Koku Duyu Nöronlar lentivirüs aracılı Genetik Manipülasyon ve Görselleştirme In vivo

Nörobilimde gelişimi incelemenin zorluklarından biri, dendritik ve aksonal morfolojileri in vivo ortamda tek hücre düzeyinde yakalamaktır. Olfaktör sistemde, olfaktör duyusal nöronlar aksonlarını burundaki olfaktör epitelden beyindeki olfaktör bulba doğru uzatırlar. Birden fazla olfaktör duyusal nöron olfaktör bulba doğru projeksiyon gönderdikçe, demetler halinde birleşirler.

Bu durum, bireysel akson yörüngelerinin ve bunların terminal morfolojilerinin incelenmesini zorlaştırmaktadır. GFP konstrüktü taşıyan lentivirüslerin mikroenjeksiyon yoluyla uygulanmasıyla, tekil olfaktör duyusal nöronları in vivo olarak görsellemek için bir yöntem geliştirdik.

Lentivirüs ile başarılı transdüksiyon, terminal arbor dahil olmak üzere tüm olfaktör duyusal akson uzunluğunu aydınlatır. Tekil olfaktör duyusal nöronları görselleştirmenin yanı sıra bu yöntem, belirli bir ilgi odağındaki genin fonksiyonunu in vivo bağlamda incelemek için gen ekspresyonunu manipüle etmemize olanak tanır. Bu lentivirüs prosedürü biyogüvenlik seviyesi ikidir ve laminar akışlı bir kabinde gerçekleştirilmesi gerekir.

Steril bir ortamı korumak için, kokpit içine yerleştirilen her şeye kokpit içinde %70 etanol püskürtün, enjeksiyondan önce en az 20 dakika boyunca 37 °C'lik bir su banyosu hazırlayın ve ön ısıtma yapın. Yarısı suyla dolu plastik bir saklama poşetini kapatın ve boş bir ısıtıcı blok inkübatör üzerine yerleştirin.

Bu, farelerin enjeksiyondan sonra toparlanmasını sağlayacaktır. Virüse maruz kalmış tüm malzemeleri dekontamine etmek için bir biyotehlike atık konteynerini %10 çamaşır suyu ile doldurun. Bu prosedür için, %70 etanol içeren küçük, açık bir kap ve steril distile su içeren ikinci bir kap hazırlayın.

Laminar akışlı kabinde, 33 gauge iğneye sahip beş mikrolitre kapasiteli bir Hamilton şırınga kullanacağız. Bu özel model, piston haznesinin üst kısmında bulunan bir gerginlik kadranını çevirerek piston direncini ayarlamanıza olanak tanır. Bu özellik, iğneyi ve şırınga haznesini sterilize etmek için mikroenjeksiyon hacim kontrolü sağlar.

Etanolü kaptan birkaç kez tekrarlayan şekilde aspire edin ve geri boşaltın. Steril suyu birkaç kez aspire edip boşaltarak şırınga kartuşunu durulayın. Şırıngayı akışlı kabin içerisinde güvenli bir yere kenara koyun.

Alkol mendillerini enjeksiyon istasyonunun yakınına yerleştirin. Fareyi konumlandırmayı kolaylaştıracak yükseltilmiş bir yüzey sağlayan bir enjeksiyon platformu hazırlayın. Bunun için Kim mendilleriyle kaplanmış, ters çevrilmiş 10 santimetrelik bir kültür kabı kullanılabilir.

Fare yavruları, sütten kesilme yaşına kadar hipotermi yoluyla anesteziye tabi tutulabilir. Bir lastik eldivenin parmak kısmını kesin ve fare yavrusunu bu kesilen parmak kısmının içine yerleştirin. Ardından beş dakika boyunca buz üzerinde bekletin.

Eldiven, buz testiyle tam anestezinin sağlanması için yavrunun arka ve ön ayaklarının sıkılması sırasında meydana gelebilecek doğrudan cilt temasından kaynaklı cilt yanıklarını önleyecektir. Artık lentivirüs mikroenjeksiyonuna hazırız. İşlemi yeni doğmuş bir yavru üzerinde göstereceğiz.

Daha yaşlı bir fare kullanılıyorsa, kafatası yüzeyini delebilmek için 33 gauge iğne yerine daha kalın gauge bir iğne kullanılmalıdır. Fareyle burnun yüzeyini bir alkollü pedle silerek sterilize edin. Lentivirüs stoklarını dondurucudan çıkarın ve buz üzerinde çözdürün.

