Name: RNA İçeren Exosomes İzolasyonu ve Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Öğrenin RNA içeren eksozomların izolasyonu ve karakterizasyonu için ultrasantrifügasyon, elektron mikroskobisi ve akış sitometrisi yöntemlerini. Bu teknikler hücre biyolojisi ve nöroloji araştırmalarında eksozom fonksiyonlarını incelemeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmada, İsveç Araştırma Konseyi (K2008-57x-20 676-01-3) tarafından finanse edilmiştir.

1. Exosome izolasyon <ol><li> Exosome-serum ile orta hücreleri büyütün. Böylece, herhangi bir serum hücre kültür ortamına eklenen 4 gece boyunca 120 000 xg'de exosomes Ultrasantrifügasyon tarafından tüketilmiş olmalıdır ° C kullanmadan önce. </li><li> Konik tüpler için hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> 10 dakika boyunca 300 xg'de Santrifüj 4 ° C pelet hücreleri. </li><li> Tüpler ultrasantrifüjdeki ve tamamen dolu eklemek PBS süpernatantı aktarın. </li><li> 4 az 20 dakika boyunca 16 500 xg örnek Santrifüj ° C daha fazla hücre ve hücre enkaz kaldırmak için. </li><li> 200 nm den büyük parçacıkların kaldırılması için filtre 0.2 mikron ile süpernatantı Filtresi. </li><li> Yeni ultrasantrifüjdeki tüplere filtrelenmiş süpernatantı aktarın ve 70 dakika için 4 120 000 xg'de ultrasantrifüjdeki önce tüpler mühür ° C exosomes pelet. </li><li> Süpernatantı atın. </li><li> Maksimal exosome alma exosome zenginleştirmek için, tekrar süspansiyonuygun bir tampon küçük bir hacim (~ 3 x 50 ul) tekrar tekrar ed pelet. Bu tampon exosome izolasyon planlanan mansap deneyler bağlıdır. Örneğin, protein ve RNA izolasyonu için kullanılan lizis tamponu, PBS, elektron mikroskobu ve akım sitometri ve fonksiyonel çalışmalar orta tercih edilebilir için kullanılır. </li></ol> Not; exosomes ayrıca hücre kültür ortamı için aynı prosedürü kullanarak, plazma gibi farklı vücut sıvıları, izole edilebilir. Viskoz sıvılar için santrifüj ve filtrasyon adım önce PBS ile örnek sulandırmak için gerekli olabilir. Noktasının üzerinde 5 santrifüj hızı ile ilgili olarak, 29 500 xg artırılabilir, ve 90 dakika 18 nokta 7 Ultrasantrifügasyon kadar uzatılabilir. Örnek daha saflaştırılmış gerekiyorsa exosome pelet sukroz gradient sokulacak ve exosomes fraksiyonu huk öncelikle olacaknting yoğunluğu 1,13-1,19 gr / ml 2. 2. Elektron mikroskobu ile Exosome belirlenmesi, <ol><li> Daha da kirlenmesine neden olan proteinlerin ortadan kaldırılması, 4, 70 dakika için 120 000 xg ° C ile yeniden pelet exosomes exosome zenginleştirilmiş PBS pelet ve ultrasantrifüjdeki tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Küçük bir kısım protein izolasyonu ve total protein ölçümü için örnek ele alalım. Örnek sadece küçük bir parçası, protein ölçümü için parçalanmış ve kullanılan emin olun ve buz üzerinde ayrı ayrı ya da -80 ° C daha fazla deneyler için PBS içinde çözülmesi sağlam exosomes tutmak. </li><li> Bir Parafilm bir damla, PBS içinde yeniden süspanse sağlam exosomes exosomal protein yaklaşık 10 mg, koyun. Sonra, forseps, 30-60 dakika boyunca her damla üstüne formvar karbon kaplı nikel ızgara yavaşça yerleştirin. Izgara exosomes içeren damla karşı karşıya kaplama tarafında konumlandırılmış sağlamak. </li><li> T PBS üç damla, her biri 30 ul, Yero PBS damlacıklarının üstüne sırayla ızgara konumlandırma Parafilm ve ızgara yıkayın ve arasında bir emici kağıt kullanın. Sadece kaplı alanı ile temas yapmadan, ızgara ve yan yakından tutarak hafifçe emici kağıt kullanın. </li><li> Mevduat% 2 paraformaldehid Parafilm bir damla örnek Fix ızgara ve 10 dakika boyunca açılan üst üste yerleştirin. </li><li> Uygun bir antikor ile immün önce 4 nokta yıkama adımı yineleyin. Yaygın olarak kullanılan antikor, anti-CD63 ve anti-MHC sınıf II. Elektron mikroskobu da exosomes sadece boyutu ve morfolojisi dayanarak tespit edilebilir olarak immün olmadan yapılabilir. Ancak, boyutu, morfolojisi ve daha kesin doğrulama için bir membran proteini varlığı değerlendirmek için önerilir. </li><li> Izgara tercih birincil antikor 30 ul damlasına kadar aktarın ve 40 dakika boyunca inkübe edin. Nokta 4 tekrarlayarak yıkayın, ancak PB% 0.1 sığır serum albüminS PBS tek başına yerine. </li><li> Nokta 7 yineleyin, ancak 10 nm-altın etiketli sekonder antikoru ve PBS yalnız ile yıkayın. </li><li> ,% 2.5 lik gluteraldehit Parafilm bir damla ekleyerek örnek Post-düzeltmek ve damla 10 dakika boyunca üst ızgara kuluçkaya yatmaktadır. Noktası 4 yıkama yineleyin, ancak beş deiyonize su damlacıkları yerine PBS üç damlacıkları kullanabilirsiniz. </li><li> Kontrast için% 2 uranil asetat Parafilm bir damla damla 15 dakika boyunca üst üste ekleyerek ve ızgara inkübe örnek. </li><li> Embed Parafilm% 0,13 metil selüloz ve% 0.4 uranil asetat damla ekleyerek örnek ve damla 10 dakika boyunca üst ızgara kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Bir kağıt kaplı yüzü ızgara konumlandırma önce, yavaşça bir emici kağıt kullanarak fazla sıvıyı çıkarın ve 5 dakika