Kolon Dokusu Kesitlerinin İmmünohistokimyasal Analizi ile Kimyasal Kaynaklı Kolitin Değerlendirilmesi

Farelerde, kolon mukozal tabakası, mukozayı koruyan sıkıca paketlenmiş bir epitel ile çevrili lamina propria içeren bağışıklık hücrelerinden oluşur. Dekstran sodyum sülfat ile kimyasal işlem, sıkı bağlantıları bozarak epitel hücre hasarına neden olur ve luminal mikropların lamina propriaya nüfuz etmesini sağlar.

Kolondaki mikrobiyal tanıma, kemokin salgılanmasını tetikleyerek bağışıklık hücrelerinin infiltrasyonuna ve proinflamatuar sitokinlerin salınmasına yol açar. Bu abartılı bağışıklık tepkisi, kolon iltihabı veya kolit ile sonuçlanır.

Kimyasal kaynaklı koliti değerlendirmek için, kimyasal kaynaklı kolit sergileyen sabit, önceden işlenmiş bir fare kolon dokusu bölümünü taşıyan bir cam slaytla başlayın. Bölümü, kendi bağışıklık hücrelerine bağlanan bağışıklık hücrelerinin reseptörlerine özgü bir birincil antikor kokteyli ile tedavi edin.

Bağlanmamış antikorları çıkarmak için yıkayın. Doku bölümünü, spesifik olarak birincil antikorlara bağlanan biyotinile edilmiş ikincil antikorlarla inkübe edin. Biyotinlerle etkileşime giren ve kompleksler oluşturan streptavidin-enzim konjugatları ile inkübe edin.

Doku bölümünü kromojenik bir substrat ile kaplayın; enzim-substrat etkileşimi, bağışıklık hücrelerine kahverengi renklenme verir. Hücre çekirdeklerini lekelemek için bölümü hematoksilen boyası ile boyayın.

Lekeli slaytı mikroskop altında gözlemleyin. Hasarlı bölgedeki kahverengi bağışıklık hücrelerinin bolluğu, kimyasal kaynaklı koliti gösterir.

İmmünohistokimyasal analiz için, bölümleri sıcak plaka üzerinde 20 dakika ısıttıktan sonra, slaytları yıkama başına 10 dakika boyunca PBS'de üç kez yıkayın ve 10 dakikalık% 3 hidrojen peroksit inkübasyonu ile endojen peroksidazı ortadan kaldırın.

İnkübasyonun sonunda, numuneleri gösterildiği gibi PBS'de üç kez yıkayın ve oda sıcaklığında en az bir saat boyunca spesifik olmayan bağlanmaları bloke edici tampon ile bloke edin. Ardından, 4 santigrat derecede bir gece inkübasyon için bloke edici tamponu ilgilenilen birincil antikor kokteyli ile değiştirin.

Ertesi sabah, fazla primer antikor solüsyonunu aspire edin ve slaytları PBS'de üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, slaytları uygun biyotinile edilmiş ikincil antikor kokteyli ile inkübe edin ve ardından oda sıcaklığında streptavidin yaban turpu peroksidaz kompleksi ile etiketleyin.

İmmünoreaktif hücreleri görselleştirmek için, numuneleri açık veya koyu kahverengi bir renk oluşana kadar DAB ile etiketleyin ve bölümleri hematoksilen ve% 0.3 seyreltilmiş amonyak ile boyayın.

Slaytlar kuruduğunda, 10 kat büyütme altında doku bölümlerinin parlak alan görüntülerini elde etmek için bir ışık mikroskobu kullanın ve hem epitel hem de lamina propriadaki işaretli bağışıklık hücrelerinin popülasyonunu tanımlamak ve ölçmek için bir görüntü işleme programı kullanın.