Name: Mikrodalga Transmisyon Elektron Mikroskobu ile Bitki Virüs Hastalıkları Hızlı Tanı Destekli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Öğrenin, mikrodalga destekli transmisyon elektron mikroskobu ile bitki virüs hastalıklarını hızlı teşhis etme yöntemini. Bu teknik, örnek hazırlama süresini yaklaşık iki saate indirerek yarım günde net tanı konulmasını sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Avusturya Bilim Fonu&#39;nun (FWF P20619 ve BZ için P22988) tarafından desteklenmiştir.

Mikrodalga destekli numune hazırlama <ol><li> Numune hazırlama birinin başlangıç ​​elektron mikroskobu için otomatik mikrodalga doku işlemci (Leica EM AMW; Leica Microsystems, Viyana, Avusturya) programlamak gerekiyor önce TEM için mikrodalga destekli numune hazırlama için aşağıdaki protokolleri (Tablo 1): <img src="/files/ftp_upload/2950/2950table1.jpg" alt="Tablo 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tablo 1"> Tablo 1. Mikrodalga radyasyon kullanarak numune hazırlama için protokol. Farklı sütunlar (soldan sağa) gösterir: <ol><li> Vial numarası (Vial no.) Şişenin işlemcinin atlıkarınca içine yüklenir sırasını temsil eder. </li><li> Gerçek sürecinin Adım. </li><li> Flakonlarda Reaktifler. </li><li> Gerçek adım süresi. </li><li> Mikrodalga ışınlama kapatılmadan önce flakon içinde ulaşılır maksimum sıcaklık. </li><li> Mikrodalga radyasyon ayar: Sürekli = hızlı sıcaklık artışlarlaase, ayarlanan sıcaklık tutarak; Eğim = nazik sıcaklık artışı, sonunda ulaşılan nihai sıcaklığı; sıcaklığı 5 düştü kadar Atımlı = Hızlı sıcaklık artışı, güç kapatıldığında ° C, güç sıcaklığa ulaşmak için yeniden başladı. </li><li> Mikrodalga radyasyonun Maksimum güç. </li></ol></li><li> Taze numune hazırlama protokolü (Agar 100 epoksi reçine için 1.7 'ye bakınız) açıklanan farklı adımları için çözümler hazırlamak, programlanan protokolü (Tablo 1) göre belirlenen şişeleri içine doldurun, atlıkarınca şişeleri yükleyin, ardından eklemek mikrodalga doku işlemci, ve içine carousel nihayet monomod odasına ilk flakon yükleyin. </li><li> 60mm Sørensen% 3 glutaraldehit (Agar Bilimsel Ltd, Stansted, İngiltere) bir damla bir modelleme mumu plaka üzerinde bir jilet ile Tütün Mozaik Virüsü (TMV) ile enfekte Nicotiana tabacum yapraklarını küçük bölümler (1mm 2) Kes Oda sıcaklığında fosfat tampon maddesi (pH 7.2)erature. </li><li> Hemen yaklaşık 200μm bir örgü genişliği ile belirlenen sepet içerisine ince cımbız ile bölümleri aktarın. Birbirlerinin üstüne sepetleri Yığın ve monomod odasının içine yerleştirin. Bakım örnekleri sürekli kurumasını yok ki yükleme ve sepetleri istifleme sırasında fiksatif solüsyonu ile kaplıdır dikkat edilmelidir. </li><li> Fiksasyon, dehidratasyon ve infiltrasyon için önceden programlanmış mikrodalga destekli numune hazırlama protokolü başlatın. </li><li> Numune hazırlama mikrodalga doku işlemci tarafından otomatik olarak gerçekleştirilir iken bölüm 3 (negatif boyanma) açıklandığı gibi kalan bitki materyali ile negatif boyanma ile devam edin. </li><li> Plastik bir kap içinde dolgu 24g Agar 100, 16g dodecenyl süksinik anhidrit ve 10 g metil nadic anhidrit (tüm bileşenler için Agar Bilimsel Ltd, Stansted, İngiltere bakınız), ısı: Taze aşağıdaki bileşenleri tarif gibi karıştırılarak Agar 100 epoksi reçine hazırlamak buna40 ° C ve iyice karıştırın. Benzil dimetilamin 1.2g ekleyin ve iyice karıştırın. Numune hazırlama protokolü sona (örneğin masa 1 adım 22 sırasında) gelir hemen önce belirlenen polimerizasyon içine Agar 100 epoksi reçine doldurun oluşturur. </li><li> Protokol tamamlandıktan sonra (tablo 1'de basamak sonra 22) monovalent odasından gelen atlıkarınca son şişenin içine sızma numuneleri içeren yığın sepet bırakın. Mikrodalga cihazdan atlıkarınca çıkarın, sepetler Unstack ve belirlenen polimerizasyon formları içine ince cımbız kullanarak bunları yükleyebilirsiniz. Bakım örnekleri her zaman unstacking ve kurumasını yok ki yükleme sırasında Agar 100 epoksi reçine ile kaplıdır dikkat edilmelidir. </li><li> Birbirlerinin üstüne polimerizasyon formları yığını. Bakım örnekleri her zaman istifleme ve kurumasını yok ki yükleme sırasında Agar 100 epoksi reçine ile kaplıdır dikkat edilmelidir. </li><li> Mikrodalga tiss bir atlıkarınca daha önce kullanılmış şişeleri kaldırue işlemci, yığılmış sepetleri ile yükleyebilirsiniz ve mikrodalga doku işlemci içine carousel yerleştirin. </li><li> Önceden programlanmış polimerizasyon protokolü (tablo 1) başlatın. </li><li> Polimerizasyon mikrodalga doku işlemci tarafından otomatik olarak yapılır iken, bir transmisyon elektron mikroskobu ile negatif boyanmış parmaklıkları incelemek [örneğin Philips CM10 TEM, FEI (eski Philips), Eindhoven, Hollanda] ve bölüm 3 ve 4 (açıklandığı gibi görüntü analizleri Negatif boyama ve görüntü analizi). </li><li> Protokol Unstack, monovalent odasından gelen polimerizasyon biçimleri polimerizasyon biçimleri kaldırmak ve numuneler içeren polimerize bloklar kaldırmak tamamlandıktan sonra. Onlar şimdi bir mikrotom ile kesitli olmaya hazırız. </li></ol> 2. Kırpma ve kesit <ol><li> Ultra ince tutucu yaklaşık yapışma üst üzerinde numune ile 1cm üzerinden kesit için ayrı numune tutucular içine bir veya daha fazla blok yerleştirin. </li><li>TEM (örneğin Leica Reichert Ultratrim; Leica