boyunca hava kuru sağlar. </li><li> Bir elektron mikroskobu ile hazırlıklarını incelemek veya ızgaraları gelecekte yapılacak çalışmalar için bir ızgara kutusunda saklayın. </li></ol> 3.Flow sitometri ile Exosome karakterizasyonu Exosomes akım sitometri cihaz tarafından tespit edilmesi çok küçük olduğundan, ilk exosomes antikor kaplı boncuklar (Şekil 1) bağlamak için gereklidir. Bu boncuklar ya da hazır bir ürün olarak satın alınan ya da tercih edilen antikor ile yapılan laboratuar olabilir. Exosomal hücresel kökene bağlı olarak, farklı antikorlar, manyetik veya lateks karakter olabilir boncuk akuple edilebilir. Şu anda bu analiz için anti-MHC sınıf II veya anti-CD63 kaplı boncuk kullanın. <ol><li> "Ev yapımı" antikor kaplı boncuk kullanımı için, anti-CD63 antikoru ile kaplı 4 mikron lateks boncuk kullanmayın. 100 ul MES tampon iki kez 25 ul 4 mikron lateks boncuk (30 x 10 6 boncuk), 15-20 dakika boyunca 3 000 xg yıkayın ve 100 ul MES tampon pelet çözülür . MES tamponu aynı hacmi 12.5 mikrogram antikor eşit bir hacim içeren antikor karışımı hazırlayın. Ekleantikor karışımı ve gece boyunca oda sıcaklığında ajitasyon altında inkübe boncuk. PBS (3 000 xg 20 dakika) ile antikor kaplı boncuk üç kez yıkayın ve (300 000 boncuk / ml son bir konsantrasyon ile) 100 ul depolama tampon pelet çözülür. </li><li> Her bir örnek için (her bir antikor) ~ 100 000 antikor kaplı boncuk başına 30 mikrogram exosomal protein (PBS içinde çözülmesi sağlam exosomes) en az eşit bir hacmi ile devam edin. </li><li> 4 gece boyunca, toplam hacmi 300 ul PBS exosomes ve boncuklar inkübe ° C altında nazik bir hareket. </li><li> 30 dakika süreyle 200 mM glisin ve inkübe 300 ul ekleyerek engelleme. </li><li> Iki kez yıkama tamponu exosome boncuk kompleksleri (PBS içinde% 1-3 serumu), 10 dakika için 600 xg yıkayın. </li><li> 4 50 ul IgG antikorları ile exosome boncuk kompleksleri ° C inkübe 5. adımda anlatıldığı gibi iki kez yıkama tamponu exosome boncuk kompleksleri yıkayın. </li><li> 90 ul yıkama tamponu ve 10 ul ekleseçim nazik hareketi altında 40 dakika boyunca exosome boncuk kompleksleri ve inkübe antikoru (anti-anti-CD63 CD9 veya anti-CD81 ideal). 5. adımda anlatıldığı gibi yıkama tamponu exosome boncuk kompleksleri iki kez yıkayın. </li><li> 300 ul yıkama tamponu ekleyin ve flow sitometri kullanarak veri almak. </li></ol> Yukarıda ele alındığı gibi, farklı boncuklar gibi, protokol veya manyetik boncuk açıklandığı gibi lateks boncuk gibi kullanılabilir. Manyetik bilye yerine kullanılması halinde, protokol biraz farklı olduğunu lütfen unutmayın. Engelleme adım (nokta 4) gerekli değildir ve yıkama, santrifüj yerine manyetik bir stand tüp koyarak yapılır. "Ev yapımı" antikor kaplı boncuklar için kullanılan depolama tampon,% 0.1 glisin ve 7.2 pH, PBS içinde azid% 0,1 sodyum içerir. Daha da önemlisi, herhangi bir önlemek için, flow sitometri yıkama tamponu (PBS içinde serum% 1-3) exosome tükenmiş serum kullandığınızdan emin olunanaliz kirlenmesine neden olan serum exosomes. Not; antikor birleştiğinde boncuklar kullanarak exosome karakterizasyonu yaparken sadece izole ve karakterize kullanılan antikor için özel bir özel ICSI'nin olduğunu kabul etmek önemlidir. 4. Western Blot Exosome tespiti Western Blot iyi kurulmuş bir yöntem olduğunu ve yöntemi kendisi ile ilgili detaya gidin, ama Western Blot ve kullanılan farklı antikorlar önce uygun bir protein izolasyonu önemini odaklanmak olmaz. <ol><li> Tercih edilen protein lizis tamponu exosome pelet çözülür ve vorteks karıştırma iyice pipetleme. Exosomes lyse için, bir su banyosunda 3 örnek sonikasyon x 5 dakika arasında girdap karıştırma. Sonunda oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 13 000 xg örnek santrifüj, ve yeni bir Eppendorf tüpüne süpernatantı transfer. </li><li> Measuyeniden tercih edilen bir yöntem ile total protein ve ortalama 20-50 mg protein yük. </li><li> Ayrı ve proteinler jel elektroforezi ve electroblotting aktarmak. </li><li> Blok ve exosomes olarak zenginleştirilmiş proteinlere karşı immün gerçekleştirmeden önce membran yıkayın. </li><li> Kemilüminesans, dijital görüntüleme sistemi ve analiz yazılımları özel bir protein algılar. </li></ol> Tüm farklı cep telefonu kökenlerden gelen exosome özel işaretleri, exosomes zenginleştirilmiş olan proteinlerin, olduğu gibi, exosome algılama için sık kullanılır. Bunlar tetraspanins (örneğin CD9, CD63 ve CD81), hücre iskeletinin ilişkili protein (örneğin Ezrin) ve multivesicular biyogenezi (örneğin Tsg101 ve Alix) ilgili proteinler gibi proteinlerdir. Ancak, diğer proteinler de yaygın exosomes tespit Flotillin, Hsc70 ve farklı rab proteinler vb A33 (bağırsak epitel hücreleri) gibi exosomes bulundu hücre spesifik proteinlerin, CD3 de vardır(T hücreleri) ve MHC sınıf II (antijen sunan hücreler). Böylece, exosomes tespiti için belirteçler yayımlanan hücre tipine bağlı olarak değişiklik gösterebilir. Hücrenin diğer bölmeleri de veziküller üretebilir, daha fazla (örneğin calnexin ve Grp78) endoplazmik retikulum ve golgi (örneğin GM130) olarak bu bölmeleri proteinlerin varlığını belirlemek için tavsiye edilir. Böylece, bu proteinlerin eksikliği okudu örnek diğer bölmeleri veziküller ya hiç ya da çok az kirlenme gösterir. 