Lentivirüsü, yerleşik yöntemleri kullanarak laboratuvarımızda kendimiz ürettik. Bu yöntemi geliştirirken, iyi bir transdüksiyon oranı için mililitre başına 10⁹ enfeksiyöz birimle sınırlı minimum bir viral titrenin gerekli olduğunu tespit ettik. Sterilize edilmiş Hamilton şırıngasına iki µL lentivirüs stok çözeltisi çekin.

Fare yavrusunu enjeksiyon tablasının üzerine yerleştirin. Başın üst kısmındaki deriyi kulakların olduğu yerden tutun ve nazikçe geri çekin. Laminar akışlı kabinimizi bir diseksiyon mikroskobu ile donattık.

Mikroenjeksiyonları doğru şekilde yönlendirmek için, ön beyindeki dorsal kafatası yüzeyinde koku bulbunun ana hattını arayın. Mikroenjeksiyon hedeflerimiz koku bulbunu yakından çevreler, ancak bulbun kendisini içermemelidir. Her yavruya, koku epiteline dört enjeksiyon yapıyoruz.

Mavi noktalarla gösterilen bu konumlar, iğnenin mediale doğru bir açıyla yerleştirilmesini gerektirir. Yeşil noktalarla gösterilen ek iki enjeksiyon, koku soğancuğunun (olfaktör bulb) daha medialinde ve anteriorunda, şaşırtmalı olarak yerleştirilmiştir. Bu enjeksiyonlar uygun açıyla yapılabilir.

İğne açısı önerileri, çoğunlukla olfaktor bulbusun altında yer alan olfaktor epitelyumun ventral konumlanması dikkate alınarak yapılmıştır. Bu nedenle dik erişim kısıtlıdır. İğneyi, deri yüzeyinin yaklaşık üç milimetre altından nazal kavitenin üst kısmından yerleştirin.

Olfactory epitelyuma ulaşmak için. Eğitimli bir el, nazal kavite lümen boşluğuna ulaşıldığında dirençteki düşüşü hissetmelidir. Bu bölgeden kaçınılmalıdır.

Her pozisyon için 0.5 µL virüs stok çözeltisini mikroenjeksiyonla uygulayın. Hem sol hem de sağ taraf için her iki tarafta ikişer bölge seçerek, toplamda 0.5 µL'lik dört enjeksiyon gerçekleştirin. Bu durum, tek bir enjeksiyon seansında fare başına 2 µL virüs gerektiği anlamına gelir.

Tekrar, olfactory bulb blot enjeksiyonu yaparken enjeksiyon bölgesinden veya burun deliklerinden sızabilecek kalıntılı virüs solüsyonunu veya kanı kurutmamaya dikkat edin. Bir etanol mendil kullanarak temizlik yapın, mendilleri seyreltilmiş sıvı çamaşır suyu kabına atın ve enjekte edilen fareyi iyileşmesi için derhal su yataklı inkübatöre yerleştirin. Hazırlık sırasında gerçekleştirilen sterilizasyon prosedürünü tekrarlayarak iğne şırıngasını dekontamine edin. Enjekte edilen fareler, su yataklı inkübatördeki iyileşme sürecinden 30 dakika sonra kafeslerine geri döndürülebilir.

Bu mikroenjeksiyon işleminin tamamı dört saat sonra tekrarlanabilir. Enfekte edilecek olfaktor duyusal nöronların sayısını artırmak isterseniz, enfekte olfaktor duyusal nöronlar üç gün kadar kısa bir sürede hücrenin tüm uzunluğu boyunca görselleştirilebilir. Hayvanlar, istenen zaman noktasında gözlem için sakrifiye edilir ve perfüze edilir.

Transdükte edilmiş tek hücreli olfaktör duyusal nöron yollarını ve akson terminallerini görselleştirmek amacıyla, standart yöntemleri kullanarak olfaktör bulbu koronal düzlemde 60 mikron kalınlığında kesitlendiririz. Böylece kesit, yüzer immünohistokimya hazırlığı için olfaktör bulbun olfaktör duyusal nöron akson demetleri ve bulbus yüzeyindeki glomerüler yapılarda sinaps yapan akson terminalleri dahil tüm hücre katmanlarını içerecektir. Olfaktör bulbun seri kesitleri alınır ve beş mililitre fosfat tamponlu salin içeren 10 santimetrelik bir kültür kabına topluca aktarılır.

