Widefield ve Konfokal Mikroskoplar murin Lenf Düğümü Dilimleri T Hücre ex vivo Görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, lenf nodu dilimlerindeki floresan T hücrelerini geniş alan ve konfokal mikroskopi ile görüntülemektir. Bu, ilk olarak bir fare lenf düğümünün çıkarılması ve düşük erime noktalı aeroya yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Düğüm daha sonra bir vibrato ile 320 mikron kalınlığında bölümler halinde kesilir.

Daha sonra floresanla boyanmış T hücreleri bir lenf nodu diliminin üzerine kaplanır. Son olarak, dilime sızan T hücresi, geniş alan ve konfokal mikroskopi ile görüntülenir. Sonuçta, T hücrelerinin lenf noduna nasıl alındığını ve lenf dokusu içinde ne tür hareketli davranışlar sergilediklerini gösteren hareketsiz ve videografik görüntüler elde edilebilir. Tamam.

İki fotomikroskopi ve sağlam organlar gibi mevcut bir metalin bu tekniklerinin ana avantajı, burada T hücrelerinin geleneksel bir beyaz alan mikroskobu ile üç boyutlu bir sistemde görselleştirilebilmesidir. Ve dahası, hafif hazırlıklar, izinler ve doku sorununa erişim % 4 düşük erime noktası hazırlayarak başlayın. Arose çözeltisi, aarise'ın PBS'de seyreltilmesi ve arose tamamen çözüldükten sonra elde edilen karışımın mikrodalgada pişirilmesiyle elde edilir.

Kullanana kadar çözeltiyi 37 santigrat derecede tutun. Ardından, plastik bir tabağı RPMI ile doldurun. Kültür ortamını tamamlayın ve iç çapları dört milimetre olan paslanmaz çelik rondelaları tabağa yerleştirin.

Başka bir tabağı buz gibi soğuk PBS ile doldurun ve ardından yaklaşık 1,1 mililitre RPMI ekleyin. Altı oyuklu bir doku kültürü plakasında oyuk başına komple kültür ortamı. Altı kuyucuklu plakanın her bir oyuğuna organotipik bir filtre yerleştirin ve plakayı dört santigrat derece yerleştirin.

Ötenazi uygulanmış bir farede periferik lenf düğümlerini çevre dokularından dikkatlice çıkarın. Lenf düğümlerini çok yumuşak oldukları için dikkatlice inceleyin. Dokudaki tüm yağın atılması çok önemlidir çünkü hücreler için çok toksiktir.

Lenf düğümlerini buz kömürü PBS içeren plastik tabağa yerleştirin. Şimdi% 4 aro jeli 35 milimetrelik plastik bir kaba dökün ve düğümleri nazikçe jelin içine aktarın. Daha sonra, aro sertleştikten sonra sertleşmesi için aro'yu beş dakika boyunca buzun üzerine koyun, bloğu tabaktan çıkarın ve agarı kesin, her lenf düğümünün etrafında yaklaşık üç ila beş milimetre jel bırakın.

Ardından, gömülü düğümleri bir viome'un numune diskine yapıştırmak için toksik olmayan yapıştırıcı kullanın. Numune diskini çıkarılabilir tepsiye yerleştirin ve tepsiyi buz gibi PBS ile doldurun. Viome hızını yavaş bir aralıkta ve titreşim frekansını orta aralıkta bir bölümde, agar gömülü dokuyu 320 mikron kalınlığında ayarlayın.

Sadece yüzeysel doku içerdiğinden ilk dilimi atın ve ardından lenf nodu dilimlerini organotipik kültür eklerine kesilirken dikkatlice aktarmak için ince forseps kullanın. Paslanmaz çelik rondelaları her bir dilimin üzerine yerleştirin, rondelaların agro üzerinde olduğundan, lenf nodu dokusunu kaplamadığından emin olun. Daha sonra kültür plakasını lenf nodu dilimleri ile 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin.

Bu adım için T hücrelerini hazırlarken, Matthew ve Callaghan tarafından daha önce yayınlanan JoVE makalesinde gösterildiği gibi MIL 10 max saflaştırma kullanılarak CD dört pozitif boncuk seçimi ile izole edilen gece kültürü IL yedi takviyeli T hücresi kullanın. TCELL'i HBSS'de 20 santigrat derecede 300 kez yerçekiminde beş dakika yıkayın. Bunları taze HBSS'de 10 çarpı 10 ila mililitre başına altı hücreye yeniden süspanse edin.

