Name: Koku Duyu Nöronlar lentivirüs aracılı Genetik Manipülasyon ve Görselleştirme In vivo /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Öğrenin, lentivirüs mikroenjeksiyonu ile koku duyu nöronlarının tek hücre düzeyinde genetik manipülasyon ve görselleştirme yöntemini. Bu teknik, aksiyon trajektori ve terminal morfolojilerini in vivo çalışmalar için sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH DC052256 ve DC006015 ve NSF 0.324.769 QG ve T32-DC008072 BS tarafından desteklenmektedir.

1. Hazırlık Bu prosedür, biyogüvenlik düzeyi 2, bu nedenle aşağıdaki tüm hazırlıkları, mikroenjeksiyon işlemi gerçekleştirilen bir biyolojik tehlike kaput yapılır . <ol><li> Hazırlayın ve ön ısıtma 37 ° C su yatağı: su dolu bir plastik saklama poşetine doldurun - boşaltılmış bir ısıtma blok inkübatör mühür ve set. Bu fareler aşağıdaki enjeksiyon kurtarmak için izin verecektir. </li><li> Bir biyolojik tehlikeli atık konteyneri bu yordamı tüm atık batırmak için uygun bir hacmi% 10 oranında çamaşır suyu ile doldurun. </li><li> % 70 etanol küçük bir açık biyolojik güvenlik kabini, steril ddH2O ve yer ile çanak ve ikinci bir yemek hazırlayın. </li><li> 5μL kapasiteli Hamilton şırınga, piston, tüm yol çıkardı% 70 etanol ile beden ve iğne aşağı püskürtme 33-gauge bir iğne ile sterilize edin. Tekrar tekrar çanak etanol aspirat ve en az 5 kez bu şekilde dışarı çıkarmak. </li><li> Şırınga kartuşu aspirasyon ve çıkarma en az 5 kez steril su ile durulayın. Kültür kaput, güvenli bir şekilde kenara şırınga yerleştirin ve kurutun. </li><li> ° C derin dondurucuda buz üzerinde depolama yeri ve çözülme izin -80 viral stokları çıkarın. Mikroenjeksiyon 10 9 enfeksiyöz birim / ml bir titresi fare başına düşen virüs stokunun 2μL gerektirir. Lentiviruses laboratuvar kurulan protokolü (Lois ve ark, 2002) göre, ticari kaynaklardan elde edilen veya üretilen olabilir. </li><li> Kaputun yüzey üzerinde büyüyen bir alan sağlayan bir enjeksiyon aşamasında hazırlayın - Kimwipe bir levha ile kaplı bir 10cm kültürü çanak kullanabilirsiniz. </li><li> Enjeksiyon istasyonu yakınında alkol mendil düzenleyin. </li></ol> 2. Olfaktör epitel içine lentiviral parçacıkların Mikroenjeksiyon Bu yöntemle yapılan tüm hayvan prosedürleri IACUC onaylanmış yönergelere göre yapılır. Mus musculus suşu C57BL/6J tüm deneylerde kullanılan hayvan modelinde gösterilmiştir. <ol><li> Kafesin yavru bir fare (P0-P3) ve 5 dakika buz üzerinde bir kesim açık eldiven yavru koyarak hipotermi fare yavrular Anesteziyoloji. </li><li> Yavru sterilize Hamilton şırıngaya viral stokunun tamamen anestezi, aspirat 2μL için beklerken. </li><li> Enjeksiyon sahne üstünde yavru fare yerleştirin. Boynun üst kısmına doğru kulak yavaşça başın üst deri çekin. Bu nazal kavite içinde öğretilen bir cilt yüzeyini sağlamak ve enjeksiyon kolaylığı olacak. </li><li> Olfaktör epitel ulaşmak için cilt yüzeyinin altında 3mm hakkında burun boşluğunun üst yoluyla iğne takın. Sağ ve sol iki tarafında başına iki site (fare başına düşen toplam dört enjeksiyonları gerekli virüs = 2μL) seçerek atış başına virüs çözümü 0.5μL Microinject. Enjeksiyon siteleri birbirlerinden şaşırtmalı olmalıdır. Uygun enjeksiyon siteleri hedef için, koku ampul anahat dorsal kafatası yüzeyi arama. Bu çizgi, yarı şeffaf bir cilt ve kafatası yoluyla doğumda