Name: Erken Evre Tavuk Embriyolar Büyüme Faktörü-Kaplı Boncuk yerleştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Öğrenin, büyüme faktörü kaplı boncuk yerleştirme yöntemiyle erken evre tavuk embriyolarında hücre kaderini nasıl değiştirebilirsiniz. Bu teknik gelişim biyolojisi ve nörobiyoloji araştırmaları için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Inkübatör yumurta kaldırın E2-2.5 (~ St 17 HH), yumurta kaldırmak ve onları buna göre hazırlamak. Onlar hemen üzerinde çalışmış ya da bir kaç saat için inkübatör iade edilebilir. Yumurta, bir saatten fazla oda sıcaklığında güvenle yerleştirilebilir. Yumurta manipülasyonlar süresi dışında kalmak. Bazen bu bir saat veya daha fazla sürebilir. Not: uzun süre oda sıcaklığında oturup, daha az olasılıkla onlar hayatta kalmak için. 2. Çini mürekkebi hazırlanması <ol><li> % 4 steril PBS Hindistan Mürekkep taze bir çözüm hazırlayın. </li><li> Çözümü ile 3 ml şırınga doldurun. </li><li> Şırıngaya 27 gauge ½ inç iğne yerleştirin. </li><li> Hemostat bir çift kullanarak, 90 ° lik bir açı ile iğne bükün. </li></ol> 3. Açılış çini mürekkebi, yumurta ve enjeksiyon <ol><li> Geri bant kabuğu, bir çift forseps kullanma ve yumurta arka yüzünde bandın ters tarafında kullanarak güvenliği, pencereyi açmak. </li><li> Embriyo hemen altında yer kadar açılı iğne Kılavuzu. Kayan diskin altına iğnenin embriyo için toksik olan mürekkep, doğrudan temas etmeyeceğini garanti eder. </li><li> Rahat bir kontrast oluşturmak için yeterli mürekkep enjekte etmek gerekir. Bu genellikle ¼ ml daha azdır. </li></ol> 4. Nöral tüp açma <ol><li> Bir çift ince diseksiyon makas alın ve üstünde yer alan ince bir zar veya bazen etrafında, embriyonun kesmek. </li><li> 55 forseps veya tungsten probu bir çift atın ve anterior posterior nöral tüp açık. Açılış içine bir boncuk yerleştirmek için yeterince büyük olduğundan emin olun. </li></ol> Not: yaşına bağlı olarak, ince bir tungsten prob aynı şeyi yapmak için kullanılabilir. 5. Kaplamalı bir heparin-akrilik boncuk alınıyor <ol><li> 55 forseps bir çift kullanarak sağlam bir boncuk, çözüm bulabilirsiniz. Boncuk ucu tutunmasını, forseps yavaşça kapatın. </li><li> Çözüm boncuk çıkarın ve yumurtanın üstüne getirmek. </li><li> Albümin yerleştirilen kadar, boncuk çözümü sonra büyük olasılıkla kapalı gelmemiş olacaktır. </li></ol> 6. Boncuk yerleştirmek <ol><li> Boncuk hedef alan üst verildikten sonra, önbeyin doğru veya Beyin bunu düzeltmek için bir tungsten prob kullanın. </li><li> 10 mcL pipet kullanarak PBS birkaç damla ekleyin. </li></ol> 7. Kapanış yumurta <ol><li> Pencereyi kapatmak için ince parça bant kullanarak yumurta kapatın. </li><li> Prepping protokole göre yumurta, mevcut Seal <a href="http://jove.com/index/Details.stp?ID=306" target="_blank">http://jove.com/index/Details.stp?ID=306</a> . </li></ol>

<ol><li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+Chicken+Eggs+for+Developmental+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Jounal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies.</a> Jounal of Visualized Experiments. 8, 

