğrulayın.İnsertin PYL 1 56 vektöründeki varlığı ve yönelimi doğrulandıktan sonra, plazmidi agrobacterium tumor fas GV 3 1 0 1 hücrelerine elektroporasyon yoluyla aktarın ve 28 °C'de LB sıvı besiyerinde geri kazanım yapın. Transformantları, 50 µg/mL kanamisin ve 25 µg/mL gentamisin içeren LBI agar plaklarında seçin. Arzu edilirse, bakteriler -80 °C'de %25 gliserol içinde saklanabilir.İnokülasyondan üç gün önce, PYL 1 9 2 RNA one PY, 1 56 RNA two ve PY 1 56 RNA two GLA one taşıyan agrobacterium tumor facies dondurulmuş gliserol stoklarını LB antibiyotikli agar plaklarına ekim yapın ve plakları 28 °C'de 24 saat boyunca inkübe edin. Ertesi gün, her bir konstrükt için tek bir koloni seçin ve her koloniyi 50 µg/mL kanamisin ve 25 µg/mL gentamisin ile desteklenmiş 5 mL LB besiyerine inoküle edin.Bakteri kültürünü, dakikada 50 devir hıza ayarlanmış bir çalkalayıcıda, 28 °C'de gece boyunca büyütün. PYL 1 56 RNA two GLA one kültürü ile kontrol kültürlerini; 50 µg/mL kanmisin, 25 µg/mL Gentamisin, 10 mM MES ve 20 µM aseto-siringin ile desteklenmiş 50 mL LB besiyeri içeren ayrı erlenlere aktarın. Kültürü, dakikada 50 devir hıza ayarlanmış bir çalkalayıcıda, 28 °C'de gece boyunca büyütün.Ertesi gün, kültürleri santrifüj tüplerine aktarın ve agrobakteri hücrelerini dakikada 4.000 devirde beş dakika boyunca çöktürün; kültürü 10 millimolar magnezyum klorür, 10 millimolar MES ve 200 micromolar asetosiringon içeren infiltrasyon tamponunda yeniden süspande edin. Kültürün OD 600 değerini ölçün ve infiltrasyon tamponu ile 1,5'e ayarlayın. Agrobakteri yaprak infiltrasyonu öncesinde kültürü oda sıcaklığında, tezgah üzerinde üç saat boyunca inkübe edin.Pamuk bitkilerinin pamuk liderinin alt kısmını, pamuk liderini tamamen delmeden 25 gauge bir iğne ile delin. Pamuk liderinin her bir bölümüne bir veya iki delik açılır. Ardından, PYL 1 92 RNA bir agrobakteri kültürünü, ya PYL 1 56 RNA iki ya da PY 1 56 RNA iki GRCA bir ile bir bir oranında karıştırın.Ardından, bir mililitrelik bir iğne veya şırınga kullanarak karışımı, delinmiş delikler aracılığıyla kotiledon girişlerinin alt kısmına enjekte edin. Bitkileri plastik bir kubbe ile kapatın ve infiltre edilmiş bitkileri gece boyunca oda sıcaklığında, loş ışık koşullarında bırakın.Bitkileri 23 °C sıcaklığın olduğu, 12 saat aydınlık ve 12 saat karanlık döngüsünde, metre kare başına saniye başına 120 micro Einstein ışık şiddetine sahip bir büyüme odasına aktarın. Susturma fenotipini, infiltrasyondan yedi ila sekiz gün sonra inceleyin. Bu noktada, PY 1 56 RNA two GLA one ile susturulmuş bitkilerin gerçek yaprakları albino fenotipini göstermeye başlar.PYL 1 56 RNA iki taşıyan agro bakterilerle infiltre edilen bitkiler kontrol olarak hizmet eder. Standart prosedürlere göre kontrol ve susturulmuş pamuk bitkilerinden izole edilen RNA kullanılarak, ters transkripsiyon PCR ile endojen genlerin ekspresyon seviyesi incelenerek gen susturma verimliliğini doğrulayın.Bu görüntü, GLA1 geninin virüsle indüklenen gen susturulması sonrası fiber max 8 3 2 kültivarını göstermektedir. Burada gen susturulmasının gerçekleştiği beyaz renkli yapraklara dikkat ediniz. PHYTO four 80 WR kültivarı da virüsle indüklenen gen susturulması sonrası albino fenotipi sergilemektedir.Benzer şekilde, bu phyto 4 2 5 RF kültivarı, virüsle tetiklenen gen susturmanın gerçekleştiği bölgelerde beyaz yapraklar sergilemektedir. Son olarak, bu görüntü, bu kez Delta PINE 90 kültivarlarında gerçekleştirilen başarılı bir başka virüsle tetiklenen gen susturma deneyini göstermektedir. Bu prosedürü uygularken, agrobacterium kültürlerini bu işlemden sonra üç saat boyunca tezgahta bırakmadan önce içine aseton eklemeyi hatırlamak önemlidir.Geliştirilmesinin ardından yeni gen fonksiyonlarını araştırmak gibi ek soruları yanıtlamak için vig, CD NA kütüphanesi klonlaması gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu teknik, bitki genetiği alanındaki araştırmacıların, ekonomik açıdan önemli kültür bitkilerinde gen fonksiyonunu ve antibiyotik ile biyotik streslere karşı savunma tepkisini araştırmalarının önünü açmıştır. Maske verileri elde edildikten sonra, doğru şekilde yürütüldüğü takdirde bu teknik iki ila üç gün içinde tamamlanabilir.Bu videoyu izledikten sonra, pamukta virüs kaynaklı gen susturmanın nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