zar zor görünür. Her iki tarafta da iki enjeksiyon yapmak için, sadece az bir ampul anahat medial eksen rostral bir enjeksiyon hedefliyoruz. Ampul anahat lateral ikinci bir ekleme yapın, henüz ventral ampul altında bulunduğu olfaktör epitel ulaşabilirsiniz enjeksiyon mediale açısını emin olun. Koku ampul nüfuz kaçının! </li><li> Leke herhangi bir kalıntı virüs çözümü ya da kuru bir Kimwipe kullanarak enjeksiyon yerinde veya burun deliğine açıklıklar kaçmak kan. Hemen seyreltilmiş sıvı çamaşır suyu biohazard konteyner Kimwipes atmayın. </li><li> Enjekte edilen fare, su yatağı inkübatör üzerine yerleştirin. </li><li> Tekrar fare başına düşen virüs stokunun yaklaşık 2μL gerekecektir hatırlayarak enjekte edilecek tüm fareler için 1-4 adımları. </li><li> Orijinal yuvalama kafes onları dönmeden önce fareler 30 dakika boyunca su yatağı inkübatör kurtarmanızı sağlar. </li><li> Sıvı çamaşır suyu biyolojik tehlike bertaraf mikroenjeksiyon sahne, sterilize mendil ve herhangi bir ekstra temizlik kağıt ürünleri atın. </li><li> Hamilton şırınga hazırlık adımları yapılan tekrarlanan aspirasyon ve etanol ejeksiyon ve sonra su ile temizleyin. Şırınga kurumasını bekleyin. </li><li> Maksimum transduction verimlilik için 4 saat içinde tekrar bu prosedürü tekrarlayın. Enfekte OSNs hücre uzunluğu boyunca üç gün gibi az olarak görüntülendi olabilir. </li></ol> 3. Kayan koku alma ampul bölümleri, İmmünohistokimya <ol><li> Istenilen zaman noktada enjekte fare Kurban ve perfüzyon% 4 paraformaldehid doku çözmek. OB parçalara ayır. Bir gecede gecelik ve sonra paraformaldehid PBS içinde% 30 sakaroz inkübe edin. Kuru buz OCT gömme orta göm. </li><li> Koronal OB bölümleri bir Kriyostat kullanarak kalınlığı 60μm elde edilir. 5ml 1x PBS (pH 7.4) ile 10cm kültürü çanak içine ampul bölümleri Sweep. Bölüm d Ekim izin PBS içinde yüzen tutulmalıdırissolve. 50ml konik bir şişenin içine yüzer bölümleri ve PBS aktarın. </li><li> Flakonun alt bölümlere yerleşmek için izin ver. PBS kapalı herhangi bir bölümü emme Vakum. 20ml PBS ile doku bölümleri durulayın. Yerleşmek ve vakumlama adımları tekrarlayın. 10 ml PBS ve immün için 15 mL konik flakon transfer kayan bölümleri ile yeniden süspanse edin doku. Bir kez doku kesitlerinde doku bozmadan, PBS süpernatant kapalı vakum yerleşmiştir. Ile yeniden süspanse bölümleri% 0.3 1x PBS, pH 7.4 deterjan hücre zarları delinecek izin (PBS-Tx) Triton X-100. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. PBS-Tx süpernatant ve tekrar inkübasyon iki kez kapalı Vakum. </li><li> Engelleme çözümünün 10 ml (PBS-Tx% 5 at serumu) doku bölümlerini iki saat oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Her biri 15 dakika oda sıcaklığında en az iki kez PBS-Tx engelleme çözüm durulayın. </li><li> PBS-Tx birincil antikor çözüm 2mL hazırlayın. Reaktifler ve bu deneyde kullanılan antikorlar için donatım bölümüne bakın. </li><li> Primer antikor çözümü ile ikinci PBS-Tx engelleme yıkama değiştirin. 4 ° C 24-48 saat 60μm kayan bölümleri içine derinlemesine nüfuz sağlamak için yavaş yavaş sallanan bir platform (~ 30rpm) inkübe edin. </li><li> Inkübasyondan sonra, birincil antikor çözümü 4 dikkatli bir pipet kullanarak alınan ve saklanan olabilir ° C boyanma yoğunluğu önemli bir kaybı olmadan iki hafta içinde iki kez daha yeniden. </li><li> Nazik rotasyon (~ 30rpm) ile oda sıcaklığında her 20 dakika için bölümler PBS-Tx üç kez yıkayın. </li><li> PBS-Tx ikincil antikor seyreltme 2mL hazırlayın. Son yıkama Vakum ve doku kesitlerinde sekonder antikor çözüm ekleyin. Dış fluorofor photobleaching neden olabilir ışık, blok boyama flakon alüminyum folyo ile sarın. 