Name: Bağışık yetmezliği olan farelere Biyomühendislik İnsan Mikrovasküler Ağları (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Keşfedin, bağışık yetmezliği olan farelerde insan mikrovasküler ağları oluşturma yöntemini. ECFC ve MSC hücrelerini kollajen/fibronektin jel içinde enjekte ederek damarsal rejenerasyonu inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma kısmen, Ulusal Sağlık Enstitüsü, hibe K99EB009096-01A1 tarafından desteklenen JM-M.

1. Hazırlık <ol><li> EGM-2 orta boy (500 ml) <ul><li> Fetal sığır serumu (FBS) 100 mL, 395 mL (EBM-2) Endotelyal Bazal Orta ekleyin. </li><li> 100x Glutamin-penisilin-streptomisin çözüm (GPS) 5 ml ekleyin. </li><li> Hidrokortizon (yani, VEGF, hFGF-B, R-IGF-1, hEGF, heparin, askorbik asit ve GA-1000) dışında tüm EGM-2 SingleQuots takviyeleri ekleyin. </li><li> Filtre 0.2 mikron gözenek boyutu vakum filtre ile sterilize edilmiş. </li></ul></li><li> MSCGM orta (500 ml) <ul><li> 100x GPS Mezenkimal Kök Hücre Bazal Orta (MSCBM) 440 ml 5 ml ekleyin. </li><li> MSCGM SingleQuots kiti tüm içerik ekleyin. </li><li> EGM-2 SingleQuots takviyeleri hFGF-B kısım ekleyin. </li><li> Filtre 0.2 mikron gözenek boyutu vakum filtre ile sterilize edilmiş. </li></ul></li><li> DMEM orta (500 ml) <ul><li> Fetal sığır serumu (FBS) 50 ml, 440 ml 1x yüksek glukoz Dulbecco'nun Modifiye Kartal Medium (DMEM) ekleyin. </li><li> 100x GPS 5 ml ekleyin. </li><li> Gerekli olmayan amino asit çözeltisi 5 ml ekleyin. </li><li> Filtre 0.2 mikron gözenek boyutu vakum filtre ile sterilize edilmiş. </li></ul></li><li> Kollajen / fibronektin solüsyonu (enjeksiyon yapılan aynı gün 3.6 mL) <ul><li> 10x DMEM 0.4 mL distile H 2 O. 150 mcL ekleyin </li><li> 1M Hepes 100 mcL (son 25 mM) ekleyin. </li><li> Dikkatle, sığır kollajen 2.4 ml (5 mg / ml stok, 3 mg / ml son) ekleyin ve buz üzerinde hafifçe karıştırın. </li><li> (Yaklaşık 30 mcL) 1N NaOH çözeltisi ekleyerek nötr pH ayarlayın. </li><li> Nötr pH değerlendirmek için fenol kırmızı gösterge kullanın; alternatif pH izlemek için pH test kağıdı kullanabilirsiniz. </li><li> (30 mg / ml son 1 mg / ml stok) insan fibronektin 120 mcL ekle </li><li> FBS 0.4 mL (% 10 final) </li><li> kullanana kadar buz üzerinde çözüm tutmak. </li></ul></li><li> Fibrinojen solüsyonu (enjeksiyon yapılan aynı gün 1 ml) <ul><li> Toz fibrinojen 30 mg 1 ml 0.9N NaCl (pH 7.4) solüsyonu (30 mg / ml nihai) ekleyin. </li><li> Kullanmadan önce, 37 fibrinojen solüsyonu inkübe ° C 30 dakika boyunca. </li><li> Önce kollajen / fibronektin jel Ayrıca, vorteks, hafifçe karıştırın. </li></ul></li><li> Trombin solüsyonu (200 ml) <ul><li> % 0.9 NaCl normal tuzlu su (50 U / ml) 200 ml toz trombin 1 KU ekleyin. </li><li> Kullanana kadar -20 ° C'de 0.2 mikron gözenek boyutu şırınga filtresi ve mağaza ile sterilize Filtresi. </li><li> Önce 10 U / ml bir final konsantrasyon% 0.9 NaCl normal tuzlu su ile seyreltilmiş kullanabilirsiniz. </li></ul></li><li> % 1 jelatin solüsyonu (500 ml) <ul><li> Dulbecco'nun fosfat 500 ml için 5 gr toz jelatin ekleyin tamponlu salin (PBS). </li><li> 121 ° C'de 30 dakika için otoklavlı. </li><li> Filtre 0.2 mikron gözenek boyutu vakum filtre ile sterilize edilmiş. </li></ul></li><li> % 1 jelatin kaplama çözümü ile Coat 100 mm doku kültürü plakaları <ul><li> Her 100 mm doku kültürü plakası% 1 jelatin solüsyonu 10 ml ekleyin. </li><li> 37 ° plakaları ° C'de 60 dakika. </li><li> Kullanmadan önce, jelatin çözüm kaldırmak ve plakalar PBS ile bir kez yıkayın. </li></ul></li></ol> 2. İnsan Kablosu Kültür Koloni Şekillendirme Endotel Hücreleri (ECFCs) Kan Türetilmiş Bu protokol ECFC dondurulmuş şişeleri, bu deneyde önce laboratuvarda mevcuttur varsayar. ECFC, göbek kordon kanı veya daha önce 7 açıklandığı gibi yetişkin periferik kan ya mononükleer hücre fraksiyonu izole edilebilir . <ol><li> ECFCs Çözülme bir flakon (genellikle 0.5-1x10 6 hücre dondurma medya 1 ml) sıvı azot depolama tankı alınan ve içeriği, 10 ml DMEM orta içeren bir 15 ml konik tüp hemen sulandırmak . 