agrobacterium-mediated-virus-induced-gene-silencing-assay-in-cotton

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Knock-down gen ekspresyonu için bir virüs kaynaklı gen susturulması (VIGS) yöntemi...

Virüs indüklenen gen susturma (VIGS) Nicotiana benthamiana Ve Domates

Kaynak: Shi, J. ve diğerleri. Bitki Patojenlerinin Salgılanan Efektörlerinden RNA Susturucu Baskılayıcıların Taraması ve Tanımlanması. J. Vis. Exp. (2020)Bu video, Nicotiana benthamiana 16c'de RNA susturmasını baskılayan patojen efektör proteinlerini tanımlamak için bir ortak infiltrasyon testini göstermektedir. Floresan bir raporlayıcı ve aday efektör gen, Agrobakteriya aracılığıyla bitki yapraklarına aktarılır. Normalde, RNA susturması raporlayıcı transkriptleri bozur ve floresansı azaltır.

Bitki RNA Susturmasını Bastıran Patojen Efektörlerinin Taraması için Ortak İnfiltrasyon Testi

Kaynak: Shi, J. ve ark., Bitki patojenlerinin salgılanan efektörlerinden RNA susturucu baskılayıcılarının taraması ve tanımlanması. J. Vis. Exp. (2020)Bu video, asetosyringon ile virülans gen ifadesi indükleyerek Agrobacterium tumefaciens kültürünün hazırlanması ve ardından antibiyotik çıkarılması ile yıkama ve yeniden süspansiyon ile yapılmasını ve bitki dokularına gen taşınması için dönüşüme hazır bir süspansiyon oluşturulmasını göstermektedir.

Bitki Hücrelerine Gen Taşıması İçin Agrobakteriyel Kültürünün Hazırlanması

Kaynak: Beernink, B. M. ve diğerleri. Mısır fidanlarının doğrudan agroinaşılanması, rekombinant foxtail mozaik virüsü ve şekerkamışı mozaik virüsü bulaşıcı klonlarla enjeksiyon yapılmasıdır. J. Vis. Exp. (2021)Bu video, gen susturma için rekombinant viral klonların Agrobacterium aracılı olarak mısır fidanlarına aktarılmasını gösteriyor.  Agrobakteriyel enfeksiyon, sistemik viral yayılım ve RNA girişimiyle ilgili fenotipik değişiklikler sürecini özetlemektedir.