4 ° C gece boyunca yavaş yavaş sallanan bir platform ve inkübe yerleştirin flakon tamamladı. </li><li> Uzakta vakumlama ikincil antikor çözüm atın. Bölümleri, her oda sıcaklığında 20 dakika PBS-Tx ile bir kez yıkayın. Oda sıcaklığında, her 20 dakika için PBS (pH 7.4) ile iki kez durulayın. Fluoromount G. kullanılarak cam Slaytlarınıza Mount boyanan doku kesitleri </li><li> Olumlu bir floresan mikroskop ile enfekte OSN ve akson Termini boyanan kesitler aracılığıyla Ekran. </li><li> Etiketli OSN akson ve terminal çardak üç boyutlu bir görüntü oluşturmak için, konfokal mikroskopi kullanılarak hedef OB doku dilim (z ekseni boyunca) 60μm derinliği ile optik bölümleri bir dizi yapmak. </li><li> Z-bölüm görüntüler Bu yığın bütünüyle terminal çardak detay da dahil olmak üzere tek bir etiketli OSN akson 360 ° dönen perspektif, daha sonra yeniden bir araya yansıtılabilir. Herhangi bir tek dönme açısı yakalanır ve 2D formatında sunumu için bir resim dosyası olarak (yani, JPG, TIFF) ihraç edilebilir. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Burada açıklanan yöntemler, in vivo lentivirüs koku alma duyu nöronları transduce. GFP ve mCherry floresan gazetecilere böylece çok görüntülenmiştir enfekte OSNs, iyi immünsitokimya üzeri myc etiketli füzyon proteini var. Bu teknik, virüslü OSNs bir bolluk sağlar. Yine de, transdüksiyon, böylece tek bir hücre morfolojisi analizi için izin sporadik tek tek etiketli OSNs sağlamak için yeterli oluşur. Ve akson terminallerindeki konfokal mikroskobu (Şekil 1) kendi doğal ortamı ortasında OB doku kesitlerinde içinde görüntülenmiş. Tüm OSN akson terminali çardak genellikle 40-50μm optik bölüm içinde büyüledi olabilir. Enfekte OSN akson terminalleri Yüksek büyütme glomerüler katman aksonal çardak morfolojisinin detaylı analiz sağlar. <img src="/files/ftp_upload/2951/2951fig1.jpg" /> Şekil 1. Tek koku alma duyu nöron, akson ve terminal çardak Yörünge A) P7 fare koku sinir tabakası (onl) gösteren bir koku ampul koronal bölümünde OMP (kırmızı) ile immunohistokimyasal ve OMP hem glomerüler katman (GL) ile boyanmış Vglut2 (gri). GFP (yeşil) ifade tek bir koku duyusal nöron akson onl içinde yolculuk yapar ve glomerüler yapı içine nüfuz eder. B) glomerul içinde akson terminali çardak morfolojisi GFP ifade tarafından açıkça vurgulanır. Vglut2 gri co-boyama, GFP pozitif bir aksonun terminal abor ayrıntılarına içinde toplam glomular alanı aydınlatır. C) lentiviral enfekte OSNs OE ifade GFP (yeşil). Olfaktör epitel cytostructure DAPI boyama (mavi) ile gösterilir. GFP ifade OE OSN hücre gövdeleri ve bunların hücresel süreçlerin görselleştirme sağlar. D) Rap1GAP2 ifadesi ile bir OSN akson ve terminal morfolojisi knock-down shRNA. Altında fare U6 organizatörü ve GFP altında Rap1GAP2 shRNA ile ikili bir ifadenin kaseti taşıyan LentivirusesCMV organizatörü OE uygulandı. Enfekte koku alma akson terminalleri GFP sadece kontrol ile kıyaslandığında daha basitleştirilmiş bir terminal çardak sergilenmektedir. Bar = 20μm.

