Name: Widefield ve Konfokal Mikroskoplar murin Lenf Düğümü Dilimleri T Hücre ex vivo Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Öğrenin, geniş alan ve konfokal mikroskopi kullanarak murin lenf düğümü dilimlerinde floresan T hücrelerini canlı görüntüleme yöntemini. Bu teknik, T hücre göçü ve hareketliliğini gerçek zamanlı analiz etmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, bize lenf nodu dilim gerçekleştirmek için teşvik Dr. Alain Trautmann&#39;ın teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Ligue Nationale Contre le Kanser, Fondation pour la Recherche medicale en France ve Ortaklık pour la recherche sur le Kanser hibe kısmen desteklenmiştir.

1. Lenf düğümleri hazırlanması dilimleri <ol><li> Gömmek için% 4, düşük erime noktası agaroz çözüm hazırlayın. PBS ve mikrodalga bu çözüm agaroz sulandırınız. Agaroz tamamen çözülür, çözüm ° C hazır olana kadar kullanılmak üzere 37 korur. </li><li> 6-iyi doku kültürü tabak hazırlayın. 1.1 ml RPMI tam bir kültür ortamı iyi ortalama ekleyin ve her iyi bir Organotipik filtre takın. 6-plaka, 4 ° C dilim aktarmak için hazır olana kadar yerleştirin. </li><li> RPMI tam orta ile dolu plastik bir tabak içine iç çapı 4 mm, paslanmaz çelik pullar yerleştirin. Yıkayıcılar vibratome kesilmiş dilim hücreler daha fazla konsantre olacaktır. </li><li> Kurban, yerel hayvan refahı kurallarına uygun fare. Periferik lenf düğümleri çevreleyen doku dikkatlice çıkarın ve buz gibi soğuk PBS içeren bir plastik tabak koyun. Bu organların çok yumuşak Bakımı, lenf nodu yapısı zarar vermemek için alınmalıdır. </li><li> % 4-agaroz jel 35 mm plastik tabak içine dökün ve ince jel düğümleri aktarmak. Agaroz jel, 5 dakika sertleşmesine buz üzerinde bırakın. </li><li> Blok çanak çıkarın ve her bir lenf nodu etrafında 3-5 mm jel bırakmak için agar düzeltin. </li><li> Toksik olmayan doku yapıştırıcısı ile vibratome numune disk üzerinde gömülü düğümleri takın. Buz gibi soğuk PBS ile dolu tepsi numune diski takın. </li><li> Bölümde agar-gömülü yavaş bir dizi orta menzilli (1,5 mm) ayarlanmış vibratome hızı (0.3 mm / s) ve titreşim frekansı ile 320 mikron kalınlığında doku. </li><li> Dikkatlice lenf nodu dilimleri, ince forseps kullanarak Organotipik kültür ekler üzerine kesilmiş olarak aktarın. Her ekleme 3 dilimleri yerleştirin. Dilim kolayca zarar görebilir gibi büyük bir özen kullanın. 320 mikron kesildiğinde tipik bir periferik lenf nodu 5 bölümden verecektir. Onlar sadece yüzeysel doku içeren, ilk ve son dilim atın. </li><li> Her bir dilim paslanmaz çelik pullar yerleştirin. Pullar doku çevresindeki agaroz konumlandırılmış emin olun. </li><li> Inkübe kültür plaka 37 ° C,% 5 CO 2 nemlendirilmiş inkübatör plaka T hücreleri için hazır olana kadar . </li></ol> 2. T hücreleri fare lenf düğümleri Yalıtımlı <ol><li> Daha önce yayınlanmış vallahi Madde 3 göre T hücreleri izole edin. </li><li> T hücreleri hemen kullanın ve bir