 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306</a> (2007).</li>
<li>Crossley, P. H., Martinez, S., Ohkubo, Y., Rubenstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+expression+of+Fgf8%2C+Otx2%2C+Bmp4%2C+and+Shh+in+the+rostral+prosencephalon+during+development+of+the+telencephalic+and+optic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Coordinate expression of Fgf8, Otx2, Bmp4, and Shh in the rostral prosencephalon during development of the telencephalic and optic vesicles.</a> Neuroscience. 108, 183-206 (2001).</li>
<li>Alexandre, P., Bachy, I., Marcou, M., Wassef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+regulations+by+FGF8+contribute+to+midbrain+roof+plate+developmental+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%22%5BJournal%5D)">Positive and negative regulations by FGF8 contribute to midbrain roof plate developmental plasticity.</a> Development . 133, 2905-2913 (2006).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Kullanmak istediğiniz protein bağlı, boncuklar nasıl hazırlamak için farklı protokoller vardır. Bu deneylerde, heparin-akrilik boncuk, ancak Affi-jel boncuklar da kullanılabilir. Biz heparin akrilik boncuk, albümin, yumurta, sulu bir ortamda işlemek için kolay olduğunu bulduk. Boncuk 4 ° C&#39;de gece protein 5 l batırılmış Kontrol boncuklar yerleştirme zamanına kadar steril PBS yerleştirilir. Ovo hazırlanmasında kullanarak avantaj embriyo hala hayatta ve normalde 1 geliştirmek için ücretsiz olmasıdır. Bir eksplant tutulduğu bir ...

<table><tbody><tr><td>Yumurtalar</td><td>Hayvan</td><td></td><td></td><td>Döllenmiş, E2-2.5 (~ St. 17 HH)</td></tr><tr><td>İnkübatör</td><td>Profi-I</td><td>Lyon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Çin Mürekkebi</td><td>Araç</td><td>Higgins</td><td></td><td>Steril PBS içinde %4'lük bir çözelti hazırlayın.</td></tr><tr><td>Steril PBS</td><td></td><td></td><td></td><td>Alternatif olarak, bir antikor kokteyli kullanılabilir</td></tr><tr><td>1ml şırınga</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>27G 1/2 iğneler</td><td>Araç</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td>90 derece açılı</td></tr><tr><td>Pens</td><td>Araç</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td>boyut 55</td></tr><tr><td>Hemostatlar</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon makasları</td><td>Araç</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500086</td><td>vannas, 8.5cm</td></tr><tr><td>Parafilm bant</td><td></td><td></td><td></td><td>yumurtaları mühürlemek için</td></tr><tr><td>Tungsten Prob</td><td>Araç</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62091</td><td>Araç #24. Sap opsiyoneldir.</td></tr></tbody></table>

erken evre tavuk embriyolar büyüme faktörü-kaplı boncuk yerleştirme

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

Nöral tüp gelişimi sırasında özel Spatiotemporal desen birçok proteinleri ifade eder. Bu proteinler, hücre kaderinin belirlenmesi, hücre göçü ve nöral devrelerin oluşumu için kritik olduğu gösterilmiştir. Nöronal indüksiyon ve desenlendirme, diğerlerinin yanı sıra, kemik morfogenetik proteini (BMP), sonik kirpi (SSH), fibroblast büyüme faktörü (FGF), içerir. Özellikle, Fgf8 ifade deseni BMP4 ve SSH ifade bölgelere yakınlığı. Bu ifade, desen telencephalon desenlendirme kolaylaştırmak gelişimsel etkileşimler ile tutarlıdır. Burada bir yöntem ovo hazırlık önbeyin oluşumunu FGFs etkilerini test etmek için kullanılabilir hangi bir görsel gösteri sağlar. Boncuk protein ile kaplı ve sürekli maruz kalma sağlamak için gelişmekte olan nöral tüp yerleştirilir. Prosedürü, küçük, özenle yerleştirilen boncuklar kullandığı için, bu minimal invaziv ve çeşitli boncuk tek bir nöral tüp içinde yerleştirilmesini sağlar. Ayrıca, yöntem embriyolar, daha olgun bir aşamada anatomi ve sinir dokusunda değişiklikleri belirlemek için analiz edilebilir, böylece sürekli gelişimi için olanak sağlar. Bu basit ama kullanışlı bir protokol gerçek zamanlı görüntüleme için izin verir. Endojen protein düzeyleri mekansal ve zamansal olarak sınırlı değişiklikler yapmak için bir araç sağlar.

Çeşitli büyüme faktörleri ve proteinler, hücre gelişimi sırasında farklı hücre kaderi almaya ikna etmek için etkileşim. Burada E2.5 civciv embriyolarının boncuk koyarak gelişimin farklı proteinler arasındaki etkileşimleri adresine ovo hazırlanmasında kullanımı göstermektedir.

Erken Evre Tavuk Embriyolar Büyüme Faktörü-Kaplı Boncuk yerleştirme

Sinir tüpü, gelişim sırasında birçok proteini spesifik spasyotemporal paternlerde eksprese eder. Bu proteinlerin hücre ... için kritik olduğu gösterilmiştir.