<ol><li>Chen, H., Kohno, K., Gong, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+ablation+of+mature+olfactory+sensory+neurons+mediated+by+diphtheria+toxin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Conditional ablation of mature olfactory sensory neurons mediated by diphtheria toxin receptor.</a> J Neurocytol. 34, 1-2 (2005).</li>
<li>Doi, K., Nibu, K., Ishida, H., Okado, H., Terashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+epithelium+and+olfactory+bulb%3A+a+long-term+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Otol+Rhinol+Laryngol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory epithelium and olfactory bulb: a long-term study.</a> Ann Otol Rhinol Laryngol. 114, 629-633 (2005).</li>
<li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295, 868-872 (2002).</li>
<li>Zhao, H., Otaki, J. M., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory neurons in vivo.</a> J Neurobiol. 30, 521-530 (1996).</li>
</ol>

Bu protokol, biyo-güvenlik düzeyi 2 uyumlu. Tüm uygun çalışma alanı, kişisel koruma, ve viral atık kısıtlama tedbirlerini buna göre kurulmuştur. Bütün hayvan prosedürleri IACUC kurallarına göre yapılmıştır.

OSN genomik DNA gen yapıları kalıcı transferi lentivirüs sonuçları Mikroenjeksiyon. Bu yaklaşım bize aşırı ekspresyonu veya shRNA aracılı knock-down &quot;ile aday genler kısa vadeli veya uzun vadeli manipülasyonlar ile yarabilirsiniz. Buna ek olarak, floresan odorant reseptör popülasyonları co-lokalizasyon gözlemlemek için mevcut bir transgenik fare doğrultusunda tek OSNs etiketleyebilirsiniz. Mikroenjeksiyon OSNs lentiviral transdüksiyon için gereklidir. Biz herhangi bir başarı olmadan OSNs uyum sağlamak burun boşluğu...

Mikroenjeksiyon: Yenidoğan farelere 33 iğne (Hamilton # 7762-06) ile donatılmış bir 5μL Hamilton şırınga (Hamilton # 7647-01) kullanılarak microinjected. İmmünositokimya Reaktifler: Primer antikorlar: tavşan poliklonal antikor GFP (Molecular Probes # A-6455), OMP karşı tavuk poliklonal antikor (özel) (Chen ve ark, 2005), kobay VGlut2 karşı poliklonal antikor (Millipore # AB2251). İkincil antikorları: Cy2-konjuge eşek anti-tavşan (Jackson Immunolab # 711-225-152), eşek Cy3-konjuge anti-tavuk (Jackson Immunolab # 703-165-155) ve Cy5-konjuge keçi anti-guinea pig (Jackson Immunolab # 106-175-008). Bölüm 50ng/mL DAPI kromatin leke çözümü ile Fluoromount G (Güney Biotech # 0010-01) ile cam kızaklar üzerinde monte edilmiştir. Konfokal Görüntüleme: Z-yığını görüntüler Olympus Flouview FV1000 konfokal mikroskop ve Olympus FV10-ASW 2.01 konfokal toplama ve analiz yazılımı kullanarak 3D projeksiyonları toplanır ve işlenmiş görüntüler kullanılarak alınmıştır.

koku duyu nöronlar lentivirüs aracılı genetik manipülasyon ve görselleştirme in vivo</em

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Hassas bir koku alma devre Geliştirme koku ampul (OB) sinaptik hedeflere koku alma duyu nöron (OSN) aksonlar doğru projeksiyon dayanmaktadır. OSN akson büyüme ve hedefleme moleküler mekanizmaları iyi anlaşılmış değildir. Kurgulama gen ekspresyonu ve şimdiye kadar tek OSN akson ve onların terminali çardak morfolojisi görselleştirme sonraki zorlu olmuştur. Belirli bir zaman dilimi içinde tek hücre düzeyinde gen fonksiyonu çalışma için, gen ekspresyonu in vivo OSNs işlemek için lentiviral tabanlı bir teknik geliştirdi. Lentiviral parçacıklar koku epiteli (OE) mikroenjeksiyon OSNs için teslim edilir. İfade kasetleri daha sonra kalıcı transduced OSNs genom içine entegre edilmiştir. Yeşil floresan proteini ifade enfekte OSNs tanımlayan ve akson terminali çardak de dahil olmak üzere tüm morfoloji, özetliyor. Mikroenjeksiyon ve muhabir algılama arasındaki kısa gerçekleştirme süresi nedeniyle, gen fonksiyonu çalışmaları çok dar bir süre içinde geliştirme odaklı olabilir. Bu yöntem ile, en az üç gün içinde, GFP ifade tespit ettik ve enjeksiyonu takiben üç ay kadar uzun. Biz knock-down lentiviral mikroenjeksiyon aracılı aşırı ifade ve shRNA hem de elde ettik. Bu yöntem, in vivo olarak tek hücre düzeyinde OSN hücre gövdeleri ve aksonlar detaylı morfolojileri sağlar ve böylece koku alma gelişimi sırasında aday gen fonksiyonu karakterizasyonu sağlar.

Biz lentiviral bir tek koku alma duyu nöron akson genetik manipülasyon ve görselleştirme tekniği ve terminal arborization mevcut<em&gt; In vivo</em&gt;.

Koku Duyu Nöronlar lentivirüs aracılı Genetik Manipülasyon ve Görselleştirme In vivo</em

Hassas bir koku devresinin gelişimi, koku duyusu nöronu (KDN) aksonlarının ... içindeki sinaptik hedeflerine doğru şekilde projeksiyon yapmasına dayanır.