sonraki bölüme geçin. Aksi takdirde, lenfositler, 10 ng / ml, IL-7 ile desteklenmiş tam RPMI orta gecede kültüre olabilir. </li></ol> 3. Izole T hücreleri Etiketleme <ol><li> HBSS hücrelerin yıkayın. Ml'de 10 x 10 6 aynı tampon onları tekrar </li><li> 0.5 mcM bir final konsantrasyon veren 1 mcM Hücre Tracker yeşil CMFDA içeren HBSS aynı hacimde ekleyin. </li><li> 5 dakika boyunca 37 ° C hücre süspansiyonu inkübe edin. RPMI-orta hücreler iki kez yıkayın. </li><li> RPMI-orta ml başına 10 x 10 6 son bir konsantrasyonda süspanse edin hücreleri. Bu etiketli hücreleri dilimleri üzerine kaplama olacak. </li></ol> CMFDA dışında floresan boyalar da kullanılır, ancak bu moleküllerin belirli konsantrasyonların üzerinde potansiyel olarak toksik olduğunu akılda tutmak olabilir. 4. Lenf nodu dilimleri üzerine Kaplama etiketli T hücreleri <ol><li> Bir pipet yardımıyla yıkama iç kısmında bulunan fazla orta çıkarın. Doku kuru hale izin vermeyin, bu adımı sırasında hızlı bir şekilde çalışma. </li><li> Yıkayıcı iç kısmında 1 2 x 10 5 hücre karşılık 10 20 ul etiketli T hücreleri hafifçe dağıtmak. Bakım pipet ucu ile doku dokunmamaya dikkat edilmelidir. Hücre süspansiyonu açılan yerde kalır emin olun. </li><li> 37 inkübatörde hücreleri ile dilimleri yerleştirin ° C ve% 5 CO 2 lenfositlerin dokuya göç etmelerine izin verilmesi için en az 30 dk. </li></ol> 5. T hücrelerinin lenf nodu dilimleri içinde Görüntüleme Bu video-makale, görüntü floresan T hücreleri widefield ters bir mikroskop ve konfokal dik bir mikroskop ile lenf nodu dilim. <ol><li> 37 ° sıcaklığı ayarlayın ° C Bizim mikroskoplar ısı kontrollü odaları ile donatılmıştır. </li><li> Oksijenli (% 5 CO 2,% 95 O 2) fenol red-free RPMI medyum ile lenf nodu dilim sürekli perfüzyon sağlayan bir perfüzyon sistemi kurun. Bizim sistemde, perfüze medya yerçekimi ile bir taraftan görüntüleme odasına girer. Orta bir atık toplama balonuna bağlı bir pompa ile aspire edilir. Medya akış hızı 1 ml / dk olarak ayarlayın. </li><li> Ince forseps ile 6-plaka, incelikle dilim almak ve doku içine sızmış floresan hücrelerinin kurtulmak için birkaç saniye boyunca ısınmış oksijenli RPMI orta hazırlık daldırma. </li></ol> ImaT hücreleri geniş bir alan inverted mikroskop ile ging <ol start="4"><li> Dilim bir bardak çanak alt iç kısmına yapıştırılmış naylon konuları oluşan bir ölçüye göre görüntüleme odasının baş aşağı yerleştirin. Bu odada, cam, naylon konuları dilim yükseltmek ve doku içine diffüz oksijenli çözüm sağlar. Lenf düğümleri T hücre göçü oksijen kuvvetle bağlı olarak bu gereklidir. Bunun üzerine bir paslanmaz çelik yıkayıcı ekleyerek dilim sabitleyin. Bu koşullarda, dilim perfüzyon çözüm yenileme kolaylaştırır çanak alt yukarıdaki birkaç mikron yatıyor. </li><li> Geniş bir görüş alanı (800 x 800 mm, düğümün dilim yüzeyinin yaklaşık üçte biri) yakalamak için, 10x kuru objektif lens kullanarak görüntü toplamak. Biz 10x Nikon S Florlu 0.5 