Microsystems) için bir örnek düzeltici ile blok Trim böylece maksimum blok yüzü. Uzunluğu ve (yüz boyutu bloke elmas bıçak boyutuna ayarlanması gerekebilir) elde edilir mümkün olduğu kadar yaprak malzeme içeren genişlikte 200μm 1mm. </li><li> 45 ° (örn. Diyatomelere Ultra 45, Gröpl, Tulln, Avusturya) bir bıçak açıda bir elmas bıçak kullanarak; bir ultramicrotome (Leica Microsystems örneğin Reichert Leica ULTRACUT S) ile Bölüm bloğu. Kısım kalınlığı yaklaşık 70 ila 90 nm olacak şekilde ayarlanmalıdır ve kesme hızı 1 mm / s civarında olmalıdır. Bir formvar (Agar Bilimsel Ltd) kaplı bakır veya nikel 200 kare mesh ızgara ile birden çok bölüm toplayınız. </li><li> Kısmen 2-ücretsiz CO oluşturmak için NaOH ile dolu bir petri 5 dakika; kurşun sitrat (42ml çift distile su ve 8ml 1N NaOH içinde çözülmüş 1.1 g kurşun sitrat Agar Bilimsel Ltd) ile ızgara üzerinde bölümler Post-leke çevre ve 15 mil için% 1 uranil asetat (Agar Scientific Ltd) ile nutes oda sıcaklığında damıtılmış su içinde çözülmüştür. Her post-boyama adım arasında 1 dakika için damıtılmış su ile ızgaraları yıkayın. Hava bir ızgara kutusuna ızgaraları kurutun. </li><li> Bir transmisyon elektron mikroskobu (örneğin Philips CM10 TEM, FEI, Eindhoven, Hollanda) ile bölümleri inceleyin. </li></ol> 3. Negatif boyama <ol><li> TMV ile enfekte yaprak malzeme 100mg hakkında ve 60mm Søfrensen fosfat tamponu (pH 7.2) 100μl bir mikroskop lamı üzerine bir jilet ile 2 dakika boyunca malzeme homojenize ham sap hazırlamak Hasat. </li><li> 4 ya da daha çok kuyucuk (alternatif olarak parafilm bir parça üzerinde homojenat aktarmak mümkündür) bir teflon kaplı mikroskop slaytı iyi ilk üzerine çıkan Homojenat 20uL aktarın. </li><li> Damla ve incu dönük formvar (Agar Bilimsel Ltd) kaplamalı yüzü Homojenat üstüne formvar kaplı ızgara yerleştirin5 dakika boyunca kesmek. </li><li> 200μl 60mm Sørensen fosfat tampon maddesi (pH 7.2) ve iki damla üzerinde ızgara yerleştirerek ızgara 2 dakika için 2 defa yıkanır. </li><li> Bir taze hazırlanmış% 2 fosfotungstik asit (Agar Scientific Ltd) 60mm Sørensen fosfat tampon maddesi (pH 6.5) içinde çözelti ile 1 dakika için ızgara inkübe edin. </li><li> Izgara çıkarın ve bir ızgara kutusuna kurumaya bırakın. </li><li> Bir transmisyon elektron mikroskobu (; FEI, Eindhoven, Hollanda örneğin Philips CM10 TEM) ile ızgara inceleyin. 21000X veya daha yüksek bir primer büyütmede transmisyon elektron mikroskobu ile rastgele seçilen olumsuz lekeli virionlar en az 10 görüntü (en az 10 veya daha fazla virionlar her görüntü üzerinde görünür olmalıdır) atın. Bakım tüm görüntüler de aynı büyütme olduğunu alınmalıdır. </li></ol> 4. Görüntü analizi <ol><li> Alınan mikrografları, üzerinde en azından 100 rasgele seçilmiş tek bir virüs partiküllerinin uzunluğu ve genişliği ölçülürherhangi bir görüntü analizi bilgisayar yazılımı kullanarak olumsuz lekeli örnekleri partikül analizi aracı veya Optimas ile [örneğin Hücre D (Olympus, Yaşam ve Malzeme Bilimleri Europe GmbH, Hamburg, Almanya) 6.5.1-(Medya Sibernetik Inc, Bethesda, Maryland, USA)]. </li><li> Negatif boyama yöntemleri ve TEM ile görselleştirilmiş virüs partiküllerinin bir ortalama uzunluk ve genişlik elde etmek için ortalama ve standart sapma hesaplanır. </li><li> Açıkça virüs hastalıkları belirlemek için, literatürde bilinen virüs hastalıkları tarafından uyarılan virüsler ve yapısal değişikliklerin bir uzunluk boyutlarına sahip ve yapısal özellikleri (2.5 de elde edilmiştir) karşılaştırın. </li></ol> 5. Temsilcisi sonuçları: Gibi mikrodalga destekli numune hazırlama tipik TMV indüklenen ultrastrüktürel değişiklikler sonra paralel biçimde hizalanmış virionlar içeren geniş alanlar enfekte Nicotian arasında sitoplazmada transmisyon elektron mikroskobu ile gözlenebilirbir tabacum hücreleri (Şekil 1A). Ayrıca TMV ile enfekte olan ham sap TMV parçacıklar negatif boyanma sonra kıvrımlı, çubuk şeklindeki yapılar (Şekil 1B) olarak gözlenebilir bırakır. 100 virüs partiküllerinin Görüntü analizi uzunluk ve genişlik olarak 17nm olarak 280 nm (Şekil 2) TMV bir ortalama boyutu ortaya çıkardı. TMV ile enfekte olmuş hücrelerine Bu çalışmada gözlenen virionlar ebadında bir ince yapı TMV parçacıkların tütün ve boyut aralığı içinde TMV bağlı ince yapı özelliklerine uygun olarak, daha önce literatürde bildirilen 9-15 olduğu tespit edilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/2950/2950fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> TMV ile enfekte yaprak hücreleri ve virionlar Şekil 1. Transmisyon elektron mikroskop. A) Görüntü Nicotiana tabacum mikrodalga destekli bitki numune hazırlama sonrası TMV ile enfekte mezofil yaprak hücrelerinin ince yapısı gösterir. Sitoplazmada biriken paralel hizalanmış virionlar geniş alana dikkat.C nişasta = kloroplast (St), M = Mitokondri, N = nükleus, V = vakuol, Bar = 2μm. B) Görüntü enfekte yaprakların sap negatif boyanma tespit edildi virionlar gösterir. <img src="/files/ftp_upload/2950/2950fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2,"> Şekil 2. Virionlar nispi büyüklüğü. Uzunluğu ve negatif boyanma onlar elektron mikroskobu göründüğü gibi enfekte yaprakların sap sonra TMV-parçacıkların genişliği Göreli dağılımı. (Uzunluk / genişlik ortalama ± standart sapma) değerleri ortalamaları 100 virionlar hesaplandı.