Nörobilimde gelişimi incelemenin zorluklarından biri, dendritik ve aksonal morfolojileri in vivo ortamda tek hücre düzeyinde yakalamaktır. Olfaktör sistemde, olfaktör duyusal nöronlar aksonlarını burundaki olfaktör epitelden beyindeki olfaktör bulba doğru uzatırlar. Birden fazla olfaktör duyusal nöron olfaktör bulba doğru projeksiyon gönderdikçe, demetler halinde birleşirler.Bu durum, bireysel akson yörüngelerinin ve bunların terminal morfolojilerinin incelenmesini zorlaştırmaktadır. GFP konstrüktü taşıyan lentivirüslerin mikroenjeksiyon yoluyla uygulanmasıyla, tekil olfaktör duyusal nöronları in vivo olarak görsellemek için bir yöntem geliştirdik.Lentivirüs ile başarılı transdüksiyon, terminal arbor dahil olmak üzere tüm olfaktör duyusal akson uzunluğunu aydınlatır. Tekil olfaktör duyusal nöronları görselleştirmenin yanı sıra bu yöntem, belirli bir ilgi odağındaki genin fonksiyonunu in vivo bağlamda incelemek için gen ekspresyonunu manipüle etmemize olanak tanır. Bu lentivirüs prosedürü biyogüvenlik seviyesi ikidir ve laminar akışlı bir kabinde gerçekleştirilmesi gerekir.Steril bir ortamı korumak için, kokpit içine yerleştirilen her şeye kokpit içinde %70 etanol püskürtün, enjeksiyondan önce en az 20 dakika boyunca 37 °C'lik bir su banyosu hazırlayın ve ön ısıtma yapın. Yarısı suyla dolu plastik bir saklama poşetini kapatın ve boş bir ısıtıcı blok inkübatör üzerine yerleştirin.Bu, farelerin enjeksiyondan sonra toparlanmasını sağlayacaktır. Virüse maruz kalmış tüm malzemeleri dekontamine etmek için bir biyotehlike atık konteynerini %10 çamaşır suyu ile doldurun. Bu prosedür için, %70 etanol içeren küçük, açık bir kap ve steril distile su içeren ikinci bir kap hazırlayın.Laminar akışlı kabinde, 33 gauge iğneye sahip beş mikrolitre kapasiteli bir Hamilton şırınga kullanacağız. Bu özel model, piston haznesinin üst kısmında bulunan bir gerginlik kadranını çevirerek piston direncini ayarlamanıza olanak tanır. Bu özellik, iğneyi ve şırınga haznesini sterilize etmek için mikroenjeksiyon hacim kontrolü sağlar.Etanolü kaptan birkaç kez tekrarlayan şekilde aspire edin ve geri boşaltın. Steril suyu birkaç kez aspire edip boşaltarak şırınga kartuşunu durulayın. Şırıngayı akışlı kabin içerisinde güvenli bir yere kenara koyun.Alkol mendillerini enjeksiyon istasyonunun yakınına yerleştirin. Fareyi konumlandırmayı kolaylaştıracak yükseltilmiş bir yüzey sağlayan bir enjeksiyon platformu hazırlayın. Bunun için Kim mendilleriyle kaplanmış, ters çevrilmiş 10 santimetrelik bir kültür kabı kullanılabilir.Fare yavruları, sütten kesilme yaşına kadar hipotermi yoluyla anesteziye tabi tutulabilir. Bir lastik eldivenin parmak kısmını kesin ve fare yavrusunu bu kesilen parmak kısmının içine yerleştirin. Ardından beş dakika boyunca buz üzerinde bekletin.Eldiven, buz testiyle tam anestezinin sağlanması için yavrunun arka ve ön ayaklarının sıkılması sırasında meydana gelebilecek doğrudan cilt temasından kaynaklı cilt yanıklarını önleyecektir. Artık lentivirüs mikroenjeksiyonuna hazırız. İşlemi yeni doğmuş bir yavru üzerinde göstereceğiz.Daha yaşlı bir fare kullanılıyorsa, kafatası yüzeyini delebilmek için 33 gauge iğne yerine daha kalın gauge bir iğne kullanılmalıdır. Fareyle burnun yüzeyini bir alkollü pedle silerek sterilize edin. Lentivirüs stoklarını dondurucudan çıkarın ve buz üzerinde çözdürün.Lentivirüsü, yerleşik