5. Exosomal RNA ve RNA analiz izolasyonu <ol><li> Seçim RNA lizis tamponu exosome pelet çözülür ve RNA çekimini gerçekleştirebilecek. Farklı RNA izolasyon kitleri mansap deneyler bağlı olarak kullanılan, ancak sütun tabanlı yöntemler RNA daha geniş bir spektrum sağlar örnekleri olabilir. Şu anda Exiqon miRCURY RNA İzolasyon Kiti kullanarak, ancak diğer kitleri sc bağlı olarak uygun olabilireldeki ientific soru. </li><li> RNA izolasyonu yaparken RNaz özgür bir ortamda çalışmak için önemlidir. Bu nedenle, nükleik asit ve nükleaz pipet uçları kullanımı ve ücretsiz tezgah ve ekipman hem de kirleticiler ve RNases silin. </li><li> RNA izolasyonu için, miRCURY RNA İzolasyon Kiti kullanarak, 350 ul lizis çözüm exosome pelet çözülür ve 15 saniye boyunca girdap karıştırma gerçekleştirebilirsiniz. </li><li> % 95 etanol ve vorteks karıştırma 10 saniye boyunca 200 ul ekleyin. </li><li> Bir toplama tüpüne koyun ve bir sütun sütun parçalanmış exosomes transferi ve 14 000 x g. 1 dakika santrifüj </li><li> 1 dakika 14 000 x g. exosomal RNA ve santrifüj içeren sütun Yıkama Çözeltisi 400 ul ekleyerek üç kez yıkayın </li><li> Sütun, sütun kuru ve kuru bir RNaz-free Eppendorf tüp sütun emin olmak için 14 000 xg 2 dakika boyunca santrifüjleyin. </li><li> 2 sütun ve santrifüj 50 ul Elüsyon Tampon ekle 200 xg'de dakika, 14 000 x g. az 1 dakika takip </li><li> Izole RNA ile devam edin ya da -80 depolamak ° C </li></ol> Tespiti ve analizi için çıkarılan toplam exosomal RNA, RNA 6000 Nano veya RNA 6000 Pico Kit ile bir Agilent 2100 Bioanalyzer kullanın. Analizi exosomal RNA verim ve boyut dağılımı gösterir. 6. Temsilcisi Sonuçlar Exosomes flow sitometri yöntemleri ile tespit edilemeyecek kadar küçük ve bu nedenle (Şekil 1) analiz edilmeden önce, antikor kaplı boncuk bağlı . Exosome boncuk kompleksleri agrega gibi tek, çift ve üçlü boncuk flow sitometri scatter plot farklı popülasyonlar (Şekil 2A) içerebilir. Ok daha fazla analiz tek boncuk gösterir. Izotip kontrol ile karşılaştırıldığında CD63 pozitif tek boncuk exosome nüfus Şekil 2B gösterilmiştir. Şekil 3, elektron mikroskobu e_content "&gt; exosomes küçük boyutu sayesinde, sadece elektron mikroskobu, ışık mikroskobu ile direkt görüntülenebilmekte, değil. exosomes Tipik morfolojik özellikleri, yuvarlak ve 30-100 nm boyutlu membran veziküller. fotoğraflar exosomes CD63 için altın etiketli antikor (ok ile gösterilir) ve non-ile immunohistokimyasal exosomes (B) (A) immunohistokimyasal göstermektedir. Izole veziküller gerçekten exosomes olduğunu belirlemek ve daha exosomal proteinleri karakterize etmek için, Western Blot yaygın olarak kullanılmaktadır. Şekil 4 calnexin, endoplazmik retikulum marker bulunmaması gösterir . Bu veziküller, endoplazmik retikulum az kontaminasyon gösterir. Ayrıca, Şekil 4 exosomes sık zenginleştirilmiş bir tetraspanin exosomes CD81 varlıkları gösterir. Hücresel RNA esas içerenbir Bioanalyzer analizi (Şekil 5A) 18S ve 28S rRNA alt birimden iki önemli zirveleri olarak görülen ribozomal RNA (rRNA). Exosomes iki rRNA zirveleri (18S ve 28S) eksikliği ve kısa RNA, mRNA ve miRNA (Şekil 5B) olarak zenginleştirilmiş Ancak, exosomal RNA, kendi profiline farklı. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Exosomes (30-100 nm) küçük boyutu nedeniyle, flow sitometri ile analiz edildiğinde, arka plan gürültü ve ayırt edilemez. Bu nedenle, daha sonra lazer tarafından görüntülenmiştir olabilir exosomes analiz öncesi antikor kaplı boncuklar, onları takmak için gereklidir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Kompleks birbirlerine ve form çift ve üçlü boncuk agrega exosome boncuk (A). Gösteren ok tek bir boncuk exo kapılı ve daha fazla analiz için kullanılan bazı nüfus. Bu nüfusun doğrudan exosomes membran moleküllerin varlığını belirlemek için bir izotip kontrolü (dolu gri pik) karşılaştırılır. CD63 pozitif exosomes (siyah açık pik) Şekil B'de gösterilmiştir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Tipik morfolojisi ve boyutu (40-80 nm) (A ve B) ile exosomes elektron mikroskobu. Resimde ok bu exosome, membran yüzeyinde CD63 olduğunu doğrulayarak, ikincil antikor altın parçacık gösterir. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4. Western Blot sonuçları endoplazmik retikulum protein calnexin yokluğunda ancak yaygın exosomes, tetraspanin CD81 zenginleştirilmiş protein varlığını gösteren. ve_content "&gt; <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5. Bioanalyzer hücreleri (A) ve (B) exosomes varlığı RNA gösteren sonuçlanır. Oklar, 18S gösterir ve 28S rRNA alt birimden hücreleri mevcut. Exosomal RNA erkekçe küçük RNA içeren ya hiç ya da çok az rRNA exosomes tanımlanır.

