Koku Duyu Nöronlar lentivirüs aracılı Genetik Manipülasyon ve Görselleştirme In vivo

Sinirbilimde gelişimi incelemenin zorluklarından biri, in vivo olarak tek bir hücre düzeyinde dendritik ve aksonal morfolojileri yakalamaktır. Koku alma sisteminde, koku alma duyu nöronları aksonlarını burundaki koku alma epitelinden beyindeki koku alma ampulüne kadar uzatır. Birden fazla koku alma duyu nöronu, koku alma ampulüne doğru çıkıntı yaparken, demetler halinde büyülenirler.

Bu, bireysel akson yörüngelerinin ve bunların terminal morfolojilerinin incelenmesini zorlaştırır. Tek koku alma duyu nöronlarını in vivo olarak görselleştirmek için bir GFP yapısını mikro enjekte ederek bir yöntem geliştirdik. Lentivirüs taşıyan.

Lentivirus ile başarılı transdüksiyon, terminal çardak da dahil olmak üzere tüm koku alma duyusal akson uzunluğunu aydınlatır. Tek koku alma duyu nöronlarını görselleştirmeye ek olarak, bu yöntem, işlevini in vivo bir bağlamda incelemek için belirli bir genin gen ekspresyonunu manipüle etmemize izin verir. Bu lentivirüs prosedürü biyogüvenlik seviyesi ikidir ve laminer akış başlığında gerçekleştirilmesi gerekir.

Steril bir ortam sağlamak için, davlumbazın içine yerleştirilen her şeyi davlumbaza %70 etanol püskürtün, 37 derecelik bir su yatağını en az 20 dakika hazırlayın ve önceden ısıtın. Enjeksiyondan önce. Yarıya kadar suyla dolu bir plastik saklama torbasını kapatın ve boş bir ısıtma bloğu inkübatörüne koyun.

Bu, farelerin enjeksiyondan sonra iyileşmesini sağlayacaktır. Virüse maruz kalan tüm malzemeleri dekontamine etmek için biyolojik olarak tehlikeli bir atık kabını %10 çamaşır suyu ile doldurun. Bu prosedürden,% 70 etanol içeren küçük bir açık tabak ve steril damıtılmış su içeren ikinci bir tabak hazırlayın.

Laminer akış başlığında, 33 gauge iğneli beş mikrolitre kapasiteli bir Hamilton şırınga kullanacağız. Bu özel model, piston odasının üst kısmında bulunan bir gergi kadranını çevirerek piston direncini ayarlamanıza olanak tanır. Bu özellik, iğne ve şırınga haznesini sterilize etmek için mikroenjeksiyon hacim kontrolü sağlar.

Etanolü çanaktan birkaç kez tekrar tekrar aspire edin ve çıkarın. Şırınga kartuşunu steril suyu birkaç kez aspire edip çıkararak durulayın. Şırıngayı akış davlumbazında güvenli bir şekilde bir kenara yerleştirin.

Enjeksiyon istasyonunun yakınına alkollü mendiller yerleştirin. Farenin konumlandırılmasını kolaylaştıracak yükseltilmiş bir yüzey sağlayan bir enjeksiyon aşaması hazırlayın. Kim mendilleriyle kaplı ters çevrilmiş 10 santimetrelik bir kültür kabı kullanılabilir.

Fare yavruları sütten kesilme yaşına kadar hipotermi ile uyuşturulabilir. Lastik bir eldivenin bir parmağını kesin ve fare yavrusunu parmak kesimine yerleştirin. Sonra beş dakika boyunca buzun üzerine koyun.

Eldiven, hayvanın tepki vermediğinden emin olmak için yavrunun arkasını ve dört ayağını sıkıştırarak kapsamlı anestezi için buz testi ile doğrudan cilt temasından kaynaklanabilecek cilt yanıklarını önleyecektir. Artık lentivirüs mikroenjeksiyonu için hazırız. Yenidoğan bir yavru ile gösteri yapacağız.

Daha eski bir fare yaşı kullanılıyorsa, kafatasının yüzeyine nüfuz etmek için 33 gauge iğne daha kalın bir gauge iğne ile değiştirilmelidir. Farenin burun yüzeyini alkollü bir ped ile silerek sterilize edin. Lentivirüs stoklarını dondurucu deposundan çıkarın ve buz üzerinde çözdürün.