1200 rpm'de 5 dakika boyunca dönerler. Süpernatantı ve 10 ml sıcak EGM-2 orta boy hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Jelatin kaplı 100 mm doku kültürü plakası% 1, ECFC süspansiyon 10 ml ekleyin. 37 ° C ve% 5 CO 2 nemlendirilmiş bir inkübatör plaka koyun. Ertesi gün hafifçe bağlanmamış hücreleri ve orta aspirat ve taze EGM-2 orta boy 10 ml ile bağlı hücreleri beslemek. </li><li> EGM-2 orta boy ile her 2-3 günde bir plaka besleyin. Hücreleri plaka konfluent hücresel bir tek tabaka ile kaplı olduğu gibi genişletmek için izin ver. Izdiham, aşağıdaki gibi hücreler altkültürü: </li><li> Aspire kültür ortamı ve hücreleri 10 ml PBS ile yıkayın. </li><li> PBS çıkarın ve her biri 100 mm plaka için 2 mL tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin. Tripsin-EDTA çözeltisi eşit dağıtmak için plakalar yavaşça sallayın. 37 ° ° C'de ve% 5 CO 2 3-5 dakika. Süspansiyon müstakil hücreler yavaşça ters bir mikroskop altında görmek için plaka dokunun. </li><li> Hücreler tamamen ayırmak, 8 mL EGM-2 orta boy eklemek ve toplamak hücreli çözüm15 ml konik bir tüp içine TION. Bir haemocytometer hücrelerin sayısı ve hasat hücrelerinin toplam sayısını 10 mcL alın. </li><li> Plaka EGM-2 orta boy kullanılarak, 5.000 hücre / cm ekim yoğunluğu% 1, jelatin kaplı doku kültürü plakalar hücrelerin 2. Inkübatör tabak yerleştirin ve her 2-3 günde bir EGM-2 orta boy ile onları beslemek. </li></ol> Sonraki pasajlar için bu yordamı yineleyin. Hücre popülasyonu genişletilmiş olarak geçiş sayısının takip edin. ECFCs pasajlar 4-8 arasında kullanılacaktır. 3. Kültür İnsan Kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücreler (MKH) Bu protokol, bu deneyde önce laboratuvarda insan MSC dondurulmuş şişeleri mevcuttur varsayar. Kemik iliği gibi daha önce 11 olarak açıklanan aspiratlarda MSC izole edilebilir . <ol><li> MKH Çözülme bir flakon (genellikle 1 ml dondurma medya 0.50-1x10 6 hücre), sıvı azot depolama tankı alınan ve içeriği, 10 ml DMEM orta içeren bir 15 ml konik tüp hemen sulandırmak. 1200 rpm'de 5 dakika boyunca dönerler. Süpernatantı ve 10 ml sıcak MSCGM ortamın hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> MSC süspansiyon bir kaplanmamış 100 mm doku kültürü tabak içine 10 ml ekleyin. 37 ° C ve% 5 CO 2 nemlendirilmiş bir inkübatör plaka koyun. Ertesi gün hafifçe bağlanmamış hücreleri ve orta aspirat ve 10 ml taze MSCGM orta ile bağlı hücreleri beslemek. </li><li> MSCGM ortamı ile her 2-3 günde bir plaka besleyin. Hücreleri plaka konfluent hücresel tek tabaka% 80 ulaştığı gibi genişletmek için izin ver. % 80 izdiham, aşağıdaki gibi hücreler altkültürü: </li><li> Aspire kültür ortamı ve hücreleri 10 ml PBS ile yıkayın. </li><li> PBS çıkarın ve her biri 100 mm plaka için 2 mL tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin. Tripsin-EDTA çözeltisi eşit dağıtmak için plakalar yavaşça sallayın. 