<ol><li>Pan, B. -T., Johnstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+the+transferrin+receptor+during+maturation+of+sheep+reticulocytes+in+vitro%3A+Selective+externalization+of+the+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Fate of the transferrin receptor during maturation of sheep reticulocytes in vitro: Selective externalization of the receptor.</a> Cell. 33, 967-978 (1983).</li>
<li>Chaput, N., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+immune+properties+and+potential+clinical+implementations%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Exosomes: immune properties and potential clinical implementations.</a> Semin. Immunopathol. , 10-1007 (2010).</li>
<li>Lässer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-containing+exosomes+in+human+nasal+secretions%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Rhinol.+Allergy%22%5BJournal%5D)">RNA-containing exosomes in human nasal secretions.</a> Am. J. Rhinol. Allergy. 25, 89-93 (2011).</li>
<li>Caby, M. -P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal-like+vesicles+are+present+in+human+blood+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma.</a> Int. Immunol. 17, 879-887 (2005).</li>
<li>Palanisamy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanostructural+and+Transcriptomic+Analyses+of+Human+Saliva+Derived+Exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Nanostructural and Transcriptomic Analyses of Human Saliva Derived Exosomes.</a> PLoS ONE. 5, e8577-e8577 (2010).</li>
<li>Admyre, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+with+Immune+Modulatory+Features+Are+Present+in+Human+Breast+Milk%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exosomes with Immune Modulatory Features Are Present in Human Breast Milk.</a> J. Immunol. 179, 1969-1978 (2007).</li>
<li>Almqvist, N., Lönnqvist, A., Hultkrantz, S., Rask, C., Telemo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-derived+exosomes+from+antigen-fed+mice+prevent+allergic+sensitization+in+a+model+of+allergic+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Serum-derived exosomes from antigen-fed mice prevent allergic sensitization in a model of allergic asthma.</a> Immunology. 125, 21-27 (2008).</li>
<li>Prado, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+from+Bronchoalveolar+Fluid+of+Tolerized+Mice+Prevent+Allergic+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exosomes from Bronchoalveolar Fluid of Tolerized Mice Prevent Allergic Reaction.</a> J. Immunol. 181, 1519-1525 (2008).</li>
<li>Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eradication+of+established+murine+tumors+using+a+novel+cell-free+vaccine%3A+dendritic+cell-derived+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+Medicine%22%5BJournal%5D)">Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell-derived exosomes.</a> Nature. Medicine. 4, 594-600 (1998).</li>
<li>Ashiru, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+Killer+Cell+Cytotoxicity+Is+Suppressed+by+Exposure+to+the+Human+NKG2D+Ligand+MICA%2A008+That+Is+Shed+by+Tumor+Cells+in+Exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Research%22%5BJournal%5D)">Natural Killer Cell Cytotoxicity Is Suppressed by Exposure to the Human NKG2D Ligand MICA*008 That Is Shed by Tumor Cells in Exosomes.</a> Cancer. Research. 70, 481-489 (2010).</li>
<li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+Mammary+Carcinoma+Exosomes+Promote+Tumor+Growth+by+Suppression+of+NK+Cell+Function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Murine Mammary Carcinoma Exosomes Promote Tumor Growth by Suppression of NK Cell Function.</a> The Journal of Immunology. 176, 1375-1385 (2006).</li>
<li>Viaud, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+Cell-Derived+Exosomes+Promote+Natural+Killer+Cell+Activation+and+Proliferation%3A+A+Role+for+NKG2D+Ligands+and+IL-15R%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dendritic Cell-Derived Exosomes Promote Natural Killer Cell Activation and Proliferation: A Role for NKG2D Ligands and IL-15Rα.</a> PLoS ONE. 4, e4942-e4942 (2009).</li>
<li>Szajnik, M., Czystowska, M., Szczepanski, M. J., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-Derived+Microvesicles+Induce%2C+Expand+and+Up-Regulate+Biological+Activities+of+Human+Regulatory+T+Cells+%28Treg%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Tumor-Derived Microvesicles Induce, Expand and Up-Regulate Biological Activities of Human Regulatory T Cells (Treg).</a> PLoS ONE. 5, e11469-e11469 (2010).</li>
<li>Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+lymphocytes+secrete+antigen-presenting+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.</a> J. Exp. Med. 183, 1161-1172 (1996).</li>
<li>Abusamra, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+exosomes+expressing+Fas+ligand+mediate+CD8%2B+T-cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells%2C+Molecules%2C+and+Diseases%22%5BJournal%5D)">Tumor exosomes expressing Fas ligand mediate CD8+ T-cell apoptosis.</a> Blood Cells, Molecules, and Diseases. 35, 169-173 (2005).</li>
<li>Valadi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nat. Cell Biol. 9, 654-659 (2007).</li>
<li>Eldh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+communicate+protective+messages+during+oxidative+stress%3B+possible+role+of+exosomal+shuttle+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Exosomes communicate protective messages during oxidative stress; possible role of exosomal shuttle RNA.</a> PLoS One. 5, e15353-e15353 (2010).</li>
<li>Lässer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+saliva%2C+plasma+and+breast+milk+exosomes+contain+RNA%3A+uptake+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages.</a> J. Transl. Med. 9, 9-9 (2011).</li>
</ol>

