Genetik Olarak Tasarlanmış Fare Modellerinde Prostat Kanserinin Modellenmesi: Fare Ön Prostat Lob Hücrelerinde CRISPR/Cas9 Aracılı Lokalize Gen Düzenleme Tekniği

Güçlü bir yukarı akış promotörü tarafından Cas9 endonükleazlarını ve yeşil floresan proteinlerini veya GFP'leri eksprese etmek için tasarlanmış bir genom taşıyan, anestezi uygulanmış ve hazırlanmış bir CRISPR / Cas9 knock-in fare modeliyle başlayın. Normal koşullar altında Cas9 ve GFP transkripsiyonunu promotör bloklarının hemen aşağısına yerleştirilen floxed-STOP kaseti veya LSL.

Seminal veziküle bağlı ön prostat lobunu ortaya çıkarmak için farenin karın duvarını kesin. Hücrelere hedeflenen viral genom iletimini kolaylaştırmak için istenen adenoviral süspansiyonu ön loba enjekte edin. Prostat lobunu karın boşluğuna geri yerleştirin ve kesiyi dikin.

Virüs ile enfekte olmuş hücreler içinde, viral genom, mutasyona uğrayacak geni hedefleyen Cre rekombinaz enzimlerini ve kılavuz RNA'ları eksprese eder. Cre enzimleri LSL kasetini tanır ve floxed transkripsiyon blokerini eksize eder. Bu adım, promotörün Cas9 endonükleazlarının ve GFP'lerin ekspresyonunu yönlendirmesine izin verir.

Daha sonra, Cas9 endonükleazları, bu kompleksleri mutasyona uğratılacak gen içindeki hedef diziye yönlendiren virüs kodlu kılavuz-RNA'larla kompleksler oluşturur. Bu lokalizasyon, Cas9 endonükleazının hedef gen içindeki genomik DNA'yı parçalamasına izin vererek genetik değişikliğe yol açar.

Onkojenik bir değişiklik, mutasyona uğramış hücrelerin kanserli hale gelmesine neden olur. Mutasyona uğramış hücreler içinde GFP raportör proteinlerinin birlikte ekspresyonu, kanser ilerlemesinin tanımlanmasını ve izlenmesini kolaylaştırır.

Virüsü prostata iletmek için, 8 haftalık bir erkek fareyi metin protokolüne göre uyuşturduktan sonra, kas gevşemesi, pedal çekilmesi ve palpebral refleksleri değerlendirerek anestezi derinliğini inceleyin. Refleks kaybı gözlendiğinde, hayvanın alt karnını tıraş edin. Steril bir pamuklu çubuk kullanarak, kseroftalminin neden olduğu körlüğü önlemek için hayvanın gözlerini veteriner oftalmik merhemle dikkatlice örtün. Ardından, cerrahi alanı dezenfekte etmek için traşlı karnı silmek için %70 etanol ve %10 povidon-iyot kullanın.

Daha sonra, steril cerrahi makas kullanarak, alt karın orta hattında yaklaşık 1 santimetre dikey bir cilt kesisi yapın. Daha sonra, ince uçlu bir forseps ile, altında yatan organlara zarar vermemek için peritonu kaldırın ve periton boyunca 8 milimetre veya daha kısa bir kesi yapmak için cerrahi makas kullanın. Seminal vezikülü ortaya çıkarmak için yağ dokusunu nazikçe bir kenara hareket ettirin. Daha sonra, halkalı bir forseps kullanarak, ön prostat tanımlanana kadar seminal vezikülü dikkatlice kaldırın.

Şimdi, 0.5 mililitrelik bir insülin şırıngası ve 30G x 8 milimetrelik bir iğne ile, ön prostat epiteline toplam 30 mikrolitre virüs çözeltisi enjekte edin. Sızıntıyı en aza indirin ve sıvının doku içinde emilerek küçük bir baloncuk oluşturduğundan emin olun. Ardından, seminal vezikülü karın boşluğuna geri yerleştirin.

Sıvının doku içinde küçük bir baloncuk içinde ve sızıntı olmadan emilmesini sağlamak için, seminal veziküle paralel olarak ve ön prostat lobunun şeklini takip ederek enjekte ettiğinizden emin olun.

Konik uçlu bir iğne ve 13 milimetre, 3/8 daire ile peritonu 6-0 emilebilir dikişin iki ila üç basit kesintili dikişi ile dikin. Ardından, karın zarına zarar vermemek için cildi forseps ile kaldırın, cildi üç steril 4,8 x 6,5 milimetre klipsle zımbalayın.

Ameliyattan sonra daha iyi iyileşme için, steril 1 mililitrelik bir şırınga ve 27G x 1/2 inçlik bir iğne kullanarak anestezi panzehirini intraperitoneal enjeksiyon ile gram vücut ağırlığı başına 0.1 mililitre bir dozda uygulayın. Ardından, hayvanı dikkatlice kafesine geri yerleştirin.

• CRISPR/Cas9 knock-in mouse model - Genetically engineered rodent model used for research purposes involving the CRISPR/Cas9 genome editing system.
• Lsl cassette - A genetic construct used to block transcription under certain conditions.
• Cas9 endonucleases - Enzymes expressed by the Cas9 gene, used in CRISPR for cutting DNA at desired locations.
• Green Fluorescent Proteins (GFPs) - Proteins that glow green under specific light; used as a marker in biological research.
• Prostate Cancer Model - A mouse model designed for prostate cancer studies.

• Introduce CRISPR/Cas9 knock-in mouse model – Define and contextualize the genetically engineered rodent model utilized for genome editing research (e.g., mouse models of prostate cancer).
• Key Concepts – Summarize principles of genetic editing using concepts like lsl-cassette, Cas9 endonucleases, and GFPs (e.g., targeted viral genome delivery).
• Underlying Mechanisms – Briefly describe the process of creating a genetic mutation (e.g., Cre recombinase enzymes and guide-RNA).
• Connect to Experiment – Discuss the importance of these processes in creating prostate cancer mouse models, demonstrating genetic alteration and cancer progression.

• What is the CRISPR/Cas9 knock-in mouse model and how does it assist in genetic research?
• How does the incorporation of GFPs help in tracing cancer progression?
• What is the role of Cas9 endonucleases in the genetic mutation process?

• Practical Applications – Discuss real-world use cases of these techniques in genetic research and cancer study (e.g., prostate cancer research).
• Industry Impact – Identify research sectors benefiting from mouse models, including genome science, biotechnology, and healthcare (e.g., CRISPR technology).
• Societal Importance – Emphasize the wider benefits of this technology, in aiding our understanding of diseases and therapies (e.g., cancer research).
• Link to Scientific Advancements – Discuss the significant breakthroughs these models have led to in scientific research.