Genetik Olarak Tasarlanmış Fare Modellerinde Prostat Kanserinin Modellenmesi: Fare Ön Prostat Lob Hücrelerinde CRISPR/Cas9 Aracılı Lokalize Gen Düzenleme Tekniği

Güçlü bir yukarı akış promotörü tarafından Cas9 endonükleazlarını ve yeşil floresan proteinlerini veya GFP'leri eksprese etmek için tasarlanmış bir genom taşıyan, anestezi uygulanmış ve hazırlanmış bir CRISPR / Cas9 knock-in fare modeliyle başlayın. Normal koşullar altında Cas9 ve GFP transkripsiyonunu promotör bloklarının hemen aşağısına yerleştirilen floxed-STOP kaseti veya LSL.

Seminal veziküle bağlı ön prostat lobunu ortaya çıkarmak için farenin karın duvarını kesin. Hücrelere hedeflenen viral genom iletimini kolaylaştırmak için istenen adenoviral süspansiyonu ön loba enjekte edin. Prostat lobunu karın boşluğuna geri yerleştirin ve kesiyi dikin.

Virüs ile enfekte olmuş hücreler içinde, viral genom, mutasyona uğrayacak geni hedefleyen Cre rekombinaz enzimlerini ve kılavuz RNA'ları eksprese eder. Cre enzimleri LSL kasetini tanır ve floxed transkripsiyon blokerini eksize eder. Bu adım, promotörün Cas9 endonükleazlarının ve GFP'lerin ekspresyonunu yönlendirmesine izin verir.

Daha sonra, Cas9 endonükleazları, bu kompleksleri mutasyona uğratılacak gen içindeki hedef diziye yönlendiren virüs kodlu kılavuz-RNA'larla kompleksler oluşturur. Bu lokalizasyon, Cas9 endonükleazının hedef gen içindeki genomik DNA'yı parçalamasına izin vererek genetik değişikliğe yol açar.

Onkojenik bir değişiklik, mutasyona uğramış hücrelerin kanserli hale gelmesine neden olur. Mutasyona uğramış hücreler içinde GFP raportör proteinlerinin birlikte ekspresyonu, kanser ilerlemesinin tanımlanmasını ve izlenmesini kolaylaştırır.

Virüsü prostata iletmek için, 8 haftalık bir erkek fareyi metin protokolüne göre uyuşturduktan sonra, kas gevşemesi, pedal çekilmesi ve palpebral refleksleri değerlendirerek anestezi derinliğini inceleyin. Refleks kaybı gözlendiğinde, hayvanın alt karnını tıraş edin. Steril bir pamuklu çubuk kullanarak, kseroftalminin neden olduğu körlüğü önlemek için hayvanın gözlerini veteriner oftalmik merhemle dikkatlice örtün. Ardından, cerrahi alanı dezenfekte etmek için traşlı karnı silmek için %70 etanol ve %10 povidon-iyot kullanın.

Daha sonra, steril cerrahi makas kullanarak, alt karın orta hattında yaklaşık 1 santimetre dikey bir cilt kesisi yapın. Daha sonra, ince uçlu bir forseps ile, altında yatan organlara zarar vermemek için peritonu kaldırın ve periton boyunca 8 milimetre veya daha kısa bir kesi yapmak için cerrahi makas kullanın. Seminal vezikülü ortaya çıkarmak için yağ dokusunu nazikçe bir kenara hareket ettirin. Daha sonra, halkalı bir forseps kullanarak, ön prostat tanımlanana kadar seminal vezikülü dikkatlice kaldırın.

Şimdi, 0.5 mililitrelik bir insülin şırıngası ve 30G x 8 milimetrelik bir iğne ile, ön prostat epiteline toplam 30 mikrolitre virüs çözeltisi enjekte edin. Sızıntıyı en aza indirin ve sıvının doku içinde emilerek küçük bir baloncuk oluşturduğundan emin olun. Ardından, seminal vezikülü karın boşluğuna geri yerleştirin.

Sıvının doku içinde küçük bir baloncuk içinde ve sızıntı olmadan emilmesini sağlamak için, seminal veziküle paralel olarak ve ön prostat lobunun şeklini takip ederek enjekte ettiğinizden emin olun.

Konik uçlu bir iğne ve 13 milimetre, 3/8 daire ile peritonu 6-0 emilebilir dikişin iki ila üç basit kesintili dikişi ile dikin. Ardından, karın zarına zarar vermemek için cildi forseps ile kaldırın, cildi üç steril 4,8 x 6,5 milimetre klipsle zımbalayın.

Ameliyattan sonra daha iyi iyileşme için, steril 1 mililitrelik bir şırınga ve 27G x 1/2 inçlik bir iğne kullanarak anestezi panzehirini intraperitoneal enjeksiyon ile gram vücut ağırlığı başına 0.1 mililitre bir dozda uygulayın. Ardından, hayvanı dikkatlice kafesine geri yerleştirin.