NA analizler için en uygun olduğu bulundu. </li></ol> Tipik bir zaman atlamalı görüntüleme deney toplam derinliği 50 mm aksiyel (z) boyutta kapsayan 5 optik uçakları yakalar. Floresan T hücreleri genellikle 10 ila 20 dakika boyunca 10 ila 30 saniye arasında değişen aralıklarla görüntülenmiş. Görüntüleme konfokal dik bir mikroskop ile T hücreleri Bu protokolde kullanılan konfokal mikroskop 20x suya daldırma amacı (Olympus, 20x/0.95 NA) ile donatılmış bir Leica SP5. <ol start="6"><li> Mikroskop görüntüleme aşamasında dilim sabitleyin. Not: Biz genellikle hareketsiz hazırlık bir pul. </li><li> Z ekseni boyunca bir dizi görüntüleri toplayarak bir görüntüleme oturumu ayarlayın. Görüntü T hücreleri sağlam bir doku yapısı için, başlama pozisyonu genellikle ilk etiketli T hücre altında 5 ila 10 mikron olarak belirlenmiştir. </li></ol> 6. Temsilcisi sonuçları Bu video protokol takip ederek, çok sayıda floresan T hücrelerinin düğümün T bölgesi, normalde in vivo (Şekil 1) bu özel ortamda meydana gelen bir fenomen biriken görselleştirmek için beklemeliyiz . Özellikle, T hücreleri sadece kapsül altında genellikle B hücre bölgeleri, ekarte edilmelidir. Başarılı bir deney de sağlam lenf düğümleri 4 elde yayınlanan sonuçlar ile tutarlı bir (Şekil 3) son derece hareketli bir davranış gösteren, T hücrelerinin doku (Şekil 2) işe neden olacaktır. Dilimleri içinde bireysel T hücrelerinin ortalama hız, ortalama olarak, yaklaşık 10 mm / dak (Şekil 4) olmalıdır. <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. T hücrelerinin lenf nodu dilim birikir. Floresan etiketli T hücreleri (CMFDA yeşil) görüntü elde etme önce bir lenf düğümü dilim 30 dakika (üst resim) ilave edildi. Z yönünde 50 mikron kapsayan 5 görüntülerin maksimum projeksiyon görüntü. Parlak bir alan görüntü, alt gösterilmiştir. Görüntüler bir widefield mikroskop ile ele geçirildi. <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. T hücrelerinin lenf nodu dilim içine alınırlar. Floresan etiketli T hücreleri (CMFDA yeşil) konfokal mikroskop kullanarak görüntü elde etme önce bir lenf düğümü dilim 30 dakika ilave edildi. Görüntüler Kesilen yüzey (üst resim) ve 40 mm (alt resim) ele geçirildi. <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. T hücrelerinin lenf nodu dilim içinde son derece hareketli. Floresan etiketli T hücreleri 12 dakika içinde bir widefield mikroskop kullanılarak görüntülenmiştir. Bireysel T hücrelerinin Yörüngeler mavi (düşük hareketli hücreler), kırmızı (yüksek hareketli hücreler) artan deplasmanları temsil etmek için renk kodlu parça olarak görüntülenir. Parçalar Imaris yazılımı kullanılarak hesaplandı. Kesik oval varsayılan B hücresi bölgesi sınırlar ise, beyaz bir çizgi, düğümün kenarına izler. <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 lenf nodu dilim içinde, T hücre hızı 10 mm / dak yakındır. Hızları Şekil 3'te temsil parça Imaris yazılımı kullanılarak hesaplandı.