JL hücrelere RNA transferi için vektörler olarak exosomes kullanımı ile ilgili bir patent sahibi.

Moleküler içerik ve / veya exosomes fonksiyon öğrenim görürken, bu, uygun bir verim ve mümkün olan en düşük derecede kontaminasyon sağlayan yüksek kaliteli bir yalıtım yöntemi kullanmak için çok önemlidir. Bu yazıda anlatılan metodoloji exosomes yalıtma ve RNA içeriği ve biyolojik işlevini incelemek için iyi kurulmuş bir yaklaşımdır. Ayrıca, elektron mikroskobu, flow sitometri ve Western Blot gibi farklı yöntemler, bir kombinasyonu ile izole exosomes karakterizasyonu önemi vurgulanır. Exosomes izole, ilk santrifüj basamağı (300 xg), hücre süspansiyonu ya da incelenen biyolojik sıvılarda mevcut olabilir pelet hücrelere kullanılır. 16 500 xg ihtiyaçlarına ikinci santrifüj pelet ölü hücreler, daha büyük enkaz, apoptotik organları ve diğer organeller için yeterince güçlü. Bu santrifüj sonra, bazı protokollerde bir nano-filtrasyon adım, ancak bazı investigators bu adımı dışı bırakılmıştır. Ancak, ortadan kaldırılması parçaları ve 200 nm den daha büyük ve bu nedenle güçlü bir filtrasyon adım da dahil olmak üzere tavsiye veziküller önemini vurgulamak. Daha sıkı bir izolasyon gerekli ise, 100 nm filtreler kullanılır, ancak viskoz sıvıların kullanılması durumunda, bu filtreler kolayca bloke olur ve exosomal malzeme kaybolur olabilir ki dikkat edilebilir. Ayrıca, 100 nm filtrasyon exosomes morfolojisi etkileyebilir ve exosomes büyük ölçekli olup olmadığını dahası kaybolabilir. Böylece, 200 nm filtreleri exosome izolasyonu için uygun görünüyor. Süzüldükten sonra, 120.000 xg&#39;de zorunlu Ultrasantrifügasyon exosomes pelet için kullanılır. Exosomes daha fazla antikor kaplı boncuklar bağlı ve yıkanmış veya kirlenme proteinler kaldırmak için sukroz gradient yerleştirilen PBS ile yıkanır. Ancak, bu başlangıç ​​örnek hacmi, özellikle küçük ve / veya RNA içeriği o, biz gerekli olmadığı iddia bir çok kaynak alıcı bir süreç olabilirek adımlar önemli ölçüde daha fazla malzeme azalacak f exosomes düşük olması. Ancak, yine, izole veziküllerin doğası bazı proteinlerin varlığı ve yokluğu ile kanıtlanmış olmalıdır. Bugüne kadar, kesinlikle benzersiz protein exosomes için hiçbir işaretleyici örnek exosomes ve başka bir şey içerdiğini doğrulamak için tespit edilmiştir. Sonuç olarak, yöntemlerin bir kombinasyonu, elektron mikroskobu ile exosomes boyutu ve morfolojisi belirlenmesi de dahil olmak üzere exosomes, karakterize etmek için gereklidir. Ayrıca, bu yöntem, mikro, apoptotik organları ya da hücre artıkları gibi büyük veziküller, örneğin örnek kontaminasyon düzeyinin genel bir bakış sağlamak gibi örnek saflığı, elektron mikroskobu ile tespit edilebilir. Ayrıca, akım sitometri ve Western Blot exosomes protein içeriği belirlenir ve hem membran bir analiz, bu iki yöntemin sonuçları kombinasyonu (örn. CD63 bağlı veExosomes CD81) ve içselleştirilmiş proteinler (örneğin Tsg101 ve Alix). Algılama, CD63, Tsg101 ve Alix, endoplazmik retikulum protein calnexin gibi proteinlerin yokluğu gibi exosomes, zenginleştirilmiş proteinlerin exosome zenginleştirilmiş pelet gerçekten exosomes ve veziküllerin hücrenin diğer bölmeleri kirlenmesine neden olduğunu bir göstergesidir. Exosomes tespit RNA profili sağlam hücreleri bulunan RNA temelde farklı. Böylece, Bioanalyzer veya jel bazlı RNA analiz yaklaşımları analiz exosomal RNA hücresel RNA analizi belirgin 18S ve 28S rRNA alt birimden, iki tepe yoksundur. Bu nedenle bir örnek rRNA önemli bir miktarı tespiti, izolasyon yöntemi geliştirilmiş ve kalite güvence gerektiğini, böylece çıkarılan toplam RNA yalnız exosomal kökenli olduğunu gösterir ve bu savunuyorlar.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Exosome izolasyon </td></tr><tr><td> Optima L-90K ultrasantrifüjdeki </td><td> Beckman Coulter </td><td> 65670 </td><td></td></tr><tr><td> Hızlı yapışma ultrasantrifüjdeki tüpler </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td> Rotorun bağlı olarak kullanılan farklı tüpler ihtiyaç vardır. Ti70 (342.414), Ti45 (345.776) </td></tr><tr><td> Hızlı-Seal Akülü Tüp Topper kiti </td><td> Beckman Coulter </td><td> 358312 </td><td></td></tr><tr><td> Filtropur Şırınga Filtresi, 0.20μm </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1826.001 </td><td> VWR Uluslararası viskoz akışkanlar ve / veya büyük hacimler, Vakum filtrasyon sistemi, 0.2 mm, (514-0600) yerine kullanılabilir. </td></tr><tr><td> Elektron mikroskobu </td></tr><tr><td> Formvar / karbon kaplı nikel ızgaralar </td><td> Ted Pella Inc. </td><td> 1GN200 </td><td></td></tr><tr><td> Fare-insan, anti-CD63 </td><td> Bioscience BD </td><td> 556019 </td><td> Final kons: 0.05μg/μl </td></tr><tr><td> Izotip kontrolü; IgG1κ (MOPC 21) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M9269 </td><td> Final kons: 0.05μg/μl </td></tr><tr><td> Anti-Mouse IgG Gold Konjugat, 10 nm </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7777 </td><td> Final kons:% 1 </td></tr><tr><td> LEO 912AB Omega Elektron mikroskobu </td><td> Carl Zeiss NTS </td><td></td><td> Veya eşdeğeri ekipman. </td></tr><tr><td> Flow sitometri </td></tr><tr><td> 4μm aldehid / sülfat lateks boncuk </td><td> Arayüzey Dynamics </td><td> 12-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Lateks boncuk kaplama için Antikor </td><td></td><td></td><td> Örneğin anti-CD63 Bioscience BD (556.019) </td></tr><tr><td> Intelli-Mikser RM-2L </td><td> Elmi </td><td></td><td> Veya eşdeğeri ekipman. </td></tr><tr><td> Insan serumu ile IgG </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I4506 </td><td></td></tr><tr><td> Algılama için antikorlar </td><td> Bioscience BD </td><td></td><td> Örneğin: PE anti-CD63 (556.020) PE anti-CD9 (555.372), anti-CD81 PE (555.676) İzotip kontrolü (555.749) </td></tr><tr><td> BD FACSAria </td><td> Bioscience BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Western Blot </td></tr><tr><td> Transsonic T 490 DH </td><td> ELMA </td><td></td><td> Veya eşdeğeri ekipman. </td></tr><tr><td> Exosomal RNA ve RNA analiz izolasyonu </td></tr><tr><td> miRCURY RNA İzolasyon Kiti </td><td> Exiqon A / S </td><td> 300110 </td><td></td></tr><tr><td> Agilent 2100 Bioanalyzer </td><td> Agilent Technologies </td><td> G2939A </td><td></td></tr></tbody></table>