37 ° ° C'de ve% 5 CO2 3-5 dakika. Süspansiyon müstakil hücreler yavaşça ters bir mikroskop altında görmek için plaka dokunun. </li><li> Hücreler tamamen ayırmak, MSCGM orta 8 mL ve 15 mL konik bir tüp içine hücre çözümü toplamak. Bir haemocytometer hücrelerin sayısı ve hasat hücrelerinin toplam sayısını 10 mcL alın. </li><li> Plaka kaplanmamış doku kültürü plakaları hücreleri 10.000 hücre / cm 2 MSCGM orta kullanarak bir tohumlama yoğunlukta. Inkübatör tabak yerleştirin ve her 2-3 günde bir MSCGM orta ile onları beslemek. </li></ol> Sonraki pasajlar için bu yordamı yineleyin. Hücre popülasyonu genişletilmiş olarak geçiş sayısının takip edin. MKH pasajlar 4-8 arasında kullanılır. 4. Kollajen / Fibronektin / Fibrinojen Çözüm hücreler tabanda (Gün 0) 0.8x10 6 ECFCs ve 1.2x10 6 MKH her implant ve fare için gerekli olacak; deney öncesinde, kültürün yeterince ECFCs ve MKH olmadığından emin olun. <ol><li> Her kültürün plaka orta aspire hücreler ve 10 ml PBS ile yıkayın. PBS çıkarın ve her biri 100 mm plaka için 2 mL tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin. Tripsin-EDTA çözeltisi eşit dağıtmak için plakalar yavaşça sallayın. 3-5 dakika inkübe edin. Süspansiyon müstakil hücreler yavaşça ters bir mikroskop altında görmek için plaka dokunun. </li><li> Hücreler tamamen ayırmak, DMEM orta 8 mL ve 15 mL konik bir tüp içine hücre çözümü toplamak. Bir haemocytometer hücrelerin sayısı ve ECFCs ve MKH hasat toplam sayısı 10 mcL alın. </li><li> Transfer 4x10 6 ECFCs (5x 0.8x10 6 hücre) ve tek bir 50 mL konik tüp halinde bir araya 6x10 6 MPCs (5x 1.2x10 6 hücre). Bu beş ayrı implantlar ve fareler için gerekli hücrelerin toplam miktar. 1200 rpm'de santrifüj ve süpernatantı kaldırmak. </li><li> Yavaşça, kollajen / fibronektin çözüm (3 mg / ml son fibrinojen) 0.9 mL 100 uL Fibrinojen çözüm eklemek; karışımı buz üzerinde tutmak. </li><li> Buz gibi kolajen / fibronektin / fibrinojen solüsyonu 1 ml hücre pelletini tekrar; kabarcıkları önlemek için hücrelerin karışımı çok nazikçe. 1 ml steril enjektör içine karışımı yerleştirin ve 26-gauge iğne, şırınga ucundaki kapağı ile bir yerde. Enjeksiyona kadar buz üzerinde yüklü şırınga tutun. </li></ol> 5. Immünyetmezligi Nude Fare içine enjeksiyon (Gün 0) Tüm hayvan deneyleri 6 haftalık atimik nude (nu / nu) fareler ile yapılacaktır. <ol><li> Enjeksiyon öncesinde, bir gaz odasına izofluran teslim yerleştirerek bağışık yetmezliği olan farelere uyutmak. (Muayene ile kalp atım monitörü), anestezi ve ayak tutam tepkisiz kadar yaklaşık 2 dakika boyunca farelerin izofluran teneffüs izin verin. </li><li> Her fare için 50 mcL trombin solüsyonu (10 U / ml), 26-gauge iğne kullanılarak üst dorsal bölge subkutan enjekte edilir. </li><li ayn yerde trombin enjekte edildi mcl i kullan h kar edilir. kollajen jel c ve fibrinojen varl fibrin formu olacak. sonu olarak implant k ama kayda de olu cilt alt tutabilirim.><li> Enjeksiyondan sonra, rahatlık ve sıcaklık için bir katman üzerine gazlı bez farelerin yeri ve ayaktan olana kadar onları gözlemlemek. Sonra sonra, ilk üç gün için günlük farelerin gözlemliyoruz. </li></ol> 6. Hasat (7. Gün) <ol><li> Bir hafta enjeksiyondan sonra fareler, bir gaz odasına sıkıştırılmış CO 2 gaz teslim yerleştirerek euthanize. </li><li> Bir kez ötenazi, enjeksiyon alanında yakın deri kesilerek açılır ve cerrahi jel fişi çekin. Bir ölçekte alınan jel fişlerinin dijital fotoğraf tavsiye edilir. </li><li> Hasat jel fişler histolojik kaset içine yerleştirin ve derin onları% 10 nötr gece oda sıcaklığında formalin solüsyonu. </li><li> Fiksasyon sonra, nötr distile H 2 O ile formalin solüsyonu% 10 yıkayın ve histolojik kasetleri yerde 4 ° C kadar histolojik değerlendirme PBS. </li></ol> 7. Değerlendirme: Histoloji (H &amp; E) ve (hCD31 İmmünohistokimya) <ol><li> Histolojik değerlendirme için, implantlar, parafin ve standart histolojik prosedürlerini kullanarak (7 