<ol><li>Asperti-Boursin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR7+ligands+control+basal+T+cell+motility+within+lymph+node+slices+in+a+phosphoinositide+3-kinase-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase-independent manner.</a> J Exp Med. 204, 1167-1167 (2007).</li>
<li>Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+oscillations+regulate+thymocyte+motility+during+positive+selection+in+the+three-dimensional+thymic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment.</a> Nat Immunol. 6, 143-143 (2005).</li>
<li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+CD4%2B+T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1869 (2002).</li>
<li>Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+contribution+of+chemotaxis+and+substrate+restriction+to+segregation+of+immature+and+mature+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes.</a> Immunity. 31, 986-986 (2009).</li>
<li>Gollmer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL21+mediates+CD4%2B+T-cell+costimulation+via+a+DOCK2%2FRac-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CCL21 mediates CD4+ T-cell costimulation via a DOCK2/Rac-dependent pathway.</a> Blood. 114, 580-580 (2009).</li>
</ol>

Biz tanıtıldı T hücrelerinin davranışı araştırmak için kullanılır lenf nodu dilimleri, üretmek için basit, hızlı ve sağlam bir teknik tanımlanmıştır. Son yıllarda, bu yöntem başarılı bir şekilde kontrol eden T hücre konumlandırma ve motilite 1,5 ekstrasellüler faktörleri belirlemek için timus ve lenf nodu dilimleri kullanarak tatbik edilmiştir. Aynı zamanda pozitif seçim sırasında ve sonra T hücrelerinin antijen tanıma 2,6 timositleri Ca 2 + tepkileri ölçmek için kullanılır olmuştur. Bindirme dilim tahlil avantajları ve sınırlamalar ele alınacak hak sunar. Notu, bu sistemin moleküler hücre göç kontrolü ile müdahale edebilmek için bir ihtiyacı farmakolojik dilimleri işlemek için faydalı, doku erişim izni verir. Görüntülemeye sonra dilimleri görüntülü edilmiş yapılar hakkında daha fazla bilgi toplamak için immünohistokimya için işlenmiş olabilir. Ayrıca, gözlem, geleneksel bir widefield floresan mikroskobu ile yapılabilir. Çözünürlük konfokal veya iki foton bir mikroskop gibi iyi değil ve bu fototoksisite prensip olarak iki foton mikroskobu ile daha tek foton ile daha şiddetli olmasına rağmen, bu basitlik avantajlarını, daha düşük bir maliyetle ve daha büyük bir seçim var eksitasyon dalga boylarında. T hücreleri sağlam bir lenf nodu görüntüleme etiketli lenfositlerin intravenöz enjeksiyon gerektirir lenfoid organlara daha sonra ev. Biz daha önce 1 gösterdiği gibi, dilim tahlil, evlat edinen transferi deney ile mükemmel uyumlu . Ancak, T hücreleri lenf düğümleri içine ev için gerekli sürenin uzunluğu zamanla hücrelerin dışarı akması için bir eğilim var floresan boyaların kullanımı karmaşık hale getirebilir. Bu durumda Ca 2 + boya Fura-2. T hücrelerinin doku içine hızlı işe (&lt;30 dk), dilim testi bu tür boyalar kullanmak için bir fırsat sağlar. Son olarak, bu yöntem, birçok insan dokularında T hücre fonksiyonlarını analiz için büyük bir avantaj yaşatılıyor. Bu deneysel sistemi de göz önünde bulundurulması gereken kısıtlamalar sunar. Dilimleme ile ilişkili hasarlar, özellikle kesme yüzeyine yakın doku yüzeysel bir bölgede, T hücre işleyişini etkileyebilir. Dilim içinde hücre ölümünü değerlendirmek amacıyla, floresan boya SYTOX yeşil tehlikeye plazma zarı ile hücre nüfuz kullanmıştır. Deneyler, çoğunlukla yüzeysel doku bölgede lokalize toplam düğüm hücreleri, yaklaşık% 20 bu nükleer boya ile floresan etiketli olduğunu ortaya koymaktadır. Testi ile diğer potansiyel endişe kemokinler de dahil olmak üzere önemli çözünür faktörler korumak için dilim yeteneğidir. T hücreleri dilim içinde iyi bir motilite ekran yılından beri bu tür sorunlar etkilendiğini herhangi bir gösterge olsa da, biz görüntüleme T hücrelerinin sağlıklı bölgelerde kesim yüzeyi mikron onlarca bulunan önemini vurgulamak istiyorum. Bu protokolde gibi geleneksel mikroskoplar (widefield veya konfokal) ile yapılabilir Oysa, bu iki foton görüntüleme derinlemesine uzaysal çözünürlüğü artırmak ve fototoksisite azaltacaktır ile birlikte lenf nodu dilim hazırlık muhtemeldir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> Konfokal mikroskop </td><td> Leica </td><td> SP5 </td><td></td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> Leica </td><td> VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> Güzel Forseps </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> 14142 </td><td></td></tr><tr><td> 30 mm Kültür ekler </td><td> Millipore </td><td> PICM0RG50 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Invitrogen </td><td> 61870010 </td><td> Komple RPMI-orta,% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu ve penisilin / streptomisin ekleyerek yapılır </td></tr><tr><td> Hanks &#39;Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14170088 </td><td></td></tr><tr><td> Düşük jelleşme sıcaklığı Agaroz, tip VII-A </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0701 </td><td></td></tr><tr><td> Butil Siyanoakrilat Tutkal, Vetbond </td><td> 3M </td><td> 1469 </td><td></td></tr><tr><td> Paslanmaz çelik pullar, iç çapı 4 mm </td><td> Yapı marketi </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hücre Tracker yeşil CMFDA </td><td> Invitrogen </td><td> C7025 </td><td></td></tr></tbody></table>

widefield ve konfokal mikroskoplar murin lenf düğümü dilimleri t hücre ex vivo görüntüleme

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Nadir ifade antijenleri tespit etmek için periferik lenf düğümleri de dahil olmak üzere ikincil lenfoid organlara, naif T hücrelerinin sürekli trafik. T hücrelerinin lenf düğümleri içine göç kemokinler de dahil olmak üzere hem hücresel ve kimyasal faktörleri içeren karmaşık bir süreç. Son zamanlarda, iki foton mikroskopi sağlam lenf düğümleri T hücreleri izlemek için kendi davranış ve etkileşimleri ve diğer hücreleri ile bazı sayısal bilgiler elde etmek için izin verdi. In vivo sistemde bir açık avantajları olmakla birlikte, bu yaklaşım, karmaşık ve pahalı aletlerle gerektirir ve doku sınırlı erişim sağlar. Fare lenf düğümleri içinde T hücrelerinin davranışını analiz etmek, bir dilim testi 1, başlangıçta neurobiologists tarafından kurulan ve son zamanlarda fare timus 2 aktarılmamıştır geliştirdik. Bu teknikte, floresan etiketli T hücreleri, akut hazırlanan bir lenf nodu dilim üst kaplamadır. Bu video-makale, T hücrelerinin doku içine yerelleştirme ve göç widefield ve konfokal mikroskop ile gerçek zamanlı olarak analiz edilmektedir. In vivo olarak iki foton mikroskopi doğal ortamda görüntü T hücreleri etkili bir yaklaşım sunuyor ve T hücre göçün altında yatan mekanizmaları aydınlatmak için tamamlar tekniği.

Bu protokol, lenf nodu dilimler halinde sunulan görüntü floresan T hücreleri için bir yöntem açıklanır. Bu teknik, geleneksel widefield floresan veya konfokal mikroskoplar ile T hücre göç gerçek zamanlı analiz izin verir.

Widefield ve Konfokal Mikroskoplar murin Lenf Düğümü Dilimleri T Hücre ex vivo Görüntüleme

Naif T hücreleri, nadir eksprese edilen antijenleri tespit etmek için periferik lenf düğümleri dahil olmak üzere sekonder lenfoid organlara sürekli olarak göç ederler. Migrasyon...