<ol><li>Bozzola, J. J., Russell, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBozzola%2C+JJ+%22Electron+Microscopy%22">Electron Microscopy</a>. , Jones and Barlett Publishers. Boston. (1999).</li>
<li>Kuo, J. Processing plant tissues for ultrastructural study. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKuo%2C+J+%22Methods+in+Molecular+Biology%2C+Electron+Microscopy%2C+Methods+and+Protocols%22">Methods in Molecular Biology, Electron Microscopy, Methods and Protocols</a>. Kuo, J. 369, Humana Press. 47-65 (2007).</li>
<li>Schroeder, J. A., Gelderblom, H. R., Hauroeder, B., Schmetz, C., Milios, J., Hofstaedter, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave-assisted+tissue+processing+for+sameday+EM-diagnosis+of+potential+bioterrorism+and+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Microwave-assisted tissue processing for sameday EM-diagnosis of potential bioterrorism and clinical samples.</a> Micron. 37, 577-590 (2006).</li>
<li>Webster, P. Microwave-assisted processing and embedding for transmission electron microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWebster%2C+P+%22Methods+in+Molecular+Biology%2C+Electron+Microscopy%2C+Methods+and+Protocols%22">Methods in Molecular Biology, Electron Microscopy, Methods and Protocols</a>. Kuo, J. 369, Humana Press. 47-65 (2007).</li>
<li>Zechmann, B., Zellnig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave+assisted+rapid+plant+sample+preparation+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Microwave assisted rapid plant sample preparation for transmission electron microscopy.</a> J. Microsc. 233, 258-268 (2009).</li>
<li>Lería, F., Marco, R., Medina, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+antigenic+preservation+of+plant+samples+by+microwave-enhanced+fixation%2C+using+dedicated+hardware%2C+minimizing+heat-related+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Micr.+Res.+Techniq%22%5BJournal%5D)">Structural and antigenic preservation of plant samples by microwave-enhanced fixation, using dedicated hardware, minimizing heat-related effects.</a> Micr. Res. Techniq. 65, 86-100 (2004).</li>
<li>Giberson, R. T., Austin, R. L., Charlesworth, J., Adamson, G., Herrera, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave+and+digital+imaging+technology+reduce+turnaround+times+for+diagnostic+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrastruct.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Microwave and digital imaging technology reduce turnaround times for diagnostic electron microscopy.</a> Ultrastruct. Pathol. 27, 187-196 (2003).</li>
<li>Cavusoglu, I., Minbay, F. Z., Temel, S. G., Noyan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+polymerisation+with+microwave+irradiation+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Morph%22%5BJournal%5D)">Rapid polymerisation with microwave irradiation for transmission electron microscopy.</a> Eur. J. Morph. 39, 313-317 (2001).</li>
<li>Ermolina, I., Morgana, H., Greena, N. G., Milnerb, J. J., Feldmanc, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dielectric+spectroscopy+of+tobacco+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Dielectric spectroscopy of tobacco mosaic virus.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1622, 57-63 (2003).</li>
<li>Maeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atomic+force+microscopy+study+for+the+assembly+structures+of+tobacco+mosaic+virus+and+their+size+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">An atomic force microscopy study for the assembly structures of tobacco mosaic virus and their size evaluation.</a> Langmuir. 13, 4150-4161 (1997).</li>
<li>Milne, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplication+of+tobacco+mosaic+virus+in+tobacco+leaf+palisade+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Multiplication of tobacco mosaic virus in tobacco leaf palisade cells.</a> Virology. 28, 527-532 (1966).</li>
<li>Reunov, A. V., Gnutova, I. V., Lapshina, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+tobacco+mosaic+virus+strains+on+the+ultrastructure+of+tobacco+leaf+parenchymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Bull%22%5BJournal%5D)">Effect of tobacco mosaic virus strains on the ultrastructure of tobacco leaf parenchymal cells.</a> Biol. Bull. 33, 409-415 (2006).</li>
<li>Sachse, C., Chen, J. Z., Coureux, P. D., Stroupe, M. E., Fändrich, M., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+electron+microscopy+of+helical+specimens%3A+a+fresh+look+at+tobacco+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution electron microscopy of helical specimens: a fresh look at tobacco mosaic virus.</a> J. Mol. Biol. 371, 812-835 (2007).</li>
<li>Smith, M. L., Lindbo, J. A., Dillard-Telm, S., Brosio, P. M., Lasnik, A. B., McCormick, A. A., Nguyen, L. V., Palmer, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+tobacco+mosaic+virus+particles+as+scaffolds+for+display+of+protein+antigens+for+vaccine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Modified tobacco mosaic virus particles as scaffolds for display of protein antigens for vaccine applications.</a> Virology. 348, 475-488 (2006).</li>
<li>Zechmann, B., Zellnig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+TEM+diagnosis+of+plant+virus+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Rapid TEM diagnosis of plant virus diseases.</a> J. Virol. Meth. 162, 163-169 (2009).</li>
<li>Giberson, R. T., Demaree, R. S. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave+processing+techniques+for+electron+microscopy%3A+a+four-hour+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Molec.+Biol%22%5BJournal%5D)">Microwave processing techniques for electron microscopy: a four-hour protocol.</a> Meth. Molec. Biol. 117, 145-158 (1999).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