mikron kalınlığında kesitler) kesitli gömülür. </li><li> Implantlar orta kesiminde alınan Hematoxilin ve Eosin (H &amp; E) boyanan kesitler değerlendirilmesi ile mikrovasküler dansite sayısal olmalıdır. H &amp; E boyama için standart protokoller başka bir yerde bulunabilir. Mikrodamarlar kırmızı kan hücreleri içeren lumenal yapılar olarak tespit edilebilir. Ortalama sayısı, kırmızı kan hücre dolu damarlarının / mm 2 olarak analiz ve ifade edilen alanlardan mikrodamarlar mikrodamarlar yoğunluğu Raporu . </li><li> Mikrovasküler gemileri, alınan implant bölümleri insan doğası immünohistokimyasal göstermek için özel bir insan CD31 (hCD31) standart boyama protokollerini kullanarak antikor ile boyanmış olmalıdır. 1:100 dilüsyon; DakoCytomation (kedi # M0823 Clone JC70A) monoklonal fare anti-insan CD31 antikoru kullanmanızı öneririz. Bu antikor insan özgüllük paralel 7,11 boyandı fare doku kesitlerinde bir çeşitlilik ile elde edilen negatif reaksiyon tarafından teyit edilmiştir. Notu, fare kan damarları genellikle (özellikle sınır civarında) implantlar içinde görülür, ancak fare gemiler, bu antikor ile pozitif leke yapmaz. Buna ek olarak, CD90 veya α-düz kas aktin (α-SMA) karşı insan-spesifik antikorların varlığı insan MSC ile immünohistokimyasal boyama ile tespit edilebilir. İnsan MSC, yeni oluşan kan damarlarının perivasküler bölgede ve interstisyel implant 11 boyunca bulunan iki bulunur . </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. ECFC ve MSC kültürlerinin Tipik bir görünüm . Faz kontrast mikrograflar kültür ECFCs ve MKH tipik bir görünüm gösterir. (A) endotel hücreleri karakteristik parke taşı morfolojisi gösteren kordon kanı türevi ECFCs konfluent tek tabaka. (B) İnsan kemik iliği MKH bir mil şekli morfolojisi gösteren türetilmiştir. Ölçekleyici barlar, 200 um. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. 7 gün eksplante fişlerinin Görünüm. İnsan kordon kanı türevi iliği kaynaklı MKH ECFCs ve kemik kollajen / fibronektin / fibrin jel gömülü ve metinde açıklandığı gibi çıplak farelere subkutan implante edildi. (A) 7 gün sonra, fare ötenazi edildikten sonra cilt enjeksiyon alanı yakınında açmak, kesmek ve cilt saygısız hücre / jel fiş maruz. (B) fişi Görünüm fare ve formalin fiksasyonu önce ameliyatla çıkarıldı. Implantın kırmızı renk vaskülarizasyonun bir göstergesidir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Eksplante fişler vasküler ağ histolojik tanımlama. Eksplante fişlerinin orta kesiminde alınan Hematoxilin ve Eosin (H &amp; E) boyanan kesitler. (A) çevreleyen ana dokuların bağlamda (yani, yağ dokusu ve iskelet kası) implant (sarı kesikli çizgi ile işaretlenmiş) Düşük büyütme (10x) mikrografı. (B) Yüksek büyütme (40x) mikrografı fişi içinde görüntüleyerek birden fazla mikrodamarlar (sarı ok ucu bazıları işaret); mikrodamarlar kırmızı kan hücreleri içeren lumenal yapılar olarak tespit edilebilir. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4. Insan İmmünohistokimyasal kimlikeksplante fişler orta kısmından lümen. İmmünohistokimyasal boyanan kesitler alınmıştır. 1:100 dilüsyon; Boyama DakoCytomation (kedi # M0823 Clone JC70A); bir monoklonal fare anti-insan CD31 (hCD31) antikoru kullanılarak gerçekleştirilen hücre çekirdekleri hematoxilin ile zıt. (A) konak dokuları çevreleyen bağlamında implant (siyah bir kesik çizgi ile tasvir) Düşük büyütme (10x) mikrografı. İnsan özgü, CD31 pozitif mikrodamarlar kahverengi lekeli (peroksidaz boyama). (B) Yüksek büyütme (40x) mikrografı fişi içinde birden fazla insan mikrodamarlar (siyah ok ucu bazı hCD31 olumlu lümen işaret).