Bu prosedürün genel amacı, geniş alan ve konfokal mikroskopi kullanarak lenf nodu kesitlerindeki floresan T hücrelerini görüntülemektir. Bu işlem, öncelikle bir fare lenf nodunun çıkarılması ve düşük erime noktalı agar içine gömülmesiyle gerçekleştirilir. Ardından nod, bir vibratom kullanılarak 320 mikron kalınlığında kesitlere ayrılır.Ardından, floresan boyalı T hücreleri bir lenf düğümü kesitinin üzerine ekilir. Son olarak, kesite sızmış olan T hücreleri, geniş alan ve konfokal mikroskopi ile görüntülenir. Nihayetinde, T hücrelerinin lenf düğümüne nasıl çekildiğini ve lenf dokusu içinde ne tür bir hareketli davranış sergilediklerini gösteren durağan ve videografik görüntüler elde edilebilir.İki fotomikroskopi ve sağlam organlar gibi mevcut metal yöntemlerinin temel avantajı, T hücrelerinin geleneksel bir alan aydınlatmalı mikroskop ile üç boyutlu bir sistemde görselleştirilebilmesidir. Ayrıca, hafif preparatlar dokuya erişim ve giriş imkanı sağlar. PBS ile seyrelterek ve agarose tamamen çözündükten sonra ortaya çıkan karışımı mikrodalga fırında ısıtarak %4'lük düşük erime noktalı bir agarose çözeltisi hazırlayarak başlayın.Çözeltiyi kullanıma kadar 37 °C'de muhafaza edin. Ardından, plastik bir kabı RPMI Tam Kültür Besiyeri ile doldurun ve iç çapı 4 mm olan paslanmaz çelik pulları kabın içine yerleştirin.Başka bir kaba buz soğukluğunda PBS doldurun ve ardından yaklaşık 1,1 mililitre RPMI ekleyin. Altı kuyucuklu bir doku kültürü plağındaki her kuyucuk için kültür ortamını tamamlayın. Altı kuyucuklu plağın her bir kuyucuğuna bir organotipik filtre yerleştirin ve plağı dört derece santigrat sıcaklıktaki ortama koyun.Ötenazi uygulanmış bir fareden periferik lenf düğümlerini çevre dokulardan dikkatlice ayırın. Lenf düğümleri çok yumuşak olduğu için disseksiyon işlemini dikkatli bir şekilde gerçekleştirin. Yağ dokusu hücreler için çok toksik olduğundan, dokudaki tüm yağların temizlenmesi çok önemlidir.Lenf nodlarını, buzlu PBS içeren plastik kaba yerleştirin. Ardından, %4'lük agar jelini 35 mm'lik bir plastik kaba dökün ve nodları nazikçe jelin içine aktarın. Daha sonra, agarın sertleşmesi için jeli beş dakika boyunca buz üzerinde bekletin; agar sertleştikten sonra bloğu kaptan çıkarın ve her bir lenf nodunun etrafında yaklaşık 3 ila 5 mm jel kalacak şekilde agarı kesin.Ardından, gömülü düğümleri bir viome örneği diskine yapıştırmak için toksik olmayan yapıştırıcı kullanın. Örnek diskini viome çıkarılabilir tepsisine yerleştirin ve tepsiyi buz gibi soğuk PBS ile doldurun. Viome hızını düşük aralığa, vibrasyon frekansını ise orta aralığa ayarlayarak agarda gömülü dokuyu 320 micron kalınlığında kesin.Sadece yüzeysel doku içerdiği için ilk dilimi atın ve ardından ince pensler kullanarak, kesilmekte olan lenf düğümü dilimlerini dikkatlice organotipik kültür insertlerine aktarın. Paslanmaz çelik pulları, lenf düğümü dokusunu kapatmadığından ancak etrafını çevrelediğinden emin olarak her bir bireysel dilimin üzerine yerleştirin. Daha sonra, lenf düğümü dilimlerini içeren kültür plağını 37 °C'de, %5 karbondioksitli nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin.Bu adım için T hücrelerini hazırlarken, Matthew ve Callaghan tarafından daha önce yayınlanan JoVE makalesinde gösterildiği üzere MIL 10 max saflaştırma kullanılarak CD four pozitif boncuk seçimi ile izole edilmiş, gece boyu kültüre edilmiş IL seven takviyeli T hücrelerini kullanın. T hücrelerini 20 °C'de 300 ×g'de beş dakika boyunca HBSS ile yıkayın. Bunları taze HBSS içerisinde 10 × 10⁶ hücre/mL konsantrasyonunda yeniden süspanse edin.Ardından, bir tüp HBSS içerisine bir µM cell tracker green C-M-F-D-A ekleyin ve bu çözeltiyi, nihai boya konsantrasyonu 0,5 µM olacak şekilde hücre çözeltisiyle birleştirin. Hücre süspansiyonunu 