rna İçeren exosomes İzolasyonu ve karakterizasyonu

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

Exosome araştırma alanında hızla yayınlarda son yıllarda dramatik bir artış ile genişletiyor. Endositik kökenli bu küçük veziküller (30-100 nm) eritrositler 1 içine olgunlaşması retikülositler transferrin reseptör ortadan kaldırmak için bir yol olarak işlev ilk teklif edildiğinde, ve daha sonra exosomes seçildiler. Exosomes multivesicular organları (MVBs) üreten, endosomes geç içe tomurcuklanan tarafından oluşturulan ve plazma zarı 2 ile MVBs füzyonu çevreye salınır. Exosomes ilk keşfinden beri, hücrelerin geniş bir yelpazede bu veziküller serbest bırakmak için ortaya konmuştur. Exosomes de dahil olmak üzere birçok biyolojik sıvılarda, plazma, nazal lavaj sıvısı, tükürük, anne sütü 3-6 tespit edilmiştir. Ayrıca, exosomes içeriği ve işlevi kaynaklanan hücre ve hangi koşullar altında üretilen bağlı olduğunu kanıtlanmıştır. Fonksiyonları çeşitli iblislerallerjen 7,8, farelerde 9, T regülatör hücreleri 13, 14 T hücre çoğalması uyarımı inhibisyonu ve doğal katil hücrelerin aktivasyonu 10-12, farklılaşma tanıtım yerleşmiş tümörlerin ortadan kaldırılmasına karşı tolerans indüksiyonu gibi exosomes ve için hayal kırıklığına uğramışlardı ; 15 apoptozis T hücre indüksiyon. Yıl 2007, mast hücreleri serbest exosomes mesajcı RNA (mRNA) ve microRNA (miRNA) içerirler ve RNA üzerinden başka bir exosomes bir hücre için mekik olduğunu göstermiştir. Alıcı hücreleri, exosomes tarafından mekik mRNA, transfer RNA 16, düzenleyici bir işlev düşündüren, protein tercüme oldu . Ayrıca, biz de alıcı hücreleri oksidatif stres altında yetiştirilen hücreler türetilmiştir exosomes daha fazla strese karşı tolerans neden ve böylece exosomal transfer RNA 17 biyolojik bir işlevi önermek olduğunu göstermiştir . Hücre kültürü medya ve biyolojik sıvılarda coveziküller bir karışımı ntain ve parçaları döken. Exosomes için yüksek kaliteli bir izolasyon yöntemi, karakterizasyonu ve exosomes ve içeriklerinin belirlenmesi, bu nedenle diğer veziküller ve parçacıklar exosomes ayırt etmek çok önemlidir. Burada, hücre kültürü, orta ve vücut sıvıları hem exosomes izolasyonu için bir yöntem sunar. Bu izolasyon yöntemi exosomes pelet olan nihai bir Ultrasantrifügasyon adım takip tekrarlanan santrifüj ve filtrasyon adımları dayanmaktadır. Exosomes exosomal morfolojisi ve protein içeriği belirlemek ve karakterize etmek için önemli yöntemler de dahil olmak üzere, elektron mikroskobu, flow sitometri ve Western Blot vurgulanır. Toplam exosomal RNA arıtma spin kolon kromatografisi dayalı ve exosomal RNA verim ve boyut dağılımı Bioanalyzer kullanılarak analiz edilmektedir.

Bu kağıt, izolasyon, saflaştırma ve exosomes tespiti, moleküler içerik analizi teknikleri gibi yöntemleri gösteriyor. Bu yöntemler, hücre kültürü medya ve biyolojik sıvılarda exosome izolasyonu için uyarlanabilir ve moleküler içerik analizi ötesinde işlevsel çalışmalarda da yararlı olabilir.

RNA İçeren Exosomes İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Ekzozom araştırma alanı, son yıllarda yayın sayısındaki çarpıcı artışla birlikte hızla genişlemektedir. ...'nın bu küçük vezikülleri (30-100 nm)