Raburn Lab'a hoş geldiniz. Ben Matt Korn, California Üniversitesi Irvine'deki Nörobiyoloji ve Davranış bölümündenim. Bugün bir yumurtayı alacağız, onu açacağız ve içine büyüme faktörüne batırılmış bir boncuk yerleştireceğiz.Yumurtanın başarılı bir şekilde hazırlanması, embriyonik gelişimin bu erken aşamasında birçok farklı doku tipinin kaderini değiştirmek için bir büyüme faktörü eklememize olanak tanıyacaktır. İkinci buçukuncu gün veya 17. evre. Tamam, şu an mikroskobun başındayız.Yumurtalarım ve tüm aletlerim hazır. Şimdi, bir yumurtayı buradan çekin; böylece bandımızın nerede olduğunu görebilirsiniz. Pencere mühürü.Elimde şöyle güzel, küçük bir donut var. Bu, sadece bir sanat mağazasından alabileceğiniz sanatsal kilden yapıldı. Ve şimdi, gerçekten kötü bir penset çifti alacağım.Bunlar uzun zamandır mevcut. Uç kısımları oldukça küt, ancak pencerenin açılabilmesi için bandı yeterince kaldırmak için harika çalışıyorlar. Bunları yerleştirebilirim.Bunu katlayıp yumurtayı ve arkasındaki pencereyi bu şekilde yerleştireceğim. Böylece örneği mikroskobun altına koyup her türlü manipülasyonu yapabilirim. Bu durumda boncukları kullanacağız ve şimdi Hindistan mürekkebini alacağım, Hindistan mürekkebi olmadan.Burada, biraz kenara kaymış küçük bir embriyo diski olduğunu görebilirsiniz. Yumurtayı döndürürsem, kanın burada bir daire oluşturmaya başladığı yeri görebilirim. Ardından, Hindistan mürekkebi yüklü iğnemi alabilirim.Şimdi yan tarafa geçeceğim ve diskin altına doğru ilerleyeceğim; burada bir embriyo var. Embriyonun siyah renk üzerindeki kontrastını görebilecek kadar, ancak çok fazla olmayacak şekilde yerleştirmek istiyorum. Ardından, embriyonun rostral kısmının öne bakması için bunu döndüreceğim.Burada görebileceğiniz bölge sefalon bölgesidir. Nöral tüp burada geri döner ve yaşını belirlememize olanak tanıyan bazı somitler mevcuttur. Yakınlaştırdığımda ise kalbin çok yavaş ama düzenli bir şekilde attığını görebiliyoruz, ki bu oldukça iyidir.Kalp oradaydı ancak atmıyordu. Bunun canlı bir örnek olup olmadığı konusunda biraz endişeli olmamız gerekecekti. Üzerinde belirgin bir kalın membran olmadığı için, doğrudan tungsten probuma geçebilirim.Burada ince bir membran var, embriyoya erişebilmek için onu kenara çekeceğim. Boncukları hem ön beyne hem de arka beyne yerleştiriyoruz. Bu sefer ön beyne odaklanacağım.Şimdi, oraya ulaşabilmek için bir membranı kesmem gerekiyor. Embriyolar daha gençken, sadece bir tungsten prob kullanarak nöral tüp üzerinden giriş yapabilirim ve böylece boncuğu yerleştirmek istediğim bölgeye erişebilirim. Şimdi tungsten probuma geçiyorum.Elimi sabitlemek için iki elimi birden kullanıyorum. Şimdi embriyoyu manevra ettireceğim. Boncuğu buraya yerleştirdiğimde, onu doğrudan nöral tüpün içine ve ön beyne kadar ilerletebilirim.Tamam, embriyoyu açtığıma göre, artık hazırlığını yapıp boncuğu yerleştirebilirim. Yapacağım işlem, probumu biraz daha derine sokup nöral tüpü açmak olacak, bunu burada yaptığımı görebilirsiniz. Şimdi biraz daha yakına odaklanacağım.Burada odağı biraz değiştiriyorum. Orada güzel, küçük bir açıklık olduğunu görebilirsiniz, ancak kuyruk sefalonun olduğu yerin üzerine gerçek anlamda bir delik açmadım; çünkü boncuğun yerleşeceği yer tam orasıdır. Bu nedenle, boncuğun dışarı süzülebileceği bir delik istemiyorum.Biraz geride tutmak istiyorum, böylece boncuğu yerleştirip ileri doğru itebilirim. Şimdi bir boncuk alacağım. Birçok farklı boyutu olduğunu görebilirsiniz.Bunlar heparin akrilik ve PBS içerisindeler. Şimdi bir çift 55 pens alacağım. Gördüğünüz gibi PBS'nin içine girip beğendiğim bir tanesini seçeceğim.PBS'den çıkarıldığında, genellikle pensete yapışır, orada görülebilir. Boncukların üzerini kapatın. Yumurtamı geri getirin.Yumurtayı odağa getireceğim. Bu nedenle, boncuğu 55 numaralı pensle yaklaştıracağım. Pens üzerindeki konumu istediğimden biraz daha yukarıda ancak işte burada.Ve şimdi bunu, nöral tüpte açtığım deliğe doğru yönlendireceğim. Nöral tüpün içine girdiğinde, gelişmekte olan beynin ön kısmına doğru manipüle etmek kolaylaşır. Bu yüzden tungsten probumu alıp ileriye doğru iteceğim.Boncuğu sefalona yerleştirirken dikkatli olmanız gerekir; çünkü embriyo yaşlandıkça önce öne, ardından yana doğru bükülmeye başlayacaktır. Ön beyin bölgesindeki sefalona boncuk yerleştirirken, beyin dorsal bölgede, gaga ise embriyonun ventral kısmında oluştuğu için boncuğun genellikle gagaya doğru düşmesi durumuyla karşılaşılır. Ancak bu görüntü oldukça iyi görünüyor.Bundan oldukça memnun kaldım. 10 µL steril PBS içeren bir pipetle birkaç damla buraya ekleyeceğim. Tamam, şimdi yumurtayı kapatabiliriz.Şimdi yapacağım şey, pencereyi yukarı, buraya ve karşıya getirmek; yumurta henüz mühürlenmedi. Kurumasını önlemek için, kullandığımız bu plastik banttan bir parça keseceğim. Boyutu, pencereden sadece biraz daha büyük olacak.Biraz gereceğim ve pencerenin hemen üzerine yerleştirerek iyice oturduğundan emin olacağım. Böylece, albumin boşaltılırken veya pencere açılırken oluşturduğumuz deliklerin tamamı kapatılmış olur. Artık yumurta mühürlenmiş durumda, albumin kaybedemez ve kurumaz.Normal şekilde yaşlanabilmelidir. Boncuk yerleştirme işlemi bu kadardı. Civciv deneylerinizde başarılar dilerim, umarım istediğiniz sonuçları alırsınız.

