Bağışık yetmezliği olan farelere Biyomühendislik İnsan Mikrovasküler Ağları

Bu prosedürün genel amacı, in vivo bir insan vasküler ağı oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle insan kanından türetilmiş endotelyal koloni oluşturucu hücrelerin ve insan kemik iliğinden türetilmiş mezenkimal kök hücrelerin kültüre edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından her iki hücre tipi, immunyetersiz bir fareye deri altına enjekte edilen kolajen bazlı bir jel ile karıştırılır.

Yedi gün sonra implant çıkarılır ve insan vasküler ağ oluşumu açısından değerlendirilir. Nihayetinde, implantlar içindeki insana özgü mikrovasküllerin varlığı histoloji ve immünohistokimya yoluyla doğrulanabilir. Bu teknolojinin, konstrüktun cerrahi implantasyonu gibi geleneksel bir yönteme göre temel avantajı, basit ve kolay uygulanması ve cerrahi müdahale gerektirmemesidir.

Bir viyol E CFC'yi çözerek başlayın ve hücreleri hemen 10 ml DMEM içeren 15 mililitrelik konik tüpte seyreltin. Hücre süspansiyonunu 1200 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve hücre peletini 10 ml ılık EGM two medyumunda yeniden süspande edin. Ardından hücreleri %1 jelatin ile kaplanmış 100 milimetrelik doku kültürü plağına aktarın ve hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde gece boyunca inkübe edin.

Ertesi sabah, medyumu ve bağlanmamış hücreleri nazikçe aspire edin. Ardından, bağlanan hücreleri 10 mililitre taze E GM two medyum ile besleyin. Konfluent bir monokatman oluşana kadar önümüzdeki birkaç gün boyunca bu işleme devam edin.

Ardından hücreleri 10 mililitre PBS ile yıkayın. PBS'yi iki mililitre tripsin EDTA ile değiştirin ve plakayı beş dakika boyunca inkübatöre geri yerleştirin. Beş dakika sonra, bir mikroskop altında plakaya nazikçe vurun ve hücrelerin ayrılıp ayrılmadığını kontrol edin.

Eğer değilse, hafifçe sallayarak kısa inkübasyonları tekrarlayın. Hücreler tamamen ayrıldığında, hücrelere sekiz mililitre EGM two medyumu ekleyin ve hücreleri 15 mililitrelik konik tüpe aktarın. Hücreleri sayın ve 1200 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Şimdi hücreleri, santimetrekare başına 5.000 hücre ekim yoğunluğunda, %1 jelatin ile kaplanmış doku kültürü plaklarına ekin. Hücreleri EGM two medyum içerisinde inkübe edin ve her iki ila üç günde bir EGM two medyum ile besleyin. Dördüncü ve sekizinci pasajlar arasındaki sonraki pasajlar için bu prosedürü tekrarlayın.

E CFC'ler kullanıma hazır olacaktır. Bu protokol, MSC'lerin büyütülmesi için de kullanılabilir. Sadece E GM iki ortamını M-S-C-G-M ortamı ile değiştirin.

Kaplanmamış bir kültür plakası kullanın. Alt kültüre %80 konfluansta başlayın ve santimetrekare başına 10.000 hücre ekim yoğunluğunda alt kültür yapın. Bu deney için implant başına 800.000 E CFC ve 1.200.000 MSC gereklidir.

Genellikle beş implant aynı anda hazırlanır. Başlamak için kültür plakalarındaki hücre ortamını aspire edin ve her bir hücre plakasını 10 milliliters PBS ile yıkayın. PBS'yi iki milliliters tripsin EDTA ile değiştirin ve plakaları hafifçe sallayarak inkübe edin.

Hücrelerin tamamı ayrılana kadar her iki ila beş dakikada bir mikroskop altında kontrol edin. Ardından sekiz mililitre DMEM ekleyin ve hücre çözeltisini toplayın. 15 mililitrelik konik tüpte hücreleri sayın ve beş implant için yeterli hücreyi tek bir 15 mililitrelik konik tüpe aktarın.

Ardından hücreleri 1200 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı uzaklaştırın. Buz üzerinde dikkatlice bir fibrinojen ve kolajen fibronektin karışımı hazırlayın. Daha sonra hücre peletini buz gibi soğuk karışım içerisinde çok nazikçe yeniden süspande edin.

Hava kabarcığı oluşumunu önleyerek, hücre süspansiyonunu bir mililitrelik bir şırıngaya yükleyin ve kapaklı 26 gauge bir iğne takın. Hücre karışımı enjekte edilene kadar yüklü şırıngayı buz üzerinde tutun. ISO florür odası kullanarak altı haftalık dört adet atimik nude immunodeficient fareyi anesteziye alın.

Fareler anestezi altına alınıp ayak parmak sıkıştırma uyarısına yanıt vermemeye başladığında, her fare için enjeksiyonlara geçin. Üst dorsal bölgeye subkütan olarak 50 µL trombin solüsyonu enjekte etmek için 30 gauge bir iğne kullanın. Aynı bölgeye 200 µL hücre karışımı enjekte edin.

26 gauge bir iğne kullanıldığında, enjekte edilen makromoleküller jelleşecek ve deri altında küçük ancak belirgin bir şişkinlik oluşturacaktır. Enjeksiyondan sonra, fareleri konfor ve sıcaklık sağlamak amacıyla bir gazlı bez tabakası üzerine yerleştirin. Hareketli hale gelene kadar onları gözlemleyin.

Sonraki üç gün boyunca, hayvanın genel sağlık durumunun günlük gözlemini yapın. Enjeksiyonlardan bir hafta sonra, fareleri karbondioksit ile ötanize edin ve jel tıpayı cerrahi olarak çıkarın. Çıkarılan jel tıpayı bir cetvelle birlikte fotoğraflayın, ardından her bir jel tıpayı histolojik bir kasete yerleştirin ve oda sıcaklığında gece boyunca %10 nötral tamponlu formaline daldırın.

Ertesi gün, %10 nötr tamponlu formalin distile su ile yıkanarak uzaklaştırılır. Kasetler, histolojik değerlendirme yapılana kadar dört santigrat derecede PBS içerisinde saklanır. Parafine gömülmüş implanttan yedi mikron kalınlığında kesitler alınır.

Ardından, implantların orta kısmındaki mikrodamarların yoğunluğunu belirleyin. Mikrovasküler damarların insan kaynaklı olduğunu kanıtlamak için H ve E boyama yardımıyla milimetrekare başına düşen damar sayısını hesaplayın. Kesitleri, 1/100 dilüsyonunda, ticari olarak temin edilebilen bir anti-human CD 31 antikoru ile boyayın.

Bu faz kontrast görüntüsü, kordon kanından türetilmiş eCFC'lerin tipik konfluen tek katmanındaki endotel hücrelerinin karakteristik parke taşı morfolojisini göstermektedir. Bu görüntü, insan kemik iliğinden türetilmiş MSC'lerin tipik iğ şeklinde morfolojisini göstermektedir. Fare konakçıda bir hafta süren inkübasyonun ardından, sarı kesikli çizgiyle işaretlenen implant, yüksek büyütmede konak dokulardan çok farklı görünmekteydi.

Sarı ok uçlarıyla belirtilen çok sayıda mikrodamarın, eritrositler içeren lüminal yapıları ortaya çıkarılmıştır. Tıkaçlar immünohistokimyasal olarak incelendiğinde, mikrodamarların lümeninin insan CD 31'e karşı monoklonal bir antikora reaktif olduğu görülmüştür. Hücre çekirdekleri hematin ile karşıt boyanmıştır.

Bu teknolojiye hakim olunduğunda, doğru şekilde uygulandığı takdirde işlem bir ons içerisinde tamamlanabilir.