Aşağıdaki deneyin genel amacı, ilgili hücrelerin ve biyolojik sıvıların RNA içeren ekzozomlar salıp salmadığını veya içerip içermediğini belirlemektir. Ekzozomları izole etmek için ilk adım hücrelerin ve hücre kalıntılarının uzaklaştırılmasıdır. Ardından, daha büyük partikülleri temizlemek için süpernatan filtrelenir.İkinci bir adım olarak eksozomlar ultrasantrifüjasyon yoluyla çöktürülür. İzole edilen veziküllerin eksozom morfolojisine, boyutuna ve protein kompozisyonuna sahip olduğunu göstermek için eksozomlar elektron mikroskobu, akış sitometrisi ve western blot analizi ile karakterize edilir. Ardından, saflaştırılmış eksozomlardan RNA izole edilir.Eksozomların hangi RNA'ları içerdiğini belirlemek amacıyla, eksozomların saflaştırılması, tespiti ve karakterizasyonu için kullanılan bu kabul görmüş yöntemlerle elde edilen sonuçlar, eksozomların biyolojik fonksiyonları gibi ileri çalışmalara kolaylık sağlayabilir. Bu nedenle, bu sunum eksozomların farklı yöntemlerle nasıl izole edilebileceğini gösterecek ve bunu sunacak olan kişiler iki doktora öğrencim Maria ve Cecelia'dır. Başarılar.Eksozom izolasyon prosedürünü başlatmak için bu eksozom izolasyonu demonstrasyonunda insan mast hücresi hattı HC1 kullanılmaktadır. Öncelikle, hücreleri eksozomdan arındırılmış serum içeren ortamda büyütün. Ardından hücre süspansiyonunu konik tüplere aktarın ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 300 ×g'de santrifüjleyin.Hücreleri çöktürmek için süpernatanı ultrasantrifüj tüplerine aktarın ve hücreleri ve hücre kalıntılarını tamamen uzaklaştırmak için örneği 4 °C'de 20 dakika boyunca 16.500 ×g'de santrifüjleyin. Ardından, 200 nanometreden büyük partikülleri daha fazla uzaklaştırmak için süpernatanı 0,2 mikronluk bir filtreden süzün. Son olarak, filtrelenmiş süpernatanı içeren ultrasantrifüj tüplerini kapatın ve eksozomları çöktürmek için 4 °C'de 70 dakika boyunca 120.000 ×g'de ultrasantrifüjleyin.Eksozomlar, ultrasantrifüj tüpünün kesilip açılması, supernatantın atılması ve eksozomca zenginleştirilmiş peletin yeniden süspanse edilmesiyle geri kazanılır. Maksimum eksozom geri kazanımı için, eksozomca zenginleştirilmiş pelet, bir endotüp içerisindeki küçük hacimli uygun bir tampon çözeltide tekrar tekrar süspanse edilir.Önceki ile aynı hacimde ek tamponla iki kez durulayın. Kullanılacak tampon, eksozom izolasyonunu takip eden deneylerin türüne bağlıdır. Elektron mikroskobu için sağlam eksozomlardan yaklaşık 10 µg eksozomal protein kullanın.PBS içerisinde yeniden süspansiyon işlemi gerçekleştirildi. Eksozomlar sadece boyut ve morfolojiye dayalı olarak tanımlanabildiği için, karbon kaplı nikel grid elektron mikroskopisi immün boyama yapılmadan gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, anti CD 63 veya anti MHC Sınıf iki gibi bir primer antikorun, ardından 10 nanometre altın işaretli sekonder antikorların kullanılması önerilir.Eksozomlar mevcut akış sitometrisi cihazlarıyla tespit edilemeyecek kadar küçük olduğundan, öncelikle eksozomların antikor kaplı boncuklara bağlanması gerekir. Eksozomların hücresel kökenine bağlı olarak, manyetik veya lateks boncuklara farklı antikorlar eşlenir. Bu gösterimde, her örnek için anti CD 63 kaplı lateks boncuklar kullanılacaktır.Bozulmamış ekzozomun 30 ila 40 µg ekzozomal proteinine eşdeğer bir hacim kullanın. PBS içerisinde süspande edilen ekzozomları, hafif hareket altında dört °C'de gece boyunca boncuklarla inkübe edin. Ertesi gün, 300 µL 200 mM glisin ekleyerek bloklama yapın ve 30 dakika boyunca inkübe edin.Ekzozom boncuk kompleksini yıkama tamponu ile iki kez yıkayın ve ekzozom boncuk komplekslerini 4 °C'de 50 µL IgG antikoru ile inkübe edin. Ekzozom boncuk komplekslerini iki kez yıkayın, ekzozom boncuk komplekslerine 90 µL yıkama tamponu ve 10 µL seçilen antikoru ekleyin ve karanlıkta 40 dakika boyunca inkübe edin. Hafif hareket altında, ekzozom boncuk komplekslerini iki kez yıkayın, 300 µL yıkama tamponu ekleyin, örnekleri akış sitometrisi tüplerine aktarın ve akış sitometrisi kullanarak veri elde edin.Bu western blot gösterimi, Western blot öncesinde uygun bir protein izolasyonunun önemine ve kullanılan farklı antikorlara odaklanacaktır. Ekzozom peletini tercih edilen protein lizis tamponu içerisinde çözün, ardından ekzozomları daha fazla liz etmek için iyice pipetleyip vorteksle karıştırın, örneği su banyosunda sonikasyona tabi tutun, örneği 13.000 ×g hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Toplam protein miktarını tercih edilen bir yöntemle ölçün ve proteini jele yükleyin.Ardından, ekzozom spesifik markörler bulunmadığı için, proteinleri jel elektroforezi ve elektroblotlama ile ayırıp aktarın ve ekzozomlarda zenginleşmiş proteinlere karşı immunboyama yapmadan önce membranı bloke edip yıkayın. Tüm farklı hücresel kökenli ekzozomlarda zenginleşen proteinler, ekzozom tespiti için yaygın olarak kullanılır. Bunlar arasında tetraspaninler, örneğin CD9, CD63 ve CD81 gibi proteinler yer alır.Ezrin gibi hücre iskeleti ile ilişkili proteinler ve TSG 1 0 1 ile LY gibi çok veziküler biyogenezde görev alan proteinler kullanılırken; endoplazmik retikulumdan gelen kexin ve GRP 78 gibi diğer kompartman veziküllerinde yaygın olarak bulunan kontamine proteinlerin kontrolü için negatif kontrol kullanılır. Planlanan deneylere bağlı olarak farklı RNA izolasyon kitleri kullanılabilir. Bu gösterimde, RNA izolasyonu gerçekleştirilirken kolon tabanlı bir yöntem kullanılacaktır.Nükleik asit ve nükleaz içermeyen pipet uçları kullanmak ve hem tezgahı hem de ekipmanları kontaminanlardan ve RNA'lardan arındırmak önemlidir. Ekzozom peletini 350 µL lizis çözeltisi içinde çözün ve örneği vorteksleyin. 200 µL %95 etanol ekleyin ve vorteks kullanarak karıştırın.Bir kolonu toplama tüpüne yerleştirin, lizis yapılmış eksozomları kolona aktarın ve santrifüjleyin. Kolonun kuru olduğundan emin olmak için 400 µL yıkama çözeltisi ile üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra 14,000 ×g'de iki dakika boyunca santrifüjleyin ve kuru kolonu RNA'sız bir RNase-free tüpe yerleştirin. Ekstre edilen toplam eksozomal RNA'nın tespiti ve analizi için RNA'yı 50 µL elüsyon tamponu ile elüye edin.Eksozomlar mevcut akış sitometrisi yöntemleriyle tespit edilemeyecek kadar küçük olduklarından, bir Agilent 2100 bioanalyzer RNA 6, 000 nano veya RNA 6, 000 kitleri ile kullanılabilir. Analiz edilmeden önce antikor kaplı boncuklara bağlanırlar. Bu eksozom-boncuk kompleksleri kümelenebildiği için bir akış sitometrisi dağılım grafiği; tekli, ikili ve üçlü eksozom-boncuk komplekslerinden oluşan farklı popülasyonlar içerebilir.Burada gösterildiği gibi, ok ile işaretlenen tek eksozom boncuk kompleksleri popülasyonu, daha detaylı analiz edilen popülasyondur. Bir akış sitometrisi histogramı, CD 63 proteini için pozitif olan tek bir eksozom boncuk popülasyonunu göstermektedir. Açık eğri ne kadar sağda olursa, numune CD 63 için o kadar pozitiftir.Ekzozomların küçük boyutları nedeniyle, bunlar yalnızca elektron mikroskobu ile görüntülenebilir. Ekzozomların tipik morfolojik özellikleri arasında, 30 ila 100 nanometre boyutunda, yuvarlak şekilli veziküller yer alır. CD 63 için altın işaretli antikor ile yapılan bir ekzozom immün boyama, ok ile işaretlenmiş Western blot üzerinde gösterilmiştir.Sonuçlar, ekzosomal örnekte endoplazmik retikulum proteini kalneksinin bulunmadığını, ancak ekzosomalarda yaygın olarak zenginleşen bir protein olan tetraspanin CD81'in mevcut olduğunu göstermektedir. Hücresel RNA temel olarak ribozomal RNA içerir; bu durum, söz konusu biyoanalizör analizinde solda görülen 18 s ribozomal RNA alt birimi ve sağda görülen 28 s alt birimine ait iki pik olarak görülmektedir. Öte yandan, ekzosomal RNA'lar, çok az ribozomal RNA içermeleri veya hiç içermemeleri ve haberci RNA ile mikro RNA gibi kısa RNA'lar bakımından zengin olmaları nedeniyle profilleri açısından farklılık gösterirler.Doğru şekilde uygulandığında, izolasyon yaklaşık üç saat içinde gerçekleştirilebilir. Bu yöntemi kullanırken, daha büyük hücrelerin kontaminasyonunu önlemek için filtreleme dışındaki adımlar da dahil olmak üzere tüm basamakların uygulanması önemlidir. Bu tekniğin geliştirilmesinin ardından, eksozomların hem biyokimyasal hem de biyolojik olarak karakterize edilmesi çok daha kolay hale gelmiştir.Ayrıca, farklı sistemlerde ekzozom aracılı hücreler arası iletişim hakkında çok daha fazla bilgi edindik. Bunun yanı sıra bu teknik, ekzozomların farklı hastalıklar için biyobelirteçler olarak geliştirilmesini mümkün kılmıştır. İlginiz için çok teşekkür ederim.

