Bir memeli sistemi aracılığıyla influenza virüsü benzeri parçacıkların üretilmesi için bir teknik

Virüs benzeri parçacıklar veya VLP'ler, virüs yapısını taklit eder, ancak viral genetik materyalden yoksundur, bu da onları öldürücü olmayan hale getirir. VLP'ler, bağışıklık hücreleri tarafından tanınan yüzeye bağlı antijenik epitoplara sahiptir ve bu da onları ideal aşı adayları yapar.

Rekombinant influenza VLP'leri oluşturmak için ökaryotik ifade vektörlerini alın.

İki vektör, hemaglutinin veya HA ve nöraminidaz veya NA - influenza virüsünün yapısal proteinlerini kodlayan genleri içerir. Üçüncü vektör, insan immün yetmezlik virüsünün çekirdek proteinlerini kodlayan gag genini içerir.

Katyonik lipid bazlı bir transfeksiyon reaktifi ekleyin. Pozitif yüklü lipid baş grubu, negatif yüklü DNA ile etkileşime girerek vektörlerin etrafında bir çift tabaka oluşturur - lipozom transfeksiyon kompleksleri oluşturur.

VLP üretimi için uygun kültürlenmiş memeli konak hücrelerine kompleksler ekleyin ve inkübe edin. Transfeksiyon kompleksleri hücrelere endositoz yoluyla girer - lipozom zarı, vektörleri sitoplazmaya bırakmak için endozom zarı ile birleşir.

Vektörler çekirdeğe girerek viral genlerin ekspresyonuna yol açar. Endoplazmik retikulumda HA ve NA sentezi üzerine, proteinler salgı yolu yoluyla plazma zarına yer değiştirir.

Çekirdek proteinler sitoplazmada sentezlenir ve plazma zarına demirlemek için montaj yerine taşınır. Biriken viral bileşenler, VLP'lere kendi kendine monte edilir ve konakçı hücreden tomurcuklanır.

Aşağı akış işleme için serbest bırakılan VLP'leri hasat edin.

Transfeksiyon gününde, üreticinin tavsiyelerine göre lipozom ve DNA çözeltileri hazırlayın. DNA hücrelerini, 1: 1: 2 HA: NA: Gag DNA bileşimi ve T-150 şişesi başına toplam 40 mikrogram DNA miktarı ile transfekte edin. Toplam 150 mililitre hacim için dokuz T-200 şişesi oluşturmak için bu adımı tekrarlayın.

Daha sonra, DNA ve lipozom çözeltilerini serum içermeyen transfeksiyon ortamında antibiyotik olmadan seyreltin, böylece her bir şişe toplam 24 mililitre hacim içerir. Şişeleri inkübatöre geri koyun ve hücreleri, virüs benzeri parçacık veya VLP, hasat gününe kadar transfeksiyon kültürü ortamında tutun.

Transfeksiyondan 72 ila 96 saat sonra kültürü hücrelerden toplamak için süpernatanı 15 mililitrelik konik tüplere aktarın. Hücresel kalıntıları peletlemek için hücreleri aşağı doğru döndürün. Süpernatanları toplayın ve 0.22 mikronluk bir gözenek zarından süzün.