<ol><li>Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+13.+An+in+vivo+experimental+model+for+postnatal+vasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis.</a> Methods Enzymol. 445, 303-329 (2008).</li>
<li>Koike, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering%3A+creation+of+long-lasting+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering: creation of long-lasting blood vessels.</a> Nature. 428, 138-139 (2004).</li>
<li>Schechner, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+formation+of+complex+microvessels+lined+by+human+endothelial+cells+in+an+immunodeficient+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">In vivo formation of complex microvessels lined by human endothelial cells in an immunodeficient mouse.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 97, 9191-9196 (2000).</li>
<li>N&ouml, r, E, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+and+characterization+of+functional+human+microvessels+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Engineering and characterization of functional human microvessels in immunodeficient mice.</a> Lab Invest. 81, 453-463 (2001).</li>
<li>Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+circulating+endothelial+cells+and+endothelial+outgrowth+from+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood.</a> J Clin Invest. 105, 71-77 (2000).</li>
<li>Ingram, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells+using+human+peripheral+and+umbilical+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood.</a> Blood. 104, 2752-2760 (2004).</li>
<li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+vasculogenic+potential+of+human+blood-derived+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells.</a> Blood. 109, 4761-4768 (2007).</li>
<li>Au, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+in+vivo+potential+of+endothelial+progenitor+cells+from+human+umbilical+cord+blood+and+adult+peripheral+blood+to+form+functional+long-lasting+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential in vivo potential of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood and adult peripheral blood to form functional long-lasting vessels.</a> Blood. 111, 1302-1305 (2008).</li>
<li>Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cell+principals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109, 1801-1809 (2007).</li>
<li>Traktuev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+Functional+Vascular+Network+Formation+In+Vivo+by+Cooperation+of+Adipose+Progenitor+and+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Robust Functional Vascular Network Formation In Vivo by Cooperation of Adipose Progenitor and Endothelial Cells.</a> Circ Res. 104, 1410-1420 (2009).</li>
<li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+robust+and+functional+vascular+networks+in+vivo+with+human+adult+and+cord+blood-derived+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells.</a> Circ Res. 103, 194-202 (2008).</li>
<li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+Myeloid+Cells+Are+Necessary+for+Creating+Bioengineered+Human+Vascular+Networks+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Host Myeloid Cells Are Necessary for Creating Bioengineered Human Vascular Networks In Vivo.</a> Tissue Eng Part A. 16, 2457-2466 (2010).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu biyomühendislik insan damar ağları deneysel bir model. Bu modelin ana özellikleri şunlardır: 1) mikrodamarlar doğum sonrası dokular (örneğin, kan ve kemik iliği) izole insan hücrelerden oluşur; 2) mikrodamarlar yetişkin bir hayvanın oluşan ve 3) mikrodamarlar öncesi ortaya çıkmaz varolan tek hücrelerin uygun bir jel askıya de novo (ana bilgisayar) damarların, ancak bunun yerine oluşur, . Anjiyogenez Bu testte, fare damarsal bağlantıları, kırmızı kan hücresi dolu kaplar, bu testte fonksiyonel okuma biri elde etmek için gerekli, çünkü önemli bir rol oynar. Buna ek olarak, ana bilgisayar miyeloid hücrelerin gün erken transplantasyon sonrası implant işe ve onlar yeni damar yatağı 12 oluşumu için gereklidir. Bu deneysel model, in vivo insan damar ağları post-natal oluşumunu incelemek için çok yönlü, ölçülebilir ve nispeten daha basit bir model sistem sunmaktadır. Ayrıca, bu testte gerçekleştirmek için basit ve bir kesi veya cerrahi işlem gerektirmez. Bu model, insan endotel ve perivasküler hücreleri farklı kaynaklardan vaskülojenik potansiyelini incelemek için kullanılabilir. Anti-ve / veya pro-vaskülojenik bileşikler için ekran için model olabilir. Son olarak, model insan endotel oluşan damar ağının oluşumu ve işlev olarak belirli genlerin rolü (ler) çalışma için kullanılabilir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> Endotel Bazal Orta, EBM-2 </td><td> Lonza </td><td> CC-3156 </td><td></td></tr><tr><td> EGM-2 SingleQuot takviyeleri </td><td> Lonza </td><td> CC-3162 </td><td></td></tr><tr><td> Streptomisin çözüm, 100x GPS Glutamin-penisilin- </td><td> Mediatech, Inc. </td><td> 30-009-CI </td><td></td></tr><tr><td> Mezenkimal Kök Hücre Büyüme Orta BulletKit MSCBM / MSCGM </td><td> Lonza </td><td> PT-3001 </td><td></td></tr><tr><td> Yüksek glukoz Dulbecco&#39;nun Modifiye Eagle Orta, 1x DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995-073 </td><td></td></tr><tr><td> MEM Sigara esansiyel amino asit çözeltisi, 100x NEAA </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> Yüksek glikoz Dulbecco&#39;nun Modifiye Kartal, toz DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12100-046 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes Tampon çözümü </td><td> Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> Cultrex Sığır Kollajen I çözüm </td><td> Trevigen </td><td> 3442-050-01 </td><td></td></tr><tr><td> Cultrex İnsan Fibronektin </td><td> Trevigen </td><td> 3420-001-01 </td><td></td></tr><tr><td> Fibrinojen gelen sığır plazma </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F8630-1G </td><td></td></tr><tr><td> Jelâtin </td><td> Balıkçı </td><td> DF0143-17-9 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;nun fosfat tamponlu tuzlu su, PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsin-EDTA çözeltisi, 1x </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> Inhalasyon izofluran, sıvı </td><td> Buxter Sağlık Corporation </td><td> NDC 10019-360-40 </td><td></td></tr><tr><td> Sığır plazma gelen Trombin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T4648-1KU </td><td></td></tr><tr><td> Formalin Çözüm Nötr Tamponlu </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> HT501128 </td><td></td></tr><tr><td> Monoklonal Fare İnsan Anti-CD31 antikor </td><td> DakoCytomation </td><td> M0823 </td><td> Klon JC70A </td></tr></tbody></table>