isolation-and-characterization-of-rna-containing-exosomes

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Exosomes istikrarlı microRNA (miRNA'lar) varlığı biyolojik olarak ve terapötik müdahale için bir yol olarak potansiyel programı için, hücreler arası iletişim yeni bir mod olarak büyük ilgi üretti. Burada taşınmaları miRNAs tespit etmek kantitatif PCR tarafından takip edilir ve kan kültür ortamından saflaştırılması exosome göstermektedir.

Kan ve Kültür Medya türetilen Exosomes saflaştırılması ve microRNA Profil

İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) partiküllerinden eksozomları ayırmak için bir gradyan prosedürünü tanımlayan teknikler açıklanmıştır. Bu prosedür, HIV ile enfekte olmuş bireylerden insan plazmasındaki HIV partiküllerinden eksozomları izole etmek için kullanıldı. İzole edilen eksozomlar sitokin / kemokin içeriği açısından analiz edildi.

HIV-1 pozitif Bireylerin Plazma eksozomlann izolasyonu

Safra sıvısı, potansiyel olarak önemli biyobelirteçler içeren hücre dışı veziküller/eksozomlar için değerli bir kaynaktır. Bu protokol, miRNA profillemesi de dahil olmak üzere daha ileri analizler için eksozomları insan safrasından izole etmek için sağlam bir yöntemi temsil eder.

İzolasyon ve profil MicroRNA içeren İnsan Bile dan ekzozomlar

Endogenously kurulan mRNA-protein kompleksleri kurtarılması için bir tandem RNA izolasyon yordam (seyahat) açıklanmıştır. Özellikle, çapraz vivo içindeRNA-protein kompleksleri vardır, poliadenile RNA'ların özleri ile oligo(dT) boncuk etkilenmezsiniz ve belirli mRNA'ların değiştirilmiş RNA antianlamlı oligonucleotides ile yakalanır. MRNA'ların için bağlı proteinler immunoblot analizi ile tespit edilir.

Ökaryotik mRNA-Protein kompleksleri kurtarmak için bir Tandem oligonükleotid tabanlı RNA izolasyon yordamı

Burada, iki hücre dışı vezikül yalıtım protokol, Ultrafiltrasyon Santrifüjü ve ultrasantrifüj ile yoğunluk gradient Santrifüjü ekstraselüler veziküller fare bronchoalveolar lavaj sıvı örneklerinden izole etmek, açıklamak. Fare bronchoalveolar lavaj sıvı her iki yöntem tarafından türetilmiş hücre dışı veziküller sayılabilir ve karakterize.

Üzerinden Ultrafiltrasyon tekniği Santrifüjü kullanarak fare Bronchoalveolar lavaj sıvı ekstrasellüler veziküller yalıtım

Bu iletişim kuralı, hücre kültür ortamından küçük RNA Kütüphane inşaat ve sonraki nesil sıralama ekstraselüler mikroRNA'lar arındırmak gösterilmiştir. Çeşitli kalite kontrol denetim noktaları ne exRNAs gibi düşük giriş örnekleri ile çalışırken olacağını anlamak okuyucuların izin açıklanmıştır.

İzole, sıralama ve insan Mezenkimal Kök hücreleri ekstrasellüler mikroRNA'lar analiz

Bir eksozom ilaç teslim taşıyıcıları yeni nesil olduğunu. Bir eksozom yalıtım protokolü ile yüksek verim ve saflık siRNA teslimat için kurduk. Biz de fluorescently etiketli non-spesifik siRNA exosomes kapsüllenir ve siRNA yüklü exosomes kanser hücreleri hücresel alımını araştırıldı.

SiRNA kanser hücrelerinin teslim için Exosomes hazırlanması

Bu protokol, 1) yetişkin fare gastroknemius kasından primer fibroblastların izolasyonunu ve kültürünü ve ayrıca 2) sükroz yoğunluk gradyanları ile birlikte diferansiyel bir ultrasantrifüj yöntemi kullanılarak eksozomların saflaştırılmasını ve karakterizasyonunu ve ardından western blot analizlerini göstermektedir.

İskelet Kası Fibroblastlarından Eksozomların İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Burada, kollajenaz tip I ile sindirim ve ultrasantrifüjlemenin bir kombinasyonunu kullanarak fare dalağından türetilmiş eksozomları izole etmek için bir protokol sunuyoruz.

Fare Dalak Dokularından Elde Edilen Eksozomların İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Bu çalışma kromozomal düzeyde bir RNA / DNA hibrid formu ve maya hücreleri genomik DNA, RNA genetik bilginin transferi ortaya nasıl gösterir.

RNA içeren Oligonükleotidler kullanarak Dönüşüm Genomik DNA, RNA / DNA Hibritlerin Üretimi

Öğrenin RNA içeren eksozomların izolasyonu ve karakterizasyonu için ultrasantrifügasyon, elektron mikroskobisi ve akış sitometrisi yöntemlerini. Bu teknikler hücre biyolojisi ve nöroloji araştırmalarında eksozom fonksiyonlarını incelemeye olanak tanır.

RNA İçeren Exosomes İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet