Name: Ile Enfekte Fare Bakteriyel Yük ve Bağışıklık Yanıtları Ölçüm Listeria monocytogenes /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 50 s
Description: Öğrenin, Listeria monocytogenes ile enfekte farelerde bakteriyel yük ölçümü ve bağışıklık yanıtlarını karakterize etme yöntemini. Bu teknik, karaciğer ve dalaktan tek hücreli süspansiyonlar hazırlayarak FACS analizi ile immün hücre dinamiklerini inceler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, tavsiye ve reaktifler için Anna Walduck Christina Cheers, Stuart Berzins, Dale Godfrey, Yifan Zhan ve Jonathan Wilksch teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Juvenil Diyabet Araştırma Vakfı (1-2008-602) ve Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (575.552) tarafından finanse edildi. KB, bir Avustralyalı Lisansüstü Ödülü tarafından desteklenmektedir. OW Avustralya Ulusal Sağlık Medikal Araştırma Konseyi, bir RD Wright Kardeşliği tarafından desteklenmektedir.

<ol><li>Wing, E. J., Gregory, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes%3A+clinical+and+experimental+update%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes: clinical and experimental update.</a> J Infect Dis. 185, Suppl 1. S18-S24 (2002).</li>
<li>Conlan, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+host-pathogen+interactions+in+the+liver+and+spleen+during+systemic+murine+listeriosis%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Early host-pathogen interactions in the liver and spleen during systemic murine listeriosis: an overview.</a> Immunobiology. 201, 178-187 (1999).</li>
<li>Neuenhahn, M., Busch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+functions+of+splenic+CD8alpha%2B+dendritic+cells+during+infection+with+intracellular+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">Unique functions of splenic CD8alpha+ dendritic cells during infection with intracellular pathogens.</a> Immunol Lett. 114, 66-72 (2007).</li>
<li>Cousens, L. P., Wing, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+defenses+in+the+liver+during+Listeria+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Innate defenses in the liver during Listeria infection.</a> Immunol Rev. 174, 150-159 (2000).</li>
<li>Hamon, M., Bierne, H., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes%3A+a+multifaceted+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes: a multifaceted model.</a> Nat Rev Microbiol. 4, 423-434 (2006).</li>
<li>Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+to+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune responses to Listeria monocytogenes.</a> Nat Rev Immunol. 4, 812-823 (2004).</li>
<li>Cheers, C., McKenzie, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+and+susceptibility+of+mice+to+bacterial+infection%3A+genetics+of+listeriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Resistance and susceptibility of mice to bacterial infection: genetics of listeriosis.</a> Infect Immun. 19, 755-762 (1978).</li>
<li>Garifulin, O., Boyartchuk, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+as+a+probe+of+immune+function%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Funct+Genomic+Proteomic%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes as a probe of immune function.</a> Brief Funct Genomic Proteomic. 4, 258-269 (2005).</li>
<li>Gervais, F., Stevenson, M., Skamene, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+resistance+to+Listeria+monocytogenes%3A+regulation+of+leukocyte+inflammatory+responses+by+the+Hc+locus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Genetic control of resistance to Listeria monocytogenes: regulation of leukocyte inflammatory responses by the Hc locus.</a> J Immunol. 132, 2078-2083 (1984).</li>
<li>Gervais, F., Desforges, C., Skamene, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C5-sufficient+A%2FJ+congenic+mouse+strain.+Inflammatory+response+and+resistance+to+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The C5-sufficient A/J congenic mouse strain. Inflammatory response and resistance to Listeria monocytogenes.</a> J Immunol. 142, 2057-2060 (1989).</li>
<li>Boyartchuk, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multigenic+control+of+Listeria+monocytogenes+susceptibility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Multigenic control of Listeria monocytogenes susceptibility in mice.</a> Nat Genet. 27, 259-260 (2001).</li>
<li>Boyartchuk, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+resistance+locus+sst1+controls+innate+immunity+to+Listeria+monocytogenes+infection+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The host resistance locus sst1 controls innate immunity to Listeria monocytogenes infection in immunodeficient mice.</a> J Immunol. 173, 5112-5120 (2004).</li>
<li>Pan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ipr1+gene+mediates+innate+immunity+to+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ipr1 gene mediates innate immunity to tuberculosis.</a> Nature. 434, 767-772 (2005).</li>