37 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra hücreleri, complete RPMI besiyeri ile 20 °C'de 300 ×g'de beş dakika boyunca iki kez yıkadıktan sonra, işaretlenmiş T-hücrelerini nihai konsantrasyonu 10 × 10⁶ hücre/mL olacak şekilde resüspande edin.Taze RPMI, tam kültür ortamında, lenf nodu dilimlerini inkübatörden çıkarın. Yıkama düzeneğinin merkezinde bulunan fazla ortamı, dokuya dokunmadan bir pipet yardımıyla uzaklaştırın. Pipet ucuyla, 10 ila 20 µL etiketlenmiş T-hücresini yıkama düzeneğinin merkezine nazikçe dağıtın.Hücre süspansiyon damlasının yerinde kaldığından emin olun. Lenfositlerin dokuya göç etmesine izin vermek için dilimleri ve T-hücrelerini en az 30 dakika inkübe edin. Görüntülemeye başlamak için mikroskoptaki sıcaklık kontrol odasını 37 °C'ye ayarlayın.Lenf nodu kesitinin sürekli perfüzyonunu sağlamak için bir füzyon sistemini oksijenle zenginleştirilmiş, fenol kırmızısı içermeyen RPMI besiyeri ile doldurun ve aynı zamanda küçük bir plastik kabı da oksijenle zenginleştirilmiş RPMI ile doldurup ısıtın. Burada gösterilen sistemde, perfüze edilen besiyeri yer çekimi yardımıyla bir taraftan görüntüleme odasına girer. Besiyeri, bir atık toplama ünitesine bağlı olan bir pompa ile aspire edilir.Hassas penset kullanarak T hücresi infiltre edilmiş lenf düğümü kesitlerini inkübatörden çıkarın. Altı kuyucuklu plakadan bir lenf düğümü kesitini dikkatlice alın. Dokuyu infiltre etmemiş floresan hücreleri uzaklaştırmak için kesiti birkaç saniye boyunca ısıtılmış ve oksijenle zenginleştirilmiş RPMI besiyerine daldırın.Ardından, yeni yıkanmış kesiti görüntüleme odasına ters şekilde yerleştirin. Naylon iplikler, kesiti camdan yükselterek oksijenli çözeltinin dokuya difüze olmasını sağlar. Lenf düğümlerindeki T-hücresi göçü oksijene güçlü şekilde bağımlı olduğundan bu işlem gereklidir.Ardından, geniş bir görüş alanı elde etmek için kesitin üzerine paslanmaz çelik bir pul yerleştirerek onu sabitleyin. 10x kuru objektif lens kullanarak görüntüler toplayın. Yeni yıkanmış lenf düğümü kesitini, yüzü yukarı bakacak şekilde plastik bir kaba aktarın.Preparatı sabitlemek için üzerine bir rondela yerleştirin. Kesitler artık görüntüleme için hazırdır. Preparatı dik konfigürasyonlu konfokal mikroskobun tablasına yerleştirin ve 20 kat objektif ile odaklayın.Ardından bir görüntüleme oturumu başlatın ve veri toplama işlemini başlatın.C-M-F-D-A. Burada görüldüğü gibi, görüntüleme işleminden 30 dakika önce lenf düğümü kesitine yeşil boyalı T hücreleri eklenmiştir. Görüntü, burada bir geniş alan mikroskobu ile yakalanan ve Z yönünde 50 mikronu kapsayan beş görüntünün maksimum projeksiyonudur.Aynı şekil, bu videoda aydınlık alan görüntüsü olarak görülebilir. Bir lenf nodu dilimine infiltre olmuş yeşil floresan T hücreleri, geniş alanlı bir mikroskop ile dokuz dakika boyunca görüntülenmiştir. Animasyon, 50 mikronluk bir Z projeksiyonunu temsil etmektedir.Kesit içerisindeki T hücrelerinin aktif migrasyonuna dikkat edin. Aynı mikroskop alanındaki tekil T hücrelerinin yörüngeleri, mavi renkli düşük motiliteli hücrelerden kırmızı renkli yüksek motiliteli hücrelere doğru artan yer değiştirmelerini temsil edecek şekilde renk kodlu izler olarak burada gösterilmiştir. İzler, Mars kullanılarak hesaplanmıştır.Beyaz çizgile nodun kenarı belirtilirken, kesikli ovaller muhtemel B hücresi bölgelerini tanımlamaktadır. Burada, bir lenf nodu dilimine eklenen T hücreleri konfokal mikroskop ile 10 dakika boyunca görüntülenmiştir. Animasyon 50 mikronluk bir Z projeksiyonunu temsil etmektedir.Evet, bu teknik diğer doku türlerine de uyarlanabilir. İlginç olan ise, doku dilimlerinin insan tümörlerindeki T hücresi migrasyonu ve lokalizasyonunun altında yatan mekanizmaları araştırmak için tek yol olmasıdır. Örneğin.