yöntemleri kullanarak laboratuvarımızda kendimiz ürettik. Bu yöntemi geliştirirken, iyi bir transdüksiyon oranı için mililitre başına 10⁹ enfeksiyöz birimle sınırlı minimum bir viral titrenin gerekli olduğunu tespit ettik. Sterilize edilmiş Hamilton şırıngasına iki µL lentivirüs stok çözeltisi çekin.Fare yavrusunu enjeksiyon tablasının üzerine yerleştirin. Başın üst kısmındaki deriyi kulakların olduğu yerden tutun ve nazikçe geri çekin. Laminar akışlı kabinimizi bir diseksiyon mikroskobu ile donattık.Mikroenjeksiyonları doğru şekilde yönlendirmek için, ön beyindeki dorsal kafatası yüzeyinde koku bulbunun ana hattını arayın. Mikroenjeksiyon hedeflerimiz koku bulbunu yakından çevreler, ancak bulbun kendisini içermemelidir. Her yavruya, koku epiteline dört enjeksiyon yapıyoruz.Mavi noktalarla gösterilen bu konumlar, iğnenin mediale doğru bir açıyla yerleştirilmesini gerektirir. Yeşil noktalarla gösterilen ek iki enjeksiyon, koku soğancuğunun (olfaktör bulb) daha medialinde ve anteriorunda, şaşırtmalı olarak yerleştirilmiştir. Bu enjeksiyonlar uygun açıyla yapılabilir.İğne açısı önerileri, çoğunlukla olfaktor bulbusun altında yer alan olfaktor epitelyumun ventral konumlanması dikkate alınarak yapılmıştır. Bu nedenle dik erişim kısıtlıdır. İğneyi, deri yüzeyinin yaklaşık üç milimetre altından nazal kavitenin üst kısmından yerleştirin.Olfactory epitelyuma ulaşmak için. Eğitimli bir el, nazal kavite lümen boşluğuna ulaşıldığında dirençteki düşüşü hissetmelidir. Bu bölgeden kaçınılmalıdır.Her pozisyon için 0.5 µL virüs stok çözeltisini mikroenjeksiyonla uygulayın. Hem sol hem de sağ taraf için her iki tarafta ikişer bölge seçerek, toplamda 0.5 µL'lik dört enjeksiyon gerçekleştirin. Bu durum, tek bir enjeksiyon seansında fare başına 2 µL virüs gerektiği anlamına gelir.Tekrar, olfactory bulb blot enjeksiyonu yaparken enjeksiyon bölgesinden veya burun deliklerinden sızabilecek kalıntılı virüs solüsyonunu veya kanı kurutmamaya dikkat edin. Bir etanol mendil kullanarak temizlik yapın, mendilleri seyreltilmiş sıvı çamaşır suyu kabına atın ve enjekte edilen fareyi iyileşmesi için derhal su yataklı inkübatöre yerleştirin. Hazırlık sırasında gerçekleştirilen sterilizasyon prosedürünü tekrarlayarak iğne şırıngasını dekontamine edin. Enjekte edilen fareler, su yataklı inkübatördeki iyileşme sürecinden 30 dakika sonra kafeslerine geri döndürülebilir.Bu mikroenjeksiyon işleminin tamamı dört saat sonra tekrarlanabilir. Enfekte edilecek olfaktor duyusal nöronların sayısını artırmak isterseniz, enfekte olfaktor duyusal nöronlar üç gün kadar kısa bir sürede hücrenin tüm uzunluğu boyunca görselleştirilebilir. Hayvanlar, istenen zaman noktasında gözlem için sakrifiye edilir ve perfüze edilir.Transdükte edilmiş tek hücreli olfaktör duyusal nöron yollarını ve akson terminallerini görselleştirmek amacıyla, standart yöntemleri kullanarak olfaktör bulbu koronal düzlemde 60 mikron kalınlığında kesitlendiririz. Böylece kesit, yüzer immünohistokimya hazırlığı için olfaktör bulbun olfaktör duyusal nöron akson demetleri ve bulbus yüzeyindeki glomerüler yapılarda sinaps yapan akson terminalleri dahil tüm hücre katmanlarını içerecektir. Olfaktör bulbun seri kesitleri alınır ve beş mililitre fosfat tamponlu salin içeren 10 santimetrelik bir kültür kabına topluca aktarılır.Yüzen kesitleri 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Kesitler