Lentivirüsü laboratuvarda kendimiz yerleşik yöntemler kullanarak ürettik. Bu yöntemi geliştirirken, iyi bir transdüksiyon oranı için mil başına 10 ila dokuzuncu enfeksiyöz birimin minimal bir viral titresinin gerekli olduğunu bulduk. Sterilize edilmiş Hamilton şırıngasına iki mikrolitre lentivirüs stok solüsyonu aspire edin.

Fare yavrusunu enjeksiyon aşamasının üstüne yerleştirin. Başın üstündeki cildi kulaklardan kavrayın ve yavaşça geri çekin. Akış davlumbazımızı bir diseksiyon dürbünü ile donattık.

Mikro enjeksiyonları doğru bir şekilde yönlendirmek için, koku soğancığının bir taslağı için ön beyindeki dorsal kafatası yüzeyini arayın. Mikro enjeksiyon hedeflerimiz koku soğancığını yakından çevreler, ancak ampulün kendisini içermemelidir. Her yavrunun koku alma epiteline dört enjeksiyon yapıyoruz.

Mavi noktalarla temsil edilen bu pozisyonlar, iğnenin medial olarak yönlendirilmiş bir açıyla yerleştirilmesini gerektirir. Yeşil noktalarla temsil edilen ek iki enjeksiyon, koku alma ampulünün önünde ve daha medial olarak kademelendirilir. Bu enjeksiyonlar koddly açılı olabilir.

İğne açısı önerileri, çoğunlukla koku soğancığının altında yer alan koku alma epitelinin ventral yerleşimi göz önünde bulundurularak yapılır. Böylece dikey erişim kısıtlanır. İğneyi burun boşluğunun üstünden, cilt yüzeyinin yaklaşık üç milimetre altından geçirin.

Koku alma epiteline ulaşmak için. Eğitimli bir el, burun boşluğu luminal boşluğuna ulaşıldığında dirençteki düşüşü hissetmelidir. Bu alandan uzak durulmalıdır.

Mikro, pozisyon başına 0,5 mikrolitre virüs stok çözeltisi enjekte eder. Yine, hem sol hem de sağ olmak üzere her iki taraf için iki bölge seçerek, toplam 0,5 mikrolitre dört enjeksiyon. Fare başına her biri, tek bir enjeksiyon seansında fare başına gereken iki mikrolitre virüs anlamına gelir.

Yine, koku soğanı lekesini enjekte etmemeye, enjeksiyon bölgesinden veya burun deliği açıklıklarından kaçabilecek herhangi bir kalıntı virüs solüsyonunu veya kanı kurutmamaya dikkat edin. Bir etanol mendil kullanarak, mendilleri seyreltilmiş sıvı ağartılmış kaba atın, enjekte edilen fareyi hemen geri kazanım için su yatağı inkübatörüne yerleştirin. Hazırlık sırasında gerçekleştirilen sterilizasyon prosedürünü tekrarlayarak iğne şırıngasını dekontamine edin Enjekte edilen fareler, su yatağı inkübatöründe iyileştikten 30 dakika sonra kafeslerine geri döndürülebilir.

Bu mikroenjeksiyonun tamamı dört saat içinde tekrar edilebilir. Enfekte olacak koku alma duyu nöronlarının sayısını artırmak isterseniz, enfekte koku alma duyusal nöronları hücrenin uzunluğu boyunca üç gün gibi kısa bir sürede görselleştirilebilir. Hayvanlar kurban edildi ve istenen zaman noktasında gözlem için perfüze edildi.

Standart yöntemler kullanarak Transdüksiyonlu tek hücreli koku alma duyusal nöron yörüngelerini ve akson terminallerini görselleştirmek için, koku soğanı koronalini 60 mikron kalınlığında inceliyor ve bölümlere ayırıyoruz. Bu nedenle bölüm, koku alma duyusal nöron akson demetleri ve yüzer immünohistokimyaya hazırlık olarak ampul yüzeyine bağlı glomerüler yapılarda sinaps yapan akson terminalleri dahil olmak üzere koku soğancığının tüm hücre katmanlarını içerecektir. Koku soğancığının seri bölümleri yapılır ve toplu olarak beş mililitre fosfat tamponlu salin ile 10 santimetrelik bir kültür kabına süpürülür.