bağışık yetmezliği olan farelere biyomühendislik İnsan mikrovasküler ağları

Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice

, Doku mühendisliği ve doku rejenerasyonu için hücre tabanlı tedaviler gelecekte muhtemelen in vivo fonksiyonel damar ağları oluşturmak için yeteneği üzerinde de durulacaktır. Bu bağlamda, deneysel modeller için arama in vivo kan damarı ağı oluşturmak için, büyük önem 1 taşımaktadır . Insan doku türetilen olgun endotel hücreleri (EC) 2-4 kullanarak in vivo biyomühendislik mikrovasküler ağlarının fizibilitesi ilk gösterildi; Ancak, bu geniş klinik kullanım için otolog endotel hücreleri mevcut sorunlar, elde etmek ve yeterli miktarda gerektirir zor çünkü Mevcut damarsal hasat. Bu sınırlamalar, EC diğer kaynaklar için arama öngörüyordu. Kimlik koloni oluşturan endotel kan hücreleri (ECFCs), non-invaziv elde etmek için bir fırsat sundu 5-7 EC . Biz ve diğer yazarlar, yetişkin ve kordon kanı türevi ECFCs in vivo 7-11 fonksiyonel damar ağları oluşturmak için kapasiteye sahip olduğunu göstermiştir . Daha da önemlisi, bu çalışmalar aynı zamanda istikrarlı ve dayanıklı damar ağları elde göstermiştir ki, ECFCs perivasküler hücreleri ile co-implantasyon gerektirir. Biz burada açıklamak testi bu kavramı gösterir: fonksiyonel bir insan formuna kollajen / fibronektin / fibrinojen jel tek bir hücre süspansiyonu, kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücreler (MKH) ile kombine edilebilir nasıl insan kordon kanı türevi ECFCs immünyetmezligi bir fare içine implantasyon sonrası 7 gün içinde damar ağı. Ev sahibi eritrositler içeren insan ECFC çizgili lümen varlığı sadece bir damar ağı oluşumunu (de novo), aynı zamanda ana dolaşım sistemi ile fonksiyonel anastomozlar gelişme gösteren implantlar boyunca görülebilir. Bu fare kaldırılmıs insan vasküler ağ modeli, ideal insan damar ağı oluşumunu, hücresel ve moleküler mekanizmaları üzerinde çalışmalar ve mühendislik dokular vascularize için stratejiler geliştirilmesi için uygundur.

Burada, biz insan kordon kanı endotel koloni oluşturan hücrelerin (ECFCs -) ve kemik iliğinden elde edilen bağışık yetmezliği olan farelere subkutan kollajen / fibronektin jel gömülü mezenkimal kök hücreler (MKH), teslim etmek için bir metodoloji tarif Bu hücre / jel kombinasyonu, fare damarsal ile bağlayan bir insan bir damar ağı oluşturur.

Bağışık yetmezliği olan farelere Biyomühendislik İnsan Mikrovasküler Ağları

Doku mühendisliğinin ve doku rejenerasyonu için hücre tabanlı tedavilerin geleceği, muhtemelen fonksiyonel vasküler ağlar oluşturma yeteneğimize bağlı olacaktır...