tüpün dibine çöktüğünde, fosfat tamponlu salini vakumla çekerek uzaklaştırın. Kesitleri vakumla çekmemeye dikkat edin.Kalan fiksatif veya gömme materyalini uzaklaştırmak için kesitlerinize 10 milliliters taze tampon ekleyerek yenileyin. Bu süspansiyonu, yüzen tüm kesitleri aldığınızdan emin olarak hemen 15 milliliter'lik konik bir tüpe pipetleyin, durulama solüsyonunu vakumla çekin ve kesitleri fosfat tamponlu tuzlu su içindeki %0,3 Triton X 100 solüsyonu ile perfore ederek 10 dakika boyunca bir sallar platforma yerleştirin. Oda sıcaklığında, aynı konik tüp içerisinde standart bir immün boyama protokolüne devam edebilirsiniz; bu boyutlardaki bir kap için gerektiği kadar vakum ve sallama adımlarını tekrarlayın ve boyama ile durulama adımları için 10 milliliters hacmi muhafaza edin.Pozitif olarak transdükse edilmiş olfaktör duyusal nöronların ve genel olfaktör duyusal nöron popülasyonunun beraber boyanması (cos stain) için kullandığımız antikorların listesi aşağıdadır. 60 mikronluk bulb kesitlerine antikorların tam nüfuz etmesi için dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca inkübe edilmesi önerilir. Her bir yıkama süresi de 20 dakikadan kısa olmamalıdır.Her bir kesiti bir fırça yardımıyla lam üzerine nazikçe yayın; her lamı kromatin boyama çözeltisi ile desteklenmiş flora Mount G ile kapatın. Kapatma ortamındaki tüm hava kabarcıklarını gidermeye özen gösterin. Sonraki tarama adımını kolaylaştırmak için kesitlerinizi sıralı halde yerleştirin.İmmün boyama uygulanmış bulb kesitlerindeki bu katmanları, GFP pozitif akson lifleri ve terminalleri için tarayın. Floresan mikroskop kullanarak, pozitif enfekte olmuş sinir terminalleri konfokal mikroskopi ile görüntülebilir. DPI ve olfaktör marker protein kanallarını kullanarak ilgi alanınızdaki odak düzlemini kalibre etmek faydalı olacaktır.Bu sonuçlar, glomerül içinde tek bir koku sensor nöron akson lifi ve akson terminalini göstermektedir; burada kırmızı renkli koku marker proteini ile gri renkli vlu iki ile enfekte edilmiş koku sensor nöron hücre gövdeleri ve dendritik nodülleri, eğer bu doku diseksiyon ve immünboyama adımlarına dahil edildiyse, koku epitelinde de görselleştirilebilir. Konfokal projeksiyon, tek bir koku duyusal nöronunun aksonal uzantı yolu ve terminal arborunun oldukça ayrıntılı bir morfolojisini sunmaktadır. Akson lifinin glomerüler hedefine doğru geriye doğru kıvrulması ve glomerüler nöropil içindeki dallanma paterninin detayları görülebilmektedir.Lentiviral mikroenjeksiyon yöntemi, tek hücreli aksonların ve koku duyusu nöronlarının morfolojilerinin görselleştirilmesine olanak tanır ve gen ekspresyonunu manipüle eden çalışmalara imkan sağlar; lentivirüs transdüksiyonu, konstrüktların stabil genomik entegrasyonu ile sonuçlanır. Lentivirüs, sinaptik olarak komşu hücreleri enfekte etmez. Görselleştirme üç gün kadar kısa bir sürede gerçekleştirilebilir ve bunun en az üç ay sürdüğü, muhtemelen daha uzun süreler boyunca devam ettiği onaylanmıştır.Koku duyusuna sahip nöronlar, lentivirüs solüsyonunun burun yoluyla infüzyonuna karşı kolayca enfekte olmazlar. Bu nedenle, bu prosedürde yüzeyden mikroenjeksiyon yapılması gerekmektedir. İşte lentivirüs mikroenjeksiyon prosedürümüz.Tüm bu bilgilerin, kendi tek hücre morfolojilerinizi elde etme yolunda faydalı olduğunu umuyorum. İyi çalışmalar.