TEM için Mikrodalga destekli bitki numune hazırlama birkaç saat 3,4,16 içinde hızlı ve güvenilir ultrastrüktürel verilerini sağlamak için kanıtlanmıştır. Bu çalışmada kullanılan yöntem ile elde organelleri ve membranlar ince yapısal korunması örnek fiksasyon muazzam bir azalma avantajı ile 5,15 konvansiyonel ve cryofixed örnekleri benzer ve yaklaşık 2 saat 3 gün veya daha uzun zaman almasi. Bu, literatürde mevcut TEM için hızlı numune hazırlama protokol temsil eder. Bu çalışmada açıklanan yöntemi TMV bağlı ultrastrüktürel değişiklikler ve viral ajan kendisini açık ve hızlı kimlik izin negatif boyama yöntemleri ile TEM için mikrodalga destekli bitki numune hazırlama birleştirdi. TMV indüklenen ultrastrüktürel değişiklikler transmisyon elektrik fiksasyon başlangıcından sonra yaklaşık 4 saat içinde, kırpma kesit ve post-boyama sonra incelenmiştir olabilirtron mikroskop. Tam otomatik numune hazırlama modunun kullanılması viral ajan boyutu ve genişliğini belirlemek için geçici olarak negatif boyama yapmak için araştırmacı bırakılmış. Böylece, bu yöntem bitki fitopatolojinin tarım ve bilimsel deneyler ileride kullanmak için büyük önem taşımaktadır yaklaşık yarım gün bitki virüs hastalıklarının net ve hızlı tanı sağlar sonucuna varabiliriz. Bu yöntem, aynı zamanda, insan ve hayvan hastalıklarının hızlı teşhis için kullanılabilir gibi tıp ve veteriner patoloji, gelecekteki kullanım için büyük bir potansiyele sahiptir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / ekipman Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Glutaraldehit </td><td> Agar Bilimsel Ltd </td><td> R1312 </td><td></td></tr><tr><td> Osmiyum tetroksit </td><td> Agar Bilimsel Ltd </td><td> R1022 </td><td></td></tr><tr><td> Agar 100 reçine </td><td> Agar Bilimsel Ltd </td><td> R1043 </td><td></td></tr><tr><td> Dodecenyl süksinik anhidrit </td><td> Agar Bilimsel Ltd </td><td> R1051 </td><td></td></tr><tr><td> Metil nadic anhidrit </td><td> Agar Bilimsel Ltd </td><td> R1081 </td><td></td></tr><tr><td> Benzil dimetilamin </td><td> Agar Bilimsel Ltd </td><td> R1060 </td><td></td></tr><tr><td> Sitrat Kurşun </td><td> Agar Bilimsel Ltd </td><td> R1210 </td><td></td></tr><tr><td> Uranil asetat </td><td> Agar Bilimsel Ltd </td><td> R1260A </td><td></td></tr><tr><td> Fosfotungstik asit </td><td> Agar Bilimsel Ltd </td><td> R1213 </td><td></td></tr><tr><td> Formvar </td><td> Agar Bilimsel Ltd </td><td> R1202 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Leica EM AMW </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Leica (Reichert) Ultratrim </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td> Yeni modeli mevcuttur </td></tr><tr><td> Leica (Reichert) ULTRACUT S </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td> Yeni modeli mevcuttur </td></tr><tr><td> Diyatomelere Ultra 45 </td><td> Gröpl </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Philips CM10 TEM </td><td> FEI (eski Philips) </td><td> &lt;/ Td&gt; <td> Yeni modeli mevcuttur </td></tr><tr><td> Hücre D </td><td> Olympus A.Ş. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Optimas 6.5.1 </td><td> Medya Sibernetik A.Ş. </td><td></td><td> Yeni sürümü mevcut </td></tr></tbody></table>