placing-growth-factor-coated-beads-on-early-stage-chicken-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, gelişmekte olan serebral korteksin eksplantlar, büyüme faktörü ile kaplı boncuklar, hazırlanması ve yerleştirilmesi için iki yöntem gösteriyor. Bu boncuklar önbeyin eksplantlar sinir dokusu gibi gelişmekte olan mekansal sınırlı gen ekspresyonu ikna etmek için kullanılabilir. Yöntemleri Affi-Gel boncuk ve heparin akrilik boncuklar kullanarak verilmiştir.

Dorsal önbeyin eksplantlar Büyüme Faktörü-Kaplı Boncuk Yerleştirme

Bu video Yeni kültür, civciv embriyolarının 24 saat kadar yumurta dışında kültür olan bir yöntem gösteriyor. Bu yöntem, erken gelişme (14 som ilkel bir çizgi.) Fare E7-9 karşılık gelen bir süre çalışma sağlar. In situ hibridizasyon ve immünohistokimya, bu tekniğin Uygulamaları elektroporasyon içerir.

Erken Civciv Embriyolar ex vivo (Kültür) Kültür Yöntemi

Erken Civciv Embriyo morfogenetik Doku deformasyonlar Takibi

Bıldırcın-chick kimerik embriyo kuş nöral krest hücrelerinin göç ve nihai kaderi analiz etmek için bir yaklaşım tarif edilmiştir. Bu yöntem, aksi ayarlanmamış bir civciv embriyo içinde ayırt etmek zor göç ve farklılaşma sırasında nöral krest hücrelerinden izlemek için basit ve kolay bir tekniktir.