Yüzen bölümleri 50 mililitrelik konik bir şişeye aktarın. Bölümler şişenin dibine yerleştikten sonra, fosfat tamponlu tuzlu suyu vakumlayın. Süpürmemeye dikkat edin.

Bölümleriniz, kalan fiksatif veya gömme malzemeleri yıkamak için 10 mililitre taze tampon ile doldurulur. Bu yeniden süspansiyonu hemen 15 mililitrelik konik bir şişeye pipetleyin, tüm yüzen bölümleri yakaladığınızdan, durulama solüsyonunu vakumladığınızdan ve bölümleri 10 dakika boyunca bir külbütör platformuna fosfat tamponu tuzlu su içinde %0,3 Triton X 100 çözeltisi ile delindiğinizden emin olun. Oda sıcaklığında, daha sonra aynı konik şişede standart bir immün boyama protokolünden geçebilir, bu boyuttaki kap için gerektiği gibi vakum ve külbütör adımlarını tekrarlayabilir, boyama ve durulama adımları için 10 mililitrelik bir hacmi koruyabilirsiniz.

İşte pozitif transdüksiyonlu koku alma duyu nöronlarını ve genel koku alma duyusal nöron popülasyonunu boyamak için kullandığımız antikorların bir listesi. 60 mikronluk ampul bölümlerinin tam antikor penetrasyonu için, gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edilmesi önerilir. Yıkama derinliği de her biri 20 dakikadan kısa olmamalıdır.

Her bölümü bir boya fırçası ile bir cam slayt üzerine nazikçe yayın, her slaytı kromatin leke çözeltisi ile desteklenmiş flora Dağı G ile monte edin. Montaj ortamındaki tüm kabarcıkları ortadan kaldırmak için çaba gösterin. Sonraki tarama adımını basitleştirmek için Bölümlerinizi satırlar halinde monte edin.

GFP pozitif akson lifleri ve uçları için immün leke ampulü bölümlerinizdeki bu katmanları tarayın. Bir floresan mikroskobu kullanılarak, pozitif olarak enfekte olmuş sinir terminalleri daha sonra konfokal mikroskopi ile görüntülenebilir. DPI ve koku alma işaretleyici protein kanallarını kullanarak ilgi alanınızdaki odak düzlemini kalibre etmek faydalı olacaktır.

Bu sonuçlar, glomerulus içinde tek bir koku alma sensörü nöron akson lifi ve akson terminali olup, bu CO ile koku alma marker proteini kırmızı, vlu iki gri enfekte koku sensörü nöron hücre gövdelerini ve bunların dendritik topuzunu, bu doku diseksiyon ve immün boyama adımlarına dahil edilmişse koku alma epiteli içinde de görüntülenebilir. Merhaba, konfokal projeksiyonum bize tek bir koku alma duyusal nöronunun aksonal uzantı yolu ve terminal çardağın çok ayrıntılı bir morfolojisini sağlıyor. Akson lifinin glomerüler hedefine doğru geri dönmesinin yanı sıra glomerüler nöro hap içindeki dallanma modelinin ayrıntıları da görülebilir.

Lentiviral mikroenjeksiyon yöntemi, tek hücreli aksonun, koku alma duyu nöronlarının morfolojilerinin görüntülenmesine izin verir ve gen ekspresyonunu manipüle eden çalışmalara izin verir, lentivirüs iletimi, yapıların kararlı genomik entegrasyonu ile sonuçlanır. Lentivirus, komşu hücreleri trans sinaptik olarak enfekte etmez. Görselleştirme üç gün gibi kısa bir sürede elde edilebilir ve en az üç ay sürdüğü onaylanmıştır ve muhtemelen daha uzun süreler boyunca devam eder.

Koku alma duyusal nöronları, lentivirüs çözeltisinin nazal infüzyonu ile kolayca enfekte olmaz. Bu nedenle bu işlemde yüzeyden mikroenjeksiyon yapılması gerekir. İşte bu bizim lentivirüs mikroenjeksiyon prosedürümüz.

Umarım tüm bu bilgileri kendi Mutlu avınızın tek hücre morfolojilerini elde etmek için yararlı bulmuşsunuzdur.