<li>Garifulin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Irf3+polymorphism+alters+induction+of+interferon+beta+in+response+to+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Irf3 polymorphism alters induction of interferon beta in response to Listeria monocytogenes infection.</a> PLoS Genet. 3, 1587-1597 (2007).</li>
<li>Hof, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+of+different+strains+of+Listeria+monocytogenes+serovar+1%2F2a%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Microbiol+Immunol+%28Berl%22%5BJournal%5D)">Virulence of different strains of Listeria monocytogenes serovar 1/2a.</a> Med Microbiol Immunol (Berl. 173, 207-218 (1984).</li>
<li>Wollert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+the+host+range+of+Listeria+monocytogenes+by+rational+protein+design%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design.</a> Cell. 129, 891-902 (2007).</li>
<li>Lecuit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+model+for+listeriosis%3A+role+of+internalin+in+crossing+the+intestinal+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A transgenic model for listeriosis: role of internalin in crossing the intestinal barrier.</a> Science. 292, 1722-1725 (2001).</li>
<li>Marco, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetration+of+Listeria+monocytogenes+in+mice+infected+by+the+oral+route%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Pathog%22%5BJournal%5D)">Penetration of Listeria monocytogenes in mice infected by the oral route.</a> Microb Pathog. 23, 255-263 (1997).</li>
<li>Busch, D. H., Vijh, S., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+model+for+infection+with+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Animal model for infection with Listeria monocytogenes.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter. 19, 19-19 (2001).</li>
<li>Neuenhahn, M., Schiemann, M., Busch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCs+in+mouse+models+of+intracellular+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">DCs in mouse models of intracellular bacterial infection.</a> Methods Mol Biol. 595, 319-329 (2010).</li>
<li>Conlan, J. W., North, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+are+essential+for+early+anti-Listeria+defense+in+the+liver%2C+but+not+in+the+spleen+or+peritoneal+cavity%2C+as+revealed+by+a+granulocyte-depleting+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Neutrophils are essential for early anti-Listeria defense in the liver, but not in the spleen or peritoneal cavity, as revealed by a granulocyte-depleting monoclonal antibody.</a> J Exp Med. 179, 259-268 (1994).</li>
<li>Czuprynski, C. J., Brown, J. F., Wagner, R. D., Steinberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+antigranulocyte+monoclonal+antibody+RB6-8C5+prevents+expression+of+acquired+resistance+to+Listeria+monocytogenes+infection+in+previously+immunized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Administration of antigranulocyte monoclonal antibody RB6-8C5 prevents expression of acquired resistance to Listeria monocytogenes infection in previously immunized mice.</a> Infect Immun. 62, 5161-5163 (1994).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Listeria, hücre içi bakterilere karşı konakçı immün yanıtlarının karakterize edilmesi için en yaygın kullanılan organizmalardan biridir6. Burada sunulan protokol, belirli bir farenin aynı dokusu içinde bakteriyel yükün ve immün hücre yanıtlarının ölçülmesine olanak tanır. Her enfekte fare için belirli bir dokudan elde edilen bu ikili ölçüm, fare kohortları (farklı fare suşlarını veya enfeksiyon sonrası farklı zaman noktalarını temsil eden) içinde ve arasında daha güçlü karşılaştırmalar yapılmasını sağlar. Farelerde immün yanıtları incelemek için oral uygulama yoluyla Listeria enfeksiyonu da kullanılabilse de, intravenöz enjeksiyon yoluyla enfeksiyon genellikle şu nedenlerle tercih edilir: 1) kan dolaşımına hızlı ve etkili iletimi sağlar; 2) senkronize ve tutarlı bir sistemik enfeksiyonla sonuçlanır ve 3) Mus türü, E-kadherin reseptörünü kodlayan gende, oral uygulama yoluyla Listeria enfeksiyonunu sınırlayan bir mutasyona sahiptir (bu mutasyon, Listeria'nın fare E-kadherin reseptörüne bağlanma ve gastrointestinal sistemin epitelyal astarını etkili bir şekilde geçme yeteneğini etkiler)16-18.
Bu protokolde birkaç kritik adım bulunmaktadır. İlk olarak, canlılığın ve virülansın sağlanması için Listeria inokulum stoğu, taze bir gece boyu bekletilmiş HBA kültüründen üretilmelidir. İkinci olarak, enjekte edilen ilk ve son fare arasında CFU konsantrasyonunun büyük farklılıklar göstermediğinden emin olmak için, tüm farelere enjeksiyon yapmadan önce ve yaptıktan sonra inokulumun CFU konsantrasyonunun doğru bir şekilde belirlenmesi önemlidir. Üçüncü olarak, Listeria enjeksiyonu tüm farelerin kuyruk venine tutarlı bir şekilde uygulanmalıdır. Son olarak, periferik kanda dolaşan lökositlerin değil, karaciğer içindeki bağışıklık hücrelerinin doğru ölçümünü sağlamak amacıyla, yerleşik olmayan lökositleri uzaklaştırmak için karaciğerin perfüze edilmesi gereklidir. Tüm bu adımların başarısız şekilde uygulanması, Listeria ile enfekte edilen bireysel fareler arasında bakteriyel yük ve/veya bağışıklık yanıtlarında istenmeyen değişkenliklere yol açabilir.