Gen Susturması için Rekombinant Viral Klonlarının Mısır Fidanlarına Agrobakteri Aracılı Teslimatı

Virüsün neden olduğu gen susturma, bitkilerin konakçı olmayan direncinde yer alan genleri tanımlamak için yararlı bir araçtır. Konakçı olmayan patojenlere duyarlı gen susturuculu bitkilerin tanımlanmasında GFPuv eksprese eden bakteriyel patojenlerin kullanımını gösteriyoruz. Bu yaklaşım kolay, hızlıdır ve büyük ölçekli taramayı kolaylaştırır ve diğer çeşitli bitki-mikrop etkileşimlerini incelemek için benzer bir protokol uygulanabilir.

Genler belirlenmesi için VIGS-aracılığı ile İleri Genetik Tarama konakçı olmayan Direnç ilgilendim

Agrobacteria (Tütün mozaik virüsü-esaslı) aşı antijenleri ve terapötik proteinleri üretmek için hızlı ve ekonomik bir yaklaşımdır başlatmak vektörleri taşıma ile vakum infiltrasyonu göre Nicotiana bitkilerinde geçici protein üretimi. Biz prosedürü basitleştirilmiş ve bakteri yetiştirme koşulları optimize konak türlerin seçimi, ve RNA susturulması bastırıcılara ko-tanıtarak hedef birikimini geliştirdi.

Optimizasyon ve Kullanımı<em&gt; Agrobacterium</emIn&gt; aracılı Geçici Protein Üretimi<em&gt; Nicotiana</em

Biz canlı hücrelerdeki karmaşık düzenleyici ve sinyal mekanizmaları incelemek soya önceki büyük miktarlarda hazırlanması için basit ve etkili iletişim kuralı geliştirilmiştir.

Soya önceki ve geçici gen ifade analiz için uygulama yalıtım için basit bir yöntem

Burada, bitki patojenlerinde RNA susturucularını hızlı bir şekilde taramak için yaygın olarak kullanılabilecek değiştirilmiş bir tarama yöntemi salıyoruz.

Bitki Patojenlerinin Gizli Efektörlerinden RNA Susturucu Baskılayıcıların Taranması ve Tanımlanması

Tilki kuyruğu mozaik virüsünün ve şeker kamışı mozaik virüslerinin mısır fidelerine aşılanması için Agrobacterium bazlı enjeksiyon (agroinjection) protokolü sunulmaktadır. Bu şekilde aşılama viral enfeksiyona, belirteç genlerinin virüs kaynaklı gen susturmalarına ve GFP'nin viral aşırı ekspresyonuna yol açar.

Rekombinant Foxtail Mozaik Virüs ve Şeker Kamışı Mozaik Virüs Bulaşıcı Klonlar ile Enjeksiyon ile Mısır Fidelerinin Doğrudan Agroinokokülasyonu

Burada, transgenik soya fasulyesi tüylü köklerinin yüksek verimli üretimi için bir protokol sunuyoruz.

Gen fonksiyonunun analizi için soya fasulyesi tüylü kök transformasyonu

Burada, büyük boyutlu bitkilerin genetik dönüşümünün in vivo çalışmaları için lokalize vakum infiltrasyonu için ilk protokolü sunuyoruz. Bu metodolojiyi kullanarak, ilk kez kakaonun planta geçici dönüşümünde Agrobacterium aracılı hale getirdik.

İnatçı Bitkilerin Planta Dönüşümü için Vakumla Zorla Agroinfiltrasyon: Bir Vaka Çalışması Olarak Kakao

Öğrenin, pamukta Agrobacterium aracılı VIGS yöntemiyle GrCLA1 gen susturmasını ve albino fenotip gözlemlerini. Bu teknik, gen fonksiyonu çalışmaları için hızlı bir platform sunar.

Pamuk olarak Agrobacterium Virüs Bağlı Gen susturma Testi

Daha fazla video keşfet