mikrodalga transmisyon elektron mikroskobu ile bitki virüs hastalıkları hızlı tanı destekli

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Virüsler tarafından oluşturulan ultrastrüktürel değişikliklerin incelenmesi genellikle açıkça Bitkilerde viral hastalıkların saptanması için gereklidir. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) için geleneksel numune hazırlama ile bu soruşturmaların birkaç gün 1,2 alabilir ve bu nedenle bitki virüs hastalıklarının hızlı tanı için uygun değildir. Mikrodalga tespit ölçüde geleneksel numune hazırlama 3-5 sonra gözlemlenen ile benzer sonuçlar ile ince yapı TEM incelemeler için numune hazırlama süresini azaltmak için kullanılabilir. Birçok farklı ölçüye mikrodalga cihazlar başarılı tespit ve TEM araştırmalar 5-8 için biyolojik numunelerin gömülmesi için kullanılabilecek şu anda mevcuttur. Bu çalışmada Tütün Mozaik Virüsü göstermektedirler (TMV) o T mikrodalga destekli numune hazırlama ile yaklaşık yarım gün içinde yapraklarda ultrastrüktürel değişiklikler teşhis etmek mümkün olduğunu Nicotiana tabacum bitkileri enfekteEM. Birçok adımlar yine elle 6-8 yapılmak zorundadır ve bu nedenle daha fazla zaman ve emek alıcı olan diğer mevcut cihazlar aksine neredeyse tamamen otomatik olarak 5 numune hazırlama yapar gibi biz piyasada satılan bir mikrodalga cihazı ile bu çalışma gerçekleştirmek için seçtiniz. Numune hazırlama kalan TMV-enfekte yaprakları ve ince yapısı ve boyutu, aşağıdaki inceleme sap içinde viral parçacıkların tam otomatik olarak negatif boyama gerçekleştirilir olarak tespit ve gömme sırasında gerçekleştirilebilir.

Bu çalışma, transmisyon elektron mikroskobu ve negatif boyama yöntemleri için mikrodalga destekli bitki numune hazırlama kombinasyonu kullanarak yaklaşık yarım gün bitki virüs hastalıklarının hızlı ve net bir teşhis sağlayan bir yöntem açıklanır.

Mikrodalga Transmisyon Elektron Mikroskobu ile Bitki Virüs Hastalıkları Hızlı Tanı Destekli

Bitkilerdeki viral hastalıkların net bir şekilde tanımlanabilmesi için, virüslerin neden olduğu ultrastrüktürel değişikliklerin araştırılması sıklıkla gereklidir. Geleneksel örnekleme...