Çapraz türler Nakli Sinir Crest Göç ve Farklılaşma Analiz

Gelişim sırasında tavuk embriyosunu görüntülemek ve ona erişmek zor olabilir. Basit, uygun maliyetli ve bir sınıfta veya araştırma ortamında kolayca kullanılabilecek bir ex ovo yöntemi geliştirdik. Bu yöntem, embriyonik gelişimin geç aşamalarına kadar embriyoya erişim sağlar (HH 40).

Optimize Ex-ovo Kalkınma Gelişmiş Aşamaları Chick Embriyolar ekimi

Burada damar içi DiI enjeksiyonu ile birlikte civcivGFP nöral tüp intraspsi greftleme kullanılarak nöral kret hücrelerinin ve kan damarlarının çift etiketlendiğini bildiriyoruz. Bu deneysel teknik, organogenez sırasında NCC türevi (enterik) sinir sisteminin ve vasküler sistemin gelişimini aynı anda görselleştirmemizi ve incelememizi sağlar.

ChickGFP Nöral Tüp Greftleme ve Karbosiyanine Boya DiI Enjeksiyonu Kullanılarak Tavuk Embriyoları İçinde Nöral Kret Hücrelerinin ve Kan Damarlarının Çift Etiketlenimi

Büyüme faktörlerine veya sinyal yollarının spesifik inhibitörlerine batırılmış boncukları gelişmekte olan embriyolara aşılayarak, etkilerini in vivo olarak doğrudan test etmek mümkündür. Bu protokolde, bu moleküllerin gen ekspresyonu ve sinyal iletimi üzerindeki etkilerini belirlemek için boncuklar uzuv tomurcuğuna aşılanır.

Gen İfade Etkileyen Sinyal İletimi Pathways tanımak Tavuk Embriyo uzuvlar Geliştirme içine Boncuk eklenme

Ekstremite oluşumu için gerekli olan civciv embriyosunda ana gövde ekseni ve yan dokuları arasındaki indüksiyon olaylarını engellemek için geçirimsiz bariyerler kullanan protokoller anlatılmaktadır. Aday indüktif sinyallere batırılmış boncuklar, bariyer yerleşiminin etkisinin üstesinden gelmek için kullanılır ve gen ekspresyonunun analizi bunu doğrular.

Aday Faktörü Soaked Boncuk ile birlikte Geçirimsiz Engelleri Uygulama Chick Endüktif Sinyalleri Eğitim için

Burada, iletilen ışık ve floresan mikroskobu kullanarak hızlandırılmış görüntüleme için civciv embriyolarını ex ovo kültürlemek için yeni bir teknik sunuyoruz. Batık filtre kağıdı sandviçi, sıvı bir kültür ortamına tamamen batırılmış civciv embriyolarının kültürlenmesine izin veren, iyi bilinen filtre kağıdı taşıyıcı tekniğinin1 bir çeşididir.

Uzun vadede bir Batık Filtre Kağıdı Sandviç Ex Ovo Time-lapse Görüntüleme

Bu yöntemde, embriyonik kalp dokuları cerrahi olarak microdissected, ayrışmış, fluorescently etiketli ve ana bilgisayar embriyonik dokuların implante vardır. Bu kişi veya doku düzeyinde gelişimsel organizasyon ektopik hemodinamik koşullar ve/veya değiştirilmiş parakrin/juxtacrine ortamlar altında eğitimi için bir platform sağlar.

Embriyonik Cardiomyocytes kuş embriyo implantasyonu Vivo için Mikroenjeksiyon tabanlı sistem

Islatılmış boncuk testi, hücre farklılaşmasının ve morfogenezinin düzenlenmesini incelemek için herhangi bir gelişimsel zaman noktasında test reaktifinin hedeflenmiş olarak verilmesini içerir. Üç farklı tipte ıslatılmış boncuk hazırlamak ve bunları bir tavuk embriyosunun ara rakamlarına implante etmek için herhangi bir deneysel hayvan modeline uygulanabilir ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır.

Islatılmış Boncuk Tahlili Kullanılarak Tavuk Embriyogenezi Sırasında Hücre Farklılaşması, Morfogenez ve Desenleme Analizi

Öğrenin, büyüme faktörü kaplı boncuk yerleştirme yöntemiyle erken evre tavuk embriyolarında hücre kaderini nasıl değiştirebilirsiniz. Bu teknik gelişim biyolojisi ve nörobiyoloji araştırmaları için değerlidir.

Erken Evre Tavuk Embriyolar Büyüme Faktörü-Kaplı Boncuk yerleştirme

Daha fazla video keşfet