Bu prosedürün genel amacı, in vivo bir insan vasküler ağı oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle insan kanı kaynaklı endotelyal koloni oluşturucu hücrelerin ve insan kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin kültüre edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, her iki hücre tipi kollajen bazlı bir jel içerisinde karıştırılarak immün yetmezlikli bir fareye deri altına enjekte edilir.Yedi gün sonra implant hasat edilir ve insan vasküler ağının oluşumu açısından değerlendirilir. Sonuç olarak, implantların içindeki insana özgü mikrodamarların varlığı histoloji ve immünohistokimya yoluyla doğrulanabilir. Bu teknolojinin, konstrüktun cerrahi implantasyonu gibi geleneksel bir yönteme göre temel avantajı, basit ve uygulanmasının kolay olması ve cerrahi müdahale gerektirmemesidir.Bir vial E CFC'nin çözülmesiyle başlayın ve hücreleri derhal 10 mL DMEM içeren 15 mililitrelik konik tüpte seyreltin. Hücre süspansiyonunu 1200 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve hücre peletini 10 mL ılık EGM two medyumunda yeniden süspanse edin. Ardından hücreleri %1 jelatin kaplı 100 milimetrelik doku kültürü plağına aktarın ve hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde gece boyunca inkübe edin.Ertesi sabah, besiyerini ve bağlanmamış tüm hücreleri nazikçe aspire edin. Ardından, bağlanan hücreleri 10 milliliters taze E GM two besiyeri ile besleyin. Konfluent bir monotabaka oluşana kadar bu işleme önümüzdeki birkaç gün boyunca devam edin.Ardından hücreleri 10 mililitre PBS ile yıkayın. PBS'yi iki mililitre tripsin EDTA ile değiştirin ve plakayı beş dakika boyunca inkübatöre geri koyun. Beş dakika sonra bir mikroskop altında, plakaya hafifçe vurun ve hücrelerin ayrılıp ayrılmadığını kontrol edin.Aksi takdirde, hafifçe sallayarak kısa inkübasyonları tekrarlayın. Hücreler tamamen ayrıldıktan sonra, hücrelere sekiz mililitre EGM iki medyum ekleyin ve hücreleri 15 mililitrelik konik tüpe aktarın. Hücreleri sayın ve 1200 RPM'de beş dakika boyunca santrifüj edin.Şimdi hücreleri, %1 jelatin ile kaplanmış doku kültürü plaklarına santimetrekare başına 5.000 hücre ekim yoğunluğunda ekin. Hücreleri EGM two ortamında inkübe edin ve her iki ila üç günde bir EGM two ortamı ile besleyin. Bu prosedürü, dördüncü ve sekizinci pasajlar arasındaki sonraki pasajlar için tekrarlayın.E CFC'ler kullanıma hazır olacaktır. Bu protokol, MSC'leri büyütmek için de kullanılabilir. Sadece E GM iki ortamını M-S-C-G-M ortamı ile değiştirin.Kaplanmamış bir kültür plakası kullanın. Alt kültüre alma işlemine %80 konfluensle başlayın ve santimetrekare başına 10,000 hücre ekim yoğunluğunda alt kültür yapın. Bu deney, implant başına 800,000 E CFC ve 1,200,000 MSC gerektirir.Genellikle beş implant eş zamanlı olarak hazırlanır. Başlamak için kültür plakalarındaki hücre besiyerini aspire edin ve her bir hücre plakasını 10 milliliters PBS ile yıkayın. PBS'yi iki milliliters tripsin EDTA ile değiştirin ve plakaları hafifçe sallayarak inkübe edin.Hücrelerin tamamı ayrılana kadar her iki ila beş dakikada bir mikroskop altında kontrol edin. Ardından sekiz mililitre DMEM ekleyin ve hücre solüsyonunu toplayın. 15 mililitrelik konik tüpte hücreleri sayın ve beş implant için yeterli miktarda hücreyi tek bir 15 mililitrelik konik tüpe aktarın.Ardından hücreleri 1200 RPM hızda beş dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı uzaklaştırın. Buz üzerinde fibrinojen ve kolajen fibronektin karışımını dikkatlice hazırlayın. Sonra hücre peletini buz gibi soğuk karışım içerisinde çok nazikçe yeniden süspanse edin.Hava kabarcığı oluşumundan kaçınarak, hücre süspansiyonunu bir mililitrelik bir şırıngaya yükleyin ve kapaklı 26 gauge bir iğne takın. Hücre karışımı enjekte edilene kadar yüklü şırıngayı buz üzerinde tutun. Altı haftalık dört atimik nude immünodefisyent fareyi bir ISO florür odası kullanarak anestezi altına alın.Fareler anestezi altına alınıp ayak parmağı sıkıştırma testine yanıt vermedikleri zaman, her bir fare için enjeksiyonlara geçin. Üst dorsal bölgeye subkutan olarak 50 µL trombin çözeltisi enjekte etmek için 30 gauge iğne kullanın. Aynı konuma 200 µL hücre karışımı enjekte edin.26 gauge bir iğne kullanıldığında, enjekte edilen makromoleküller jelleşecek ve deri altında küçük ancak fark edilebilir bir şişlik oluşturacaktır. Enjeksiyondan sonra, fareleri konfor ve sıcaklık sağlamak amacıyla bir gazlı bez tabakasının üzerine yerleştirin. Hareket edebilene kadar onları gözlemleyin.Sonraki üç gün boyunca hayvanın genel sağlık durumunun günlük gözlemini yapın. Enjeksiyonlardan bir hafta sonra fareleri karbondioksit ile ötanize edin ve jel tıpalarını cerrahi olarak çıkarın. Çıkarılan jel tıpalarının bir cetvel yanındayken fotoğraflarını çekin, ardından her bir jel tıpasını histolojik bir kasete yerleştirin ve oda sıcaklığında gece boyunca %10 nötral tamponlu formaline daldırın.Ertesi gün, %10 nötr tamponlu formalinle yıkama yapıp distile su ile uzaklaştırın. Kasetleri, histolojik değerlendirme yapılana kadar dört derece Celsius'ta PBS içerisinde saklayın. Parafine gömülmüş implanttan yedi mikron kalınlığında kesitler alın.Ardından implantların orta kısmındaki mikro damarların yoğunluğunu nicelleştirin. Mikro vasküler damarların insan kaynaklı doğasını kanıtlamak için H&amp;E boyama yardımıyla milimetrekare başına düşen damar sayısını belirleyin. Kesitleri, ticari olarak temin edilebilen bir anti-human CD 31 antikoru ile 1:100 dilüsyonda boyayın.Bu faz kontrast görüntüsü, kordon kanı kaynaklı e CFC'lerin tipik konfluent monokatmanındaki endotel hücrelerinin karakteristik parke taşı morfolojisini göstermektedir. Bu görüntü, insan kemik iliği kaynaklı MSC'lerin tipik iğ şeklinde morfolojisini göstermektedir. Fare konakçıda bir haftalık inkübasyonun ardından, sarı kesikli çizgiyle işaretlenen implant, yüksek büyütmede konakçının dokularından oldukça farklı görünmekteydi.Sarı ok uçlarıyla belirtilen çok sayıda mikrodamarda, eritrositler içeren lüminal yapılar görülmüştür. Tıkaçlar immünohistokimyasal olarak incelendiğinde, mikrodamarların lümeninin insan CD 31'e özgü monoklonal antikora karşı reaktif olduğu saptanmıştır. Hücre çekirdekleri hematin ile karşıt boyanmıştır.Bu teknolojiye hakim olunduğunda, doğru şekilde uygulandığı takdirde bir ons içerisinde tamamlanabilir.

bioengineering-human-microvascular-networks-in-immunodeficient-mice

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, baskılanmış nötrofil yanıtı olan immün yetmezliği olan bir fareye insan derisinin aşılanması için bir yöntem gösterilmektedir. Yöntem, farenin greft yatağına insan bölünmüş kalınlıkta derisinin uygulanmasını, mühürlenmesini ve geri kazanım için örtülmesini içerir. Sonunda, insan derisi farenin derisine yapışır, vaskülarizasyon ve dolaşım sağlar ve başarılı bir deri ksenogrefti ile sonuçlanır.