Bu prosedürün genel amacı, bitki virüs hastalıklarını transmisyon elektron mikroskobu kullanarak birkaç saat içinde teşhis etmektir. Prosedür, enfekte bitki materyalinin mikrodalga destekli fiksasyonu ve gömülmesi ile başlar. Bir sonraki adım, bitki örneklerinden negatif boyama yoluyla virüs partiküllerinin çıkarılması ve boyanması, ardından gömülü bitki örneklerinin kesitlerinin alınmasıdır.Ardından örnekler transmisyon elektron mikroskobunda incelenir ve virüs partiküllerinin boyutu görüntü analizi ile ölçülür. Sonuçlar, nihayetinde tipik virüs kaynaklı ultrastrüktürel değişiklikleri ve transmisyon elektron mikroskopi yöntemleri aracılığıyla virüs partiküllerinin boyutunu göstermektedir. Bu tekniğin, birkaç gün sürebilen oda sıcaklığında geleneksel fiksasyon ve gömme gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, transmisyon elektron mikroskopisi için örnek hazırlama süresinin yaklaşık iki saate indirilebilmesi ve böylece viral hastalığın net teşhisinin yaklaşık yarım gün içinde konulabilmesidir.Bu prosedürü beraberle gerçekleştirecek olan kişiler, teknisyen Gerhard Kaba ve laboratuvarımızdan meslektaşım Profesör Zelnik olacaktır. Numune hazırlama programının başlangıcından önce, elektron mikroskobu için otomatik mikrodalga doku işlemcisini LA A-E-M-A-M-W uygun protokollerle hazırlayın. Programlanmış protokolde tanımlanan fiksasyon, dehydrasyon ve infiltrasyonun farklı adımları için çözeltileri hazırlayın, bunları protokole göre belirlenen şişelere doldurun ve şişeleri karusele yerleştirin. Karuseli mikrodalga doku işlemcisine yerleştirin ve ardından ilk şişeyi mono mod haznesine yükleyin.Ardından, tütün mozaik virüsü (TMV) ile enfekte edilmiş Nicotiana tütünü yapraklarından, oda sıcaklığında glutaraldehit içeren Soren's fosfat tamponu içindeki bir damla çözelti içerisinde, modelleme mumlu bir plaka üzerinde jiletle küçük bölümler kesin. Numunelerin toplanması ve sepetlere yerleştirilmesi sırasında, kurumamaları için her zaman fiksatif çözelti ile kaplı olduklarından emin olmak önemlidir. İnce cımbızlar kullanarak, kesilen bölümleri derhal yaklaşık 200 µm gözenek genişliğine sahip belirlenmiş sepetlere aktarın.Sepetleri üst üste istifleyin ve mono mod haznesine yerleştirin. Fiksasyon, dehidrasyon ve infiltrasyon için önceden programlanmış mikrodalga destekli numune hazırlama protokolünü başlatın. Numune hazırlama protokolü sona ermeden hemen önce, belirlenen polimerizasyon kalıplarını taze hazırlanmış agar 100 epoksi reçine ile doldurun.Protokol tamamlandıktan sonra, infiltre edilmiş örnekleri içeren üst üste dizili sepetleri mono mod odağından atlıcarın son tüpüne boşaltın. Atlıcarı mikrodalga cihazından çıkarın ve örnekleri içeren tüpü atlıcar üzerinden alın. Ardından sepetleri tüpten çıkarın ve ince cımbız kullanarak üst üste dizilmiş sepetleri ayırın.Numuneleri belirlenmiş polimerizasyon formlarına yerleştirin. Ardından, polimerizasyon formlarını üst üste istifleyin ve daha önce kullanılmış tüpleri mikrodalga doku işlemcisinin karuselinden çıkarın. Karuseli istiflenmiş sepetlerle doldurun ve karuseli mikrodalga cihazına yerleştirin.Şimdi önceden programlanmış polimerizasyon protokolünü başlatın. Protokol sona erdiğinde, polimerizasyon kalıplarını mono mod odasından çıkarın ve üst üste dizili hallerini ayırın. Numuneleri içeren polimerize blokları çıkarın; bu bloklar artık mikrotom ile kesilmeye hazırdır, böylece numuneleri içeren blokların kesilme işlemine geçilebilir.Ultra ince kesim için bir veya daha fazla bloğu ayrı numune tutuculara yerleştirin. Numune üstte olacak şekilde, tutucudan yaklaşık bir santimetre dışarı çıkmasını sağlayın. Mümkün olduğunca fazla yaprak materyali içeren, maksimum bir milimetre uzunluğunda ve 200 mikrometre genişliğinde bir blok yüzeyi elde etmek için bloğu TEM için uygun bir numune kırpıcı ile düzeltin.Ultra mikrotomu, yaklaşık 1 mm/s kesme hızında, 70 ila 90 nanometre kalınlığında kesitler alacak şekilde ayarlayın. Bloğu, 45 derecelik bir bıçak açısıyla elmas bıçak kullanarak kesin. Form VAR kaplı bakır veya nikel 200 kare gözenekli (mesh) ızgarayla birden fazla kesit alın; ızgara üzerindeki kesitleri, CO2 içermeyen bir ortam oluşturmak için kısmen NaOH ile doldurulmuş bir Petri kabı içerisinde, beş dakika boyunca kurşun sitrat ile post-boyamaya tabi tutun.Izgaraları bir dakika boyunca distile su ile yıkayın. Son olarak, ızgaraları bir dakika distile su ile yıkadıktan sonra, oda sıcaklığında distile suda çözülmüş %1 uranil asetat ile 15 dakika boyunca karşı boyama yapın ve bir ızgara kutusunda havada kurumaya bırakın. Mikrodalga doku işlemci tarafından örnek hazırlama işlemi otomatik olarak gerçekleştirilirken, geri kalan bitki materyalinin negatif boyaması yapılır.İlk olarak, yaklaşık 100 miligram TMV enfekte yaprak materyali toplayın ve materyali bir lam üzerinde jiletle iki dakika boyunca homogenize ederek kaba SAP hazırlayın. İşlemi sorens ve fosfat tamponu içinde gerçekleştirin. Elde edilen homogenatın 20 µL'sini Teflon kaplı bir mikroskobun ilk kuyucuğuna aktarın.Dört veya daha fazla kuyucuğu olan bir lam. Ardından, form VAR kaplı tarafı damlacığa bakacak şekilde, form VAR kaplı ızgarayı homogenatın üzerine yerleştirip beş dakika inkübe edin. Izgarayı, bir damla sorbitol ve fosfat tamponu üzerine yerleştirerek iki dakika boyunca yıkayın.Yıkama işlemini iki dakika daha tekrarlayın. Ardından, ızgarayı taze hazırlanmış bir fosfo tungsten asit çözeltisi ile bir dakika boyunca inkübe edin. Bir dakika sonra ızgarayı çıkarın ve havada kurumaya bırakın.Bir ızgara kutusunda, negatif boyalı ızgarayı numune tutucuya yerleştirin ve bir transmisyon elektron mikroskobu ile inceleyin. Polimerizasyon işlemi mikrodalga doku işlemci tarafından otomatik olarak gerçekleştirilirken, rastgele seçilmiş negatif boyalı iyonların en az 10 görüntüsünü alın. Her görüntüde en az 10 veya daha fazla iyon görünür olmalıdır.Transmission elektron mikroskobu ile 21.000 x veya daha yüksek bir birincil büyütmede çalışırken, tüm görüntülerin aynı büyütmeye sahip olmasına dikkat edilmelidir. Mikrodalga doku işlemcisi ile otomatik olarak işlenen doku örneklerini içeren kesitler de transmission elektron mikroskobu ile incelenir. TEM ile elde edilen görüntülerin analizi, herhangi bir görüntü analizi yazılımı kullanılarak gerçekleştirilebilir.Parçacık analiz aracına sahip bilgisayar yazılımı. Negatif boyalı örneklerden alınan mikrograflar üzerinde rastgele seçilmiş en az 100 adet tekil virüs parçacığının uzunluğunu ve boyutunu ölçün. Mikrodalga destekli örnek hazırlama sonrası negatif boyama yöntemleri ve TEM ile görüntülenen virüs parçacıklarının ortalama uzunluk ve genişliğini belirlemek için ortalamaları ve standart sapmaları hesaplayın.Enfekte olmuş Nicotiana tobacco hücrelerininle sitozolünde, iletim elektron mikroskobu ile paralel formda dizilmiş iyonlar içeren geniş alanlar gibi tipik TMV kaynaklı ultrastrüktürel değişiklikler gözlemlenebilir. Bu iletim elektron mikrografında C nişastalı kloroplastı, St.M mitokondriyumu, is çekirdeği ve V ise vakuolü temsil etmektedir.Ek olarak, TMV enfekte yaprakların ham SAP'sinde, negatif boyama sonrası TMV partikülleri çubuk şeklinde yapılar olarak gözlemlenebilmiştir. Şekil bir B. Bu grafik, elektron mikroskobunda görünen 100 TMV partikülünün uzunluk ve genişliğinin göreceli dağılımını göstermektedir. Negatif boyama sonrası, enfekte yaprak özsuyundaki virüs partiküllerinin görüntü analizi, TMV için ortalama boyutun 280 nanometre uzunluk ve 17 nanometre genişlik olduğunu ortaya koymuştur. Beyin virüsü hastalıklarını hızlı bir şekilde teşhis etmek için geliştirilmesinden sonra.Bu teknik, hayvan ve insan patolojisi alanındaki araştırmacıların, hayvan ve insan hastalıklarını transmisyon elektron mikroskopisi ile hızlı bir şekilde teşhis etmelerinin yolunu açabilir.

