Bağışık yetmezliği olan farelere Biyomühendislik İnsan Mikrovasküler Ağları

Bu prosedürün genel amacı, in vivo bir insan vasküler ağı oluşturmaktır. Bu, ilk olarak insan kanından türetilmiş endotelyal koloni oluşturan hücrelerin ve insan kemik iliğinden türetilmiş mezenkimal kök hücrelerin kültürlenmesiyle gerçekleştirilir. Her iki hücre tipi daha sonra kollajen bazlı bir jel içine karıştırılır ve bu jel deri altından immün yetmezliği olan bir fareye enjekte edilir.

Yedi gün sonra, implant çıkarılır ve bir insan damar ağının oluşumu için değerlendirilir. Sonuç olarak, implantların içinde insana özgü mikro damarların varlığı, histolojisi ve immünohistokimyası ile doğrulanabilir. Bu teknolojinin, yapının cerrahi implantasyonu gibi bir asit yöntemine göre en büyük avantajı LED'dir, basit ve gerçekleştirilmesi kolaydır ve ameliyat gerektirmez.

Bir şişe E CFC'yi çözerek başlayın ve hücreleri hemen 10 mililitre DMEM içeren 15 mililitrelik bir konikte seyreltin. Hücre süspansiyonunu 1200 RPM'de beş dakika boyunca döndürün ve Resus hücre peletini 10 mililitre ılık EGM iki ortamda askıya alın. Daha sonra hücreleri% 1 jelatin ile kaplanmış 100 milimetrelik bir doku kültürü plakasına aktarın ve hücreleri gece boyunca nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin.

Ertesi sabah, ortamı ve bağlanmamış hücreleri nazikçe aspire edin. Daha sonra bağlı hücreleri 10 mililitre taze E GM iki orta ile besleyin. Birleşen bir tek tabaka oluşana kadar önümüzdeki birkaç gün boyunca bu işleme devam edin.

Sonra hücreleri 10 mililitre PBS ile yıkayın. PBS'yi iki mililitre tripsin EDTA ile değiştirin ve plakayı beş dakika boyunca inkübatöre geri koyun. Mikroskop altında beş dakika sonra, plakaya hafifçe vurun ve hücrelerin ayrılıp ayrılmadığını kontrol edin.

Değilse, kısa inkübasyonları hafifçe sallayarak tekrarlayın. Hücreler tamamen ayrıldıktan sonra, hücrelere sekiz mililitre EGM iki ortam ekleyin ve hücreleri 15 mililitrelik bir koniye aktarın. Hücreleri sayın ve beş dakika boyunca 1200 RPM'de döndürün.

Şimdi hücreleri, santimetre kare başına 5.000 hücre oturma yoğunluğunda% 1 jelatin ile kaplanmış doku kültürü plakaları üzerine yerleştirin. EGM iki ortamda, hücreleri inkübe edin ve her iki ila üç günde bir EGM iki ortam ile besleyin. Dört ve sekizinci bölümler arasındaki sonraki geçişler için bu prosedürü tekrarlayın.

E CFC'ler kullanıma hazır olacaktır. Bu protokol aynı zamanda MSC'leri büyütmek için de kullanılabilir. Sadece E GM iki ortamını M-S-C-G-M ortamıyla değiştirin.

Kaplanmamış bir kültür plakası kullanın. Alt kültüre% 80 birleşme ve alt kültüre santimetre kare başına 10.000 hücre tohumlama yoğunluğunda başlayın. Bu deney implant başına 800.000 E CFC ve 1.200.000 MSC gerektirir.

Genellikle beş implant aynı anda hazırlanır. Kültür plakalarından bir hücre ortamını aspire etmeye başlamak için ve her bir hücre plakasını 10 mililitre PBS ile yıkayın. PBS'yi iki mililitre tripsin EDTA ile değiştirin ve plakaları hafifçe sallanarak inkübe edin.