Yüzen kesitleri 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Kesitler tüpün dibine çöktüğünde, fosfat tamponlu salini vakumla çekerek uzaklaştırın. Kesitleri vakumla çekmemeye dikkat edin.

Kalan fiksatif veya gömme materyalini uzaklaştırmak için kesitlerinize 10 milliliters taze tampon ekleyerek yenileyin. Bu süspansiyonu, yüzen tüm kesitleri aldığınızdan emin olarak hemen 15 milliliter'lik konik bir tüpe pipetleyin, durulama solüsyonunu vakumla çekin ve kesitleri fosfat tamponlu tuzlu su içindeki %0,3 Triton X 100 solüsyonu ile perfore ederek 10 dakika boyunca bir sallar platforma yerleştirin. Oda sıcaklığında, aynı konik tüp içerisinde standart bir immün boyama protokolüne devam edebilirsiniz; bu boyutlardaki bir kap için gerektiği kadar vakum ve sallama adımlarını tekrarlayın ve boyama ile durulama adımları için 10 milliliters hacmi muhafaza edin.

Pozitif olarak transdükse edilmiş olfaktör duyusal nöronların ve genel olfaktör duyusal nöron popülasyonunun beraber boyanması (cos stain) için kullandığımız antikorların listesi aşağıdadır. 60 mikronluk bulb kesitlerine antikorların tam nüfuz etmesi için dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca inkübe edilmesi önerilir. Her bir yıkama süresi de 20 dakikadan kısa olmamalıdır.

Her bir kesiti bir fırça yardımıyla lam üzerine nazikçe yayın; her lamı kromatin boyama çözeltisi ile desteklenmiş flora Mount G ile kapatın. Kapatma ortamındaki tüm hava kabarcıklarını gidermeye özen gösterin. Sonraki tarama adımını kolaylaştırmak için kesitlerinizi sıralı halde yerleştirin.

İmmün boyama uygulanmış bulb kesitlerindeki bu katmanları, GFP pozitif akson lifleri ve terminalleri için tarayın. Floresan mikroskop kullanarak, pozitif enfekte olmuş sinir terminalleri konfokal mikroskopi ile görüntülebilir. DPI ve olfaktör marker protein kanallarını kullanarak ilgi alanınızdaki odak düzlemini kalibre etmek faydalı olacaktır.

Bu sonuçlar, glomerül içinde tek bir koku sensor nöron akson lifi ve akson terminalini göstermektedir; burada kırmızı renkli koku marker proteini ile gri renkli vlu iki ile enfekte edilmiş koku sensor nöron hücre gövdeleri ve dendritik nodülleri, eğer bu doku diseksiyon ve immünboyama adımlarına dahil edildiyse, koku epitelinde de görselleştirilebilir. Konfokal projeksiyon, tek bir koku duyusal nöronunun aksonal uzantı yolu ve terminal arborunun oldukça ayrıntılı bir morfolojisini sunmaktadır. Akson lifinin glomerüler hedefine doğru geriye doğru kıvrulması ve glomerüler nöropil içindeki dallanma paterninin detayları görülebilmektedir.

Lentiviral mikroenjeksiyon yöntemi, tek hücreli aksonların ve koku duyusu nöronlarının morfolojilerinin görselleştirilmesine olanak tanır ve gen ekspresyonunu manipüle eden çalışmalara imkan sağlar; lentivirüs transdüksiyonu, konstrüktların stabil genomik entegrasyonu ile sonuçlanır. Lentivirüs, sinaptik olarak komşu hücreleri enfekte etmez. Görselleştirme üç gün kadar kısa bir sürede gerçekleştirilebilir ve bunun en az üç ay sürdüğü, muhtemelen daha uzun süreler boyunca devam ettiği onaylanmıştır.

Koku duyusuna sahip nöronlar, lentivirüs solüsyonunun burun yoluyla infüzyonuna karşı kolayca enfekte olmazlar. Bu nedenle, bu prosedürde yüzeyden mikroenjeksiyon yapılması gerekmektedir. İşte lentivirüs mikroenjeksiyon prosedürümüz.

Tüm bu bilgilerin, kendi tek hücre morfolojilerinizi elde etme yolunda faydalı olduğunu umuyorum. İyi çalışmalar.