lentivirus-mediated-genetic-manipulation-visualization-olfactory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Genetik manipülasyon zamansal ve mekansal çözünürlükte karıştırmayı ki biyolojik olayların spektrum belirler. Burada zamansal ve mekansal...

Kombine Kullanımı Hedefleme Koku Ampul Nöronlar In Vivo Elektroporasyon ve Gal4 Tabanlı Enhancer Trap Zebra balığı Hatları

Koku ampul Yetişkin doğumlu nöronlar optogenetically Channelrhodopsin2-implant minyatür rostral göçmen akışı ve kronik photostimulation lentiviral enjeksiyon ifade LED kullanılarak kontrol edilebilir.

Kronik Yetişkin doğmuş Koku Nöronlar Seçici Viral İletimi In vivo Optogenetic Uyarım

Kaynak: Kozin, E. D., et.al. İşitsel yolun optogenetik stimülasyonu için murin dorsal koklear çekirdeğinin doğrudan görselleştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2015)Bu video, ışığa bağlı işitsel stimülasyonu mümkün kılmak için fare dorsal koklear çekirdeğine (DCN) virüs aracılı gen transferini göstermektedir. Işığa duyarlı bir iyon kanalı olan opsin kodlayan bir viral vektör, doğrudan erişim için bir kraniotomi ve serebellar aspirasyonu takiben DCN'ye enjekte edilir. İfade edilen opsinler, nöronların...

Işık kaynaklı işitsel stimülasyon için fare dorsal koklear çekirdeğine virüs aracılı gen transferi

Viral vektörler hedefli gen manipülasyonu için izin verir. Bu arka boynuzu içine, bir viral vektör stereotaksik enjeksiyon, birincil somatosensoriyel afferentleri ve merkezi sinir sistemi nöronları arasındaki sinaptik bir temas önemli yer kullanılarak, koşullu gen ekspresyonu ya da fare omurilik ablasyonu için bir yöntem göstermektedir.

Fare Omurilik Koşullu Gen Manipülasyon için bir Viral Vector Stereotaksik Enjeksiyon

Nöronal morfolojiyi ve zaman içindeki gelişimini görselleştirmek için koku alma duyu nöronlarının elektroporasyon ve ardından konfokal lazer tarama veya çoklu foton mikroskobu ile in vivo olarak etiketlenmesi için bir protokol açıklıyoruz.

Bir Model Olarak Koku Sistemi Akson Büyüme Modelleri ve Morfoloji Eğitim için In Vivo

Burada, erişkin ventriküler-subventriküler nörojenik nişteki nöral kök hücrelerin ve/veya bunların bitişik ependimal hücrelerinin uzun vadeli genetik modifikasyonu için lentiviral partiküllerin kullanımına dayanan ve nöral kök hücreler üzerindeki hücre otonom ve otonom olmayan, nişe bağlı etkilerin ayrı ayrı analizine izin veren bir prosedürü açıklıyoruz.

Nöral Analizi Yetişkin Fare V-SVZ&#39;una Hücre istikrarlı ve verimli Genetik Modifikasyon Kök Hücre Özerk ve Non-özerk Etkileri

Recombinase bağımlı rekombinant adeno ilişkili virüs (rAAV) kesici enjeksiyon herhangi bir genetik olarak etiketli hücre tipi spinal kord işlemek için kullanılabilir. Burada biz lomber spinal kord dorsal boynuz nöronlarda transduce anlatan. Bu teknik işlenmiş nöron alt türündeki fonksiyonel sorgulama sağlar.

Omurilik genetik olarak tanımlanmış nöronlar Adeno ilişkili virüs-aracılı Transgene ifade

Mevcut protokol, hipokampusa ventral tegmental alan (VTA) glutamat projeksiyonlarının izlenmesi için basit bir yöntem göstermektedir. VTA glutamat nöronlarının fototimülasyonu, VTA glutamat terminallerinin CA1 putatif piramidal ateşleme hızını in vivo olarak nasıl modüle ettiğini göstermek için CA1 kaydı ile birleştirildi.

Hipokampustaki Ventral Tegmental Alan Glutamat Terminallerinin Kombine In Vivo Anatomik ve Fonksiyonel İzlenmesi

Burada, akut kemirgen beyin dilimlerinde sinapsa özgü elektrofizyolojik karakterizasyona izin vermek için optogenetik yapılara sahip ayrık beyin bölgelerinin viral transdüksiyonunu tanımlayan bir protokol sunuyoruz.

Eski Vivo Medial Prefrontal Korteksten Lateral Entorinal Kortekse Uzun Menzilli Sinaptik İletim ve Plastisitenin Optogenetik Sorgulanması

Burada, Drosophila juvenil beynindeki anten lobu sinaptik glomerüllerinin koku alma deneyimine bağlı yeniden şekillenmesini indükleme ve analiz etme yöntemlerini açıklıyoruz.

Erken Yaşamın Kritik Bir Döneminde Juvenil Beyin Koku Alma Duyusal Nöron Sinaptik Bağlantısının Deneyime Bağlı Yeniden Modellenmesi

Öğrenin, lentivirüs mikroenjeksiyonu ile koku duyu nöronlarının tek hücre düzeyinde genetik manipülasyon ve görselleştirme yöntemini. Bu teknik, aksiyon trajektori ve terminal morfolojilerini in vivo çalışmalar için sağlar.

Koku Duyu Nöronlar lentivirüs aracılı Genetik Manipülasyon ve Görselleştirme In vivo

Daha fazla video keşfet