Hücrelerin tümü ayrılana kadar hücreleri her iki ila beş dakikada bir mikroskop altında kontrol edin. Sonra sekiz mililitre DMEM ekleyin ve hücre çözeltisini toplayın. 15 mililitrelik bir konikte, hücreleri sayın ve beş implant için yeterli sayıda hücreyi tek bir 15 mililitrelik konik içine aktarın.

Daha sonra hücreleri 1200 RPM'de beş dakika boyunca döndürün ve tırnağı çıkarın. Buz üzerinde dikkatlice fibrinojen ve kollajen fibronektin karışımı hazırlayın. Daha sonra hücre peletini buz gibi soğuk karışımda çok nazikçe yeniden süspanse edin.

Hava kabarcıklarının oluşmasını önleyerek, hücre süspansiyonunu bir mililitrelik bir şırıngaya yükleyin ve kapaklı 26 gauge bir iğne takın. Hücre karışımı enjekte edilene kadar yüklü şırıngayı buz üzerinde tutun. Bir ISO flor odası kullanılarak altı haftalık dört atimik çıplak immün yetmezliği olan fareye anestezi uygulandı.

Fareler uyuşturulduktan ve ayak parmağını sıkıştırmaya tepki vermedikten sonra, her fare için enjeksiyonlara devam edin. Üst sırt bölgesine deri altından 50 mikrolitre trombin solüsyonu enjekte etmek için 30 gauge iğne kullanın. Aynı yerde, 200 mikrolitre hücre karışımını enjekte edin.

26 gauge bir iğne kullanarak, enjekte edilen makromoleküller jelleşecek ve cilt altında küçük ama kayda değer bir yumru oluşturacaktır. Enjeksiyondan sonra, fareleri rahatlık ve sıcaklık için bir gazlı bez tabakasına yerleştirin. Yürüyene kadar onları gözlemleyin.

Önümüzdeki üç gün boyunca, hayvanın genel sağlığı hakkında günlük bir gözlem yapın. Enjeksiyonlardan bir hafta sonra, fareleri karbondioksit ile ötenazi yapın ve jel tıkacını cerrahi olarak çıkarın. Alındıktan sonra, jel tıkaçlarını bir cetvelin yanında fotoğraflayın, ardından her bir jel tıkacını histolojik bir kasete yerleştirin ve gece boyunca oda sıcaklığında% 10 nötr tamponlu formine batırın.

Ertesi gün,% 10 nötr tamponlu formini damıtılmış su ile yıkayın. Kasetleri histolojik değerlendirme için değerlendirilene kadar PBS'de dört santigrat derecede saklayın. İmplantın parafine gömülü yedi mikronluk kesitlerini yapın.

Daha sonra implantların orta kısmındaki mikro damarların yoğunluğunu ölçün. Bir H ve e lekesi yardımıyla, mikrovasküler damarların insan doğasını göstermek için milimetre kare başına düşen damar sayısını puanlayın. Bölümleri, bir ila 100 seyreltmede ticari olarak temin edilebilen bir anti-insan CD 31 antikoru ile boyayın.

Bu faz kontrast görüntüsü, kordon kanı türevi e CFC'lerin tipik bir birleşik tek tabakasındaki endotel hücrelerinin karakteristik parke taşı morfolojisini göstermektedir. Bu görüntü, insan kemik iliğinden türetilmiş MSC'lerin tipik iğ şekli morfolojisini göstermektedir. Fare konakçısında bir haftalık inkübasyondan sonra, sarı kesikli bir çizgi ile işaretlenmiş implant, daha yüksek büyütmede konakçının dokularından çok farklı görünüyordu.

Birden fazla mikro damar ortaya çıktı, kırmızı kan hücreleri içeren luminal yapıları ve sarı ok uçları ile vurgulandı. Tıkaçlar immünohistokimyasal olarak incelendiğinde, mikrodamarların lümeni insan CD 31'e karşı bir monoklonal antikora reaktifti. Hücre çekirdekleri hematin ile karşı boyandı.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknoloji düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse bir ons içinde yapılabilir.