Daha sonra bir HBSS tüpüne bir mikromolar hücre izleyici yeşil C-M-F-D-A ekleyin ve bu çözeltiyi hücre çözeltisi ile 0.5'lik bir nihai boya konsantrasyonuna kadar birleştirin. Mikromolar, hücre süspansiyonunu 37 santigrat derecede beş dakika inkübe eder. Daha sonra, hücreleri 300 kez G ve 20 santigrat derecede beş dakika boyunca tam RPMI ortamı ile iki kez yıkadıktan sonra, Reeses etiketli T hücrelerini mililitre başına altı hücreye 10 kez 10 katı bir nihai konsantrasyon olarak büker.

Taze RPMI'de, tam kültür ortamında, lenf nodu dilimlerini inkübatörden alın. Yıkayıcının ortasında bulunan fazla ortamı, dokuya dokunmadan bir pipetle çıkarın. Pipetin ucuyla, 10 ila 20 mikrolitre etiketli T hücresini yıkayıcının ortasına nazikçe dağıtın.

Hücre süspansiyonu damlasının yerinde kaldığından emin olun. Lenfositlerin dokuya göç etmesine izin vermek için dilimleri ve T hücrelerini en az 30 dakika inkübe edin. Görüntülemeye başlamak için, mikroskop üzerindeki sıcaklık kontrol odasını 37 santigrat dereceye ayarlayın.

Lenf nodu diliminin oksijenli fenol kırmızısı içermeyen RPMI ortamı dolgusu ile sürekli perfüzyonunu sağlamak için bir füzyon sistemi doldurun ve bu sırada oksijenli RPMI ile küçük bir plastik tabağı ısıtın. Burada gösterilen sistemde, perfüze edilmiş ortam, yerçekimi ile bir taraftan görüntüleme odasına girer. Ortam, bir atık toplamaya bağlı bir pompa ile aspire edilir.

Şişe, T hücresi infiltre edilmiş lenf nodu dilimlerini ince forseps ile inkübatörden alın. Ince. Altı oyuklu plakadan bir lenf nodu dilimi çıkarın. Dokuya sızmamış floresan hücreleri yıkamak için dilimi birkaç saniye ısıtılmış oksijenli RPMI ortamına batırın.

Ardından yeni yıkanmış dilimi görüntüleme haznesine baş aşağı yerleştirin. Naylon iplikler dilimi camdan kaldırır ve oksijenli çözeltinin dokuya yayılmasını sağlar. Lenf düğümlerinde T hücresi göçü güçlü bir şekilde oksijene bağlı olduğu için bu gereklidir.

Ardından, geniş bir görüş alanı yakalamak için üzerine paslanmaz çelik bir rondela yerleştirerek dilimi sabitleyin. 10 kez kuru objektif lensi kullanarak görüntüleri toplayın. Yeni yıkanmış lenf bezi dilimini yüzü yukarı bakacak şekilde plastik bir kaba aktarın.

Hareketsiz hale getirmek için preparatın üzerine bir yıkayıcı yerleştirin. Dilimler artık görüntülenmeye hazırdır. Preparasyonu dik konfokal mikroskobun sahnesine kurun ve 20 kez objektif ile odaklanın.

Ardından bir görüntüleme oturumu başlatın ve alımı başlatın. C-M-F-D-A. Yeşil renkle işaretlenmiş T hücreleri, burada görüldüğü gibi görüntü alımından 30 dakika önce bir lenf nodu dilimine eklendi. Görüntü, burada bir geniş alan mikroskobu ile yakalanan Z yönünde 50 mikron genişliğindeki beş görüntünün maksimum izdüşümüdür.

Aynı figür bu videoda parlak bir alan görüntüsü olarak görülebilir. Bir lenf nodu dilimine sızmış yeşil floresan T hücreleri, dokuz dakika boyunca geniş alan mikroskobu ile görüntülenir. Animasyon, 50 mikronluk bir Z projeksiyonunu temsil eder.

Dilim içindeki T hücrelerinin etkin geçişine dikkat edin. Aynı mikroskop alanından tek tek T hücrelerinin yörüngeleri, mavi düşük hareketli hücrelerden kırmızı yüksek hareketli hücrelere artan yer değiştirmelerini temsil etmek için burada renk kodlu yollar olarak görüntülenir. İzler bir Mars kullanılarak hesaplandı.

Beyaz çizgi düğümün kenarını gösterirken, kesikli ovaller varsayılan B hücre bölgelerini tanımlar. Burada lenf nodu kesitine eklenen T hücreleri konfokal mikroskop ile 10 dakika süreyle görüntülendi. Animasyon, 50 mikronluk bir Z projeksiyonunu temsil eder.

Evet, bu teknik diğer doku türlerine de uyarlanabilir. Ve ilginç olan şu ki, dilim olarak insan tümörlerinde T hücresi göçü ve lokalizasyonunun altında yatan mekanizmaları keşfetmenin tek yolu budur. Mesela.