microwave-assisted-rapid-diagnosis-plant-virus-diseases-transmission

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bitki hücreleri arasındaki makromoleküler ticareti, geçici bir ilgi floresan etiketli protein ifade ve konfokal mikroskobu ile içi ve hücreler arası dağılımı analiz değerlendirilebilir.

-Cell Hücre makromoleküler Ulaştırma Testi Planta Biyolistik Bombardıman kullanımı

Bizim anlayış ve böcek ile yayılan bitki virüsleri birçok yönetmek üzere yeteneğini geliştirmek vektörünün kullanımını gerektirir. Bitki virüslerinin Böcek iletim tritrophic etkileşim olduğunu ve bu gibi böcekler, virüs ve bitkinin manipülasyonu gerektirir. Vektörler sayıda yetiştirilen ve test bitkilerinin iletim yüksek oranda temin etmek gibi bir şekilde manipüle edilebilir olmalıdır. Beyaz sinek yetiştirme ve manipüle...

Whiteflies kullanarak Verici Bitki Virüsler

Bitki viral nanopartiküller (VNPs) biyomedikal uygulamalar için platformlar umut vericidir. Burada, biz bitki VNP yayılımı, saflaştırma, karakterizasyon ve bioconjugation ilişkin prosedürler anlatılmaktadır. Son olarak, biz bir fare ksenogreft model ve floresan görüntüleme kullanılarak tümör homing ve görüntüleme için VNPs uygulama göstermektedir.

Viral Nanopartiküller<em&gt; In vivo</em&gt; Tümör Görüntüleme

Biz, böcek ve bitki dokularında virüs ve bakterilerin lokalizasyonu için burada in situ hibridizasyon, basit bir floresan (FISH) yöntemi tarif eder. Bu protokol bütün montaj mRNA görselleştirme ve mikroskopik bölümleri için uzatılabilir.

Floresan<em&gt; In situ</emVirüsler ve Bitki ve Böcek Dokularda Endosimbiyotik Bakterilerin lokalizasyonu&gt; Hibritlemeler (FISH)

Yüksek kaliteli transmisyon elektron mikroskobu görüntüleri elde etmek, özellikle bol miktarda büyük su dolu vakuollere ve havalandırılmış alanlara sahip bitki hücreleri söz konusu olduğunda zordur. Tandem yüksek basınçlı dondurma ve hızlı dondurma ikamesi, mükemmel ultrastrüktürel korumaya sahip numuneler üretirken TEM için tesis numunelerinin hazırlanma süresini büyük ölçüde azaltır.

Tandem Yüksek basınçlı Donma ve Transmisyon Elektron Mikroskobu için Bitki Doku Hızlı Dondurma Değişiklik

Burada, dev virüslerin asfarvirüs ile ilgili yeni bir soyu olan Faustovirus'un yeni genotiplerinin karakterizasyonu için viral izolasyondaki en son gelişmeleri açıklıyoruz. Bu protokol, virüslerin, özellikle amipleri enfekte eden dev virüslerin yüksek verimli izolasyonuna uygulanabilir.

Kullanımı Çevre Örneklerinde Yeni Faustoviruses İzolasyonunda bir Hızlı Stratejisi<em&gt; Vermamoeba vermiformis</em

Bitki patojenleri yerinde, özellikle toprak kaynaklı patojenler, hızlı ve doğru tespiti daha fazla inoculum üretim ve alanında bitki hastalıklarının yayılması önlemek için çok önemli olduğunu. Burada bir taşınabilir gerçek zamanlı PCR algılama sistemi kullanılarak geliştirilen yöntem yerinde tanı alan koşullarında sağlar.

Toprak kaynaklı Phytopathogens bir taşınabilir gerçek zamanlı PCR sistemi kullanarak yerinde moleküler tespiti

Negatif leke EM makromoleküllerin yapısı görselleştirme için güçlü bir tekniktir, ancak farklı boyama teknikleri bir örnek bağımlı şekilde değişen sonuçlar üretebilir. Burada birkaç negatif boyama yaklaşım zorlu sistemleri görselleştirme mücadele için ilk bir iş akışı sağlamak için ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Negatif varyasyonlarında leke elektron mikroskobu yöntemleri: sistemleri zorlu mücadele için Araçlar

Patatesteki endojen mikroRNA'ları (miRNA'lar) işlevsel olarak karakterize etmek için patates virüsü X (PVX) bazlı mikroRNA susturma (VbMS) sistemi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. İlgi çekici miRNA hedef mimik (TM) molekülleri PVX vektörüne entegre edilir ve hedef miRNA veya miRNA ailesini susturmak için patatesle geçici olarak ifade edilir.

Patates virüsü X bazlı mikroRNA Susturma (VbMS) Patateste.

Eksize edilmiş böcek bağırsaklarında hem bitki virüsü proteinlerinin hem de vektör böcek proteinlerinin immünofloresan etiketlenmesi için bu protokol, virüs ve vektör böcekleri, böcek protein fonksiyonları ve virüs bulaşmasının altında yatan moleküler mekanizmalar arasındaki etkileşimleri incelemek için kullanılabilir.

Hemipteran Bağırsaklarda Bitki Virüsü ve Böcek Vektör Proteinlerinin İmmünofloresan Etiketlenmesi

Bu video protokolü, virolojik örneklerin taramalı transmisyon elektron mikroskobu tomografisinin nasıl gerçekleştirileceğini göstermektedir. Optimum sonuçlar için numuneler, yüksek basınçlı dondurma ve ardından dondurma ikamesi ile hazırlanır.

Virolojide Taramalı Transmisyon Elektron Mikroskobu Tomografisi: Yüksek Basınçlı Dondurulmuş, Dondurularak İkame Edilmiş Örneklerin 3 Boyutlu Görüntülenmesi

Öğrenin, mikrodalga destekli transmisyon elektron mikroskobu ile bitki virüs hastalıklarını hızlı teşhis etme yöntemini. Bu teknik, örnek hazırlama süresini yaklaşık iki saate indirerek yarım günde net tanı konulmasını sağlar.

Mikrodalga Transmisyon Elektron Mikroskobu ile Bitki Virüs Hastalıkları Hızlı Tanı Destekli

Daha fazla video keşfet