ex-vivo-imaging-t-cells-murine-lymph-node-slices-with-widefield

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

İki foton görüntüleme ve bir bağışıklık yanıtı 1 sırasında bazal koşullar altında lenf nodu içinde lenfosit motilite ve hücresel etkileşimleri ortaya çıkardı. Burada, T hücreleri, lenf düğümleri izolasyon ve görüntüleme motilite CD4 + T hücreleri eksplante lenf nodu evlatlık transferi göstermektedir.

Farelerde Periferik lenf nodu diseksiyonu ve 2-Foton Görüntüleme

2-foton mikroskopi son gelişmeler, gerçek zamanlı...

Intravital Görüntüleme Fare Popliteal Lenf Nodu

Bu videoda, insan akciğer tümörü dilimleri içinde floresan olarak bağlanmış antikorlarla işaretlenmiş yerleşik tümöre sızan CD8 T hücrelerinin görüntülenmesi açıklanmaktadır. Bu teknik, konfokal mikroskopi kullanılarak CD8 T hücre göçünün gerçek zamanlı analizlerine izin verir.

Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Farklı Tümör Bölgelerinde Yerleşik T Hücresi Migrasyonunun Gerçek Zamanlı Analizi

Yetişkin farelerin lenf düğümlerinde 120 um derinliğe kadar kontrastlı sahip yüksek-çözünürlüklü intravital görüntüleme uzamsal bir multi-odak iki foton mikroskop uyarım modelini modüle edilmesi ile elde edilir. 100 mikron derinliğinde biz böylece saçılma ve difraksiyon sınırlarını engellemeyi, 487 nm çözünürlük (lateral) ve 551 nm (eksenel) ölçüldü.

Germinal Merkezleri derece Çözülmüş Intravital Çizgili-aydınlatma Mikroskopi

enflamasyon bölgelerinde CD4 efektör T hücrelerinin geçiş motilite yöneten mekanizma nispeten bilinmemektedir. Biz görselleştirmek ve yerinde bu hücrelerin dinamik davranışının çalışması için izin iltihaplı kulak dermiş in vitro -astarlı CD4 T hücrelerinde işlemek için non-invaziv bir yaklaşım sunuyoruz.

Iltihaplı Dermisinde içinde görüntüleme CD4 + T hücre Geçiş Göç

Burada, CD11c.DTR farelerinin intratrakeal difteri toksini tedavisi ile indüklenen, bir aseptik fulminan miyokardit modelinde kardiyak CD45 + lökosit infiltrasyonunu görselleştirmek için bir ışık-tabakalı mikroskopik yaklaşım anlatılmaktadır.

Bir Fulminan Miyokardit Modelinde Işık Yeri Mikroskopisi İle Lökosit İnfiltrasyonunun Nicel Görselleştirilmesi

Bu iletişim kuralı insan akciğer tümörü dilimleri içinde fluorescently eşleşmiş antikorlar ile etiketli görüntü ikamet tümör infiltre CD8 T hücreleri bir yöntem açıklanır. Bu teknik CD8 T hücre göç confocal mikroskobu kullanarak gerçek zamanlı analiz izin verir.

Ex Vivo İnsan akciğer tümörü içinde ikamet CD8 T lenfositlerin görüntüleme Confocal mikroskobu kullanma dilim

Lazer fare gözün ön odasında timik implantlar mikroskobu tarama timositleri boyuna intravital gerçek zamanlı izleme göstermek için protokol hedefidir. Kornea saydamlığını ve vaskülarizasyon greft sürekli progenitör hücre işe alım ve olgun T hücreli çıkış kaydetmek için izin verir.

Gerçek zamanlı timositleri mikroskobu tarama lazer göz ön odasında Vivo içinde Takibi

Bu protokol, organ yapısında değişiklik olmadan lenf düğümlerini boşaltmada farklı hücre popülasyonlarını görüntüleyen bir tekniği tanımlar.

Ex-Vivo Konfokal Mikroskopi ile Lenf Nodal Yapısı nın Ve Hücresel Lokalizasyonun Görselleştirilmesi

Biz GFP etiketli γδ IELS görselleştirmek için bir yöntem açıklamak, ters dönen disk konfoksel mikroskobu tarafından murine ince bağırsak intravital görüntüleme kullanarak. Bu teknik, 4 h 'ye kadar mukoza içindeki canlı hücrelerin takibini sağlar ve çeşitli bağırsak immün-epitelyal etkileşimleri araştırmak için kullanılabilir.

Murine Ince bağırsak INTRAEPİTELYAL lenfosit intravital görüntüleme

Antikor etiketleme, optik temizleme ve gelişmiş ışık mikroskobu kombinasyonu, tam yapıların veya organların üç boyutlu analizini sağlar. Burada açıklanan, kalın böbrek dilimleri immünolabeling birleştirmek için basit bir yöntemdir, etil cinnamate ile optik Temizleme, ve üç boyutlu böbrek yapıların görselleştirme ve kantifikasyon sağlayan konfoköz görüntüleme.

Optik temizleme ve Immünolabeled böbrek dokusu görüntüleme

Öğrenin, geniş alan ve konfokal mikroskopi kullanarak murin lenf düğümü dilimlerinde floresan T hücrelerini canlı görüntüleme yöntemini. Bu teknik, T hücre göçü ve hareketliliğini gerçek zamanlı analiz etmeyi sağlar.

Widefield ve Konfokal Mikroskoplar murin Lenf Düğümü Dilimleri T Hücre ex vivo Görüntüleme

Daha fazla video keşfet