Bir fare modelinde insan derisi grefti için bir teknik

Biz fare greft arteriosclerois (GA) aynı doğuştan gerginlik bir alıcıya bir fare damar segmentinin interpozisyonu içeren modeller için protokolleri tarif. Damar donör içine ek genetik değişiklikler geri melezlenmesine tarafından, model GA belirli genlerin etkisini değerlendirebilir.

Greft damar sertliği için fare modelleri

Neisseria meningitidis kan damarları bulaşan bir insan özgü patojendir. Bu protokolde insan mikrodamarlar bağışıklığı fare üzerine insan cildi aşılama yaparak bir fare sokulur. Bakteriler genellikle insan durumda gözlenen purpurik döküntü vasküler hasar ve gelişimine yol açan, insan gemilere yoğun yapışır.

Insanlaşmış Fare Modeli mikrovaskülatürde Hedefleme Bakteriyel Enfeksiyonlar Eğitim için

Vaskülarizasyon başarılı doku mühendisliği yaklaşımları anahtarıdır. Bu nedenle, güvenilir teknolojileri doku yapıları vasküler ağların gelişimini değerlendirmek için gereklidir. Burada görselleştirmek ve in vivo damarlanmayı ölçmek için basit ve maliyet-etkin bir yöntem mevcut.

A Tam Cilt Hata Modeli Biyomateryallerin vaskülarizasyonunu değerlendirin<em&gt; In Vivo</em

Bu protokol, HIV enfeksiyonuna karşı kök hücre tabanlı tasarlanmış bağışıklığa sahip insanlaştırılmış bir kemik iliği/karaciğer/timus fare modeli oluşturma yöntemlerini açıklar.

Insanlaşmış Fare Modelinde HIV enfeksiyonuna karşı kök hücre Tabanlı Engineered Bağışıklık

Bu umut verici vaskülarizasyon birimlerini temsil adipoz doku türevli mikrovasküler fragmanları izole etmek için bir protokol mevcut. Bunlar hızlı bir şekilde izole edilebilir, bu nedenle, doku mühendisliği farklı alanlarında tek aşamalı prevascularization için kullanılabilmektedir, nitro işleme gerektirmez ve yoktur.

Doku Mühendisliği vaskülarizasyon Birimleri olarak Kemirgen Yağ Dokusu kaynaklı Mikrovasküler Parçalarının İzolasyonu

Farelerde farklı insanlaştırılmış kemik iliği nişleri oluşturmak ve canlı görüntü oluşturmak için bir yöntem sunulmuştur. İnsan mezenşimal hücreleri tarafından oluşturulan destekleyici niş dayanarak, insan endotel hücrelerinin eklenmesi, insan damarlarının oluşumunu indüklerken rhBMP-2 ilavesi, insan-fare kimerik olgun kemik dokusunun oluşumunu indükler.

Fare Malı İnsani Kemik İliği Mikro Çevrelerinin Biyomühendisliği ve Canlı Görüntüleme ile Görselleştirilmesi

Burada insanlaşmış farelerde HIV enfeksiyonu dinamikleri incelenmesi için üç deneysel yaklaşımlar açıklanmıştır. İlk ivedi kronik enfeksiyon olaylarının incelenmesine izin vererken, ikincisi primer enfeksiyon veya viral reaktivasyon sonrası akut olayların incelenmesine izin verir.

Humanized Immunoficient Mouse Modellerinde Kronik, Akut ve Yeniden Aktive HIV Enfeksiyonu

İntrafemoral enjeksiyonlar, hücreleri doğrudan kemik iliği boşluğuna yerleştirerek az sayıda hematopoietik kök ve progenitör hücrenin (HSPC'ler) aşılanmasına izin verir. Burada, insan HSPC'lerinin immün yetmezliği olan farelere intrafemoral enjeksiyonunun deneysel bir protokolünü açıklıyoruz.

İnsan Hematopoietik Kök ve Progenitör Hücrelerinin İmmün Kuvvetlenmiş Farelere İntrafemoral Enjeksiyonu 

Heterotopik arka uzuvdan boyuna vaskülerize kompozit allotransplantasyonlu tekrarlanabilir bir fare modeli sunuyoruz. Bu süpermikrocerrahi protokol, 0,3-0,5 mm damar anastomozlarını içerir ve naylon filament yönlendirmesi ile venöz kelepçeleme ile birleştirilir. Vaskülerize kompozit allotransplantasyonda tolerans, iskemi-reperfüzyon hasarı ve immünolojik mekanizmalar üzerine translasyonel çalışmalar için güvenilir bir platform sağlar.

Farede Heterotopik Arka Uzuvdan Boyuna Nakil: Vaskülerize Kompozit Allotransplantasyonun Süpermikrocerrahi Modeli

Keşfedin, bağışık yetmezliği olan farelerde insan mikrovasküler ağları oluşturma yöntemini. ECFC ve MSC hücrelerini kollajen/fibronektin jel içinde enjekte ederek damarsal rejenerasyonu inceleyin.

Bağışık yetmezliği olan farelere Biyomühendislik İnsan Mikrovasküler Ağları

Daha fazla video keşfet