Bu protokolün iki kısıtlılığı, araştırmacının farelere intravenöz enjeksiyon yoluyla enfeksiyon bulaştırma becerisi ve dokulardaki bakteriyel yükün saptanmasıdır. Eğer bir kişi çok sayıda fareye enjeksiyon yapıyorsa, dondurulmuş inokülüm çözüldükten sonra Listeria canlılığı (yani CFU konsantrasyonu) zamanla azalabilir (örneğin, ilk ve son fareye enjeksiyon arasında &gt;2 saat geçtiğinde). İnokülüm bozulmadan önce kaç fareye enjeksiyon yapabileceğini belirlemek araştırmacının sorumluluğundadır. Bu yöntemin bir diğer kısıtlılığı ise, kültüre edilen doku homojenat miktarının nispeten düşük olması nedeniyle Listeria yükünün organ başına 100CFU'nun altında doğru şekilde ölçülememesidir (örneğin, Şekil 3'te saptama sınırının organ başına 100CFU olduğu belirtilmiştir). CFU/organ için daha düşük değerleri daha doğru ölçmek amacıyla, dokunun daha büyük bir kısmının Listeria saptaması için örneklenmesi için daha fazla miktarda doku homojenatı kültüre edilebilir (plaka başına 0,5mL'ye kadar, birden fazla plaka kullanılabilir). Eğer bir Stomacher mevcut değilse, 7.1-7.2 adımları için doku homogenizörü kullanmak gibi alternatif doku homojenizasyon yöntemleri tercih edilebilir. Pratik bir not olarak, enfekte farelerden alınan doku örneklerini kültüre etmek için 37°C'lik inkübatörde yer kısıtlıysa, HBA kültür plakaları oda sıcaklığında 2-3 gün boyunca inkübe edilebilir (koloniler oda sıcaklığında daha yavaş büyür). Ancak, dondurulmuş Listeria stoklarının hazırlanması için kültür büyütülürken oda sıcaklığı kullanılmamalıdır.
Bu protokol, farelerde Listeria enfeksiyonunun karakterizasyonu için temel bir yaklaşım sunmaktadır ve EGD dışındaki diğer Listeria suşları ile de kullanılabilir. Karaciğer ve dalağa ek olarak, lenf düğümlerinden tek hücreli süspansiyonlar da üretilebilir. Her iki durumda da, bu tek hücreli süspansiyonlar, immün hücre alt kümelerinin ölçümü ve ayrıştırılmış immün hücrelerin in vitro stimülasyonu dahil olmak üzere çeşitli analizler için kullanılabilir. Temel teknikler kavrandıktan sonra bu protokol, Listeria-spesifik T hücrelerini izole etmek19, dendritik hücreleri karakterize etmek20 veya Listeria enfekte farelerdeki immün yanıtı daha kapsamlı bir şekilde karakterize etmek amacıyla enfeksiyondan sonraki belirli zaman noktalarında immün hücre depleksiyomu gerçekleştirmek21,22 için de modifiye edilebilir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> At kanlı agar baz No.2 </td><td> Oxoid </td><td> CM0271 </td><td> HBA plakalar için agar tabanının hazırlanması </td></tr><tr><td> At kan (defibrine) </td><td> Oxoid </td><td> HB1000 </td><td> Agar baz% 5-10 </td></tr><tr><td> Beyin kalp infüzyonu (BHI) suyu (10 ml) </td><td> Oxoid </td><td> TM456 </td><td></td></tr><tr><td> Beyin kalp infüzyon susuz medya </td><td> Oxoid </td><td> CM1135 </td><td></td></tr><tr><td> 96-düz alt plakası </td><td> BD Biosciences </td><td> 353072 </td><td></td></tr><tr><td> 70 mikron hücre süzgecinden </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Küçük petri </td><td> BD Biosciences </td><td> 351007 </td><td></td></tr><tr><td> Stomacher 80 Biomaster laboratuarı sistemi </td><td> Seward </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Plastik Stomacher çanta </td><td> Sarstedt </td><td> 86 9924 530 </td><td></td></tr><tr><td> Sığır serum albumini </td><td> Sigma </td><td> A3912 </td><td></td></tr><tr><td> FACS tampon </td><td></td><td></td><td> % 0,1 (w / v) PBS içinde sığır serum albumin </td></tr><tr><td> İzotonik Percoll (33.75% Percoll PBS içinde) </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-01 </td><td> 33.75mL Percoll 3.75mL 10x PBS, 62.5mL 1x PBS 100 ml izotonik Percoll yapar </td></tr><tr><td> TAC Tampon </td><td></td><td></td><td> 17mm Tris, distile su ile 140 amonyum klorür </td></tr><tr><td> FCS / EDTA tampon </td><td></td><td></td><td> 10mM EDTA ile fetal buzağı serumu </td></tr><tr><td> FACS / EDTA tampon </td><td></td><td></td><td> FACS tampon + 5mM EDTA </td></tr><tr><td> Tripan mavi </td><td> Sigma </td><td> T6146 </td><td> PBS içinde% 0.4 (w / v), filtre steril </td></tr><tr><td> 2mL Cryovial </td><td> Greiner Bio One </td><td> 121263 </td><td></td></tr><tr><td> 27 gauge/1mL insülin enjektörü </td><td> Terumo Tıbbi Ürünler </td><td> SS10M2713 </td><td></td></tr><tr><td> Iğne </td><td> Terumo Tıbbi Ürünler </td><td> NN-2516R (25G 5/8in) NN-2613R (26g 1/2in) </td><td></td></tr><tr><td> Şırınga </td><td> Terumo Tıbbi Ürünler </td><td> SS-01T (1 ml), SS-053 (5ml), SS-10S (10 ml) </td><td></td></tr></tbody></table>

ile enfekte fare bakteriyel yük ve bağışıklık yanıtları Ölçüm listeria monocytogenes</em

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) Gram-pozitif fakültatif hücre içi bir patojen 1. Fareler üzerinde yapılan çalışmalarda genellikle intravenöz enjeksiyon Listeria istihdam, sistemik enfeksiyon 2 sonuçlanır. Enjeksiyondan sonra, Listeria CD8α + dendritik hücreleri ve Kupffer hücreleri 3,4 alımı nedeniyle dalak ve karaciğer hızla yaymaktadır. Bir kez fagosite, çeşitli bakteriyel proteinler, phagosome kaçmak, sitoplazmada içinde hayatta ve komşu hücreleri enfekte 5 Listeria sağlar . Enfeksiyon ilk üç gün boyunca, farklı doğuştan gelen bağışıklık hücreleri (örneğin monositler, nötrofil, NK hücreleri, dendritik hücreler) Listeria çoğalması en aza indirmek bakterisidal mekanizmalar aracılık. CD8 + T hücreleri, daha sonra işe ve nihai temizlenmesi için genellikle 10 gün enfeksiyonu 6 içinde ev sahibi, Listeria sorumludur . Başarılı klerensi enfekte olmuş fareler Listeria konağın immün yanıtları 6 uygun başlangıçlı bağlıdır. Kendilenmiş fare suşlarının 7,8 arasından geniş bir hassasiyetleri vardır. Genellikle, Listeria enfeksiyonuna yatkınlığı olan farelerin daha az dayanıklı farelere kıyasla artmış bakteri yükü ve / veya gecikmiş boşluk gösteren bakteri çoğalması kontrol edebiliyoruz . Bağlantı analizleri ve nakavt fare suşları da dahil olmak üzere genetik çalışmalar, çeşitli gen dizisi varyasyon Listeria enfeksiyonu 6,8-14 ev sahipliği yanıtları etkiler var. Bu nedenle, farklı fare suşları arasında enfeksiyon kinetiği belirlenmesi ve karşılaştırılması Listeria karşı bağışıklık yanıtlarını katkıda konak genetik faktörlerin belirlenmesi için önemli bir yöntemdir. Konakçı tepkileri farklı Listeria suşlarının karşılaştırılması da antibiyotik tedavisi ya da aşısı tasarımı için potansiyel hedefler olarak hizmet verebilir bakteriyel virülans faktörleri tanımlamak için etkili bir yoldur . Biz burada bakteri yükü (koloni oluşturan birim [CFU] başına doku) ölçme ve Listeria ile enfekte farelerde bağışıklık yanıtları FACS analizi için karaciğer ve dalak tek hücre süspansiyonlarının hazırlanması için basit bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem ilk romanı fare suşlar Listeria enfeksiyonu karakterizasyonu, yanı sıra bağışıklık yanıtlarını, Listeria ile enfekte olan farklı fare suşları arasında karşılaştırma için özellikle yararlıdır . Biz, kan agar kültür, β-hemoliz 1 (Şekil 1) nedeniyle her koloninin çevresinde karakteristik bir hale bölge sergiler suşu 15 EGD Listeria monocytogenes kullanın. Bakteriyel yük ve bağışıklık yanıtlarını aşağıda açıklanan protokolleri kullanarak FACS analizi için kan agar plakalarını ve doku hücre süspansiyonlarının hazırlanması kültür dokusu Homojenat enfeksiyonu sonra herhangi bir zaman noktasında tespit edilebilir. Biz, immün sistemi baskılanmış veya hamile bireyler Listeria işlemez gerektiğine dikkat cekti ve ilgili kurumsal biyogüvenlik komitesi ve hayvan tesis yönetimi, işe başlanmadan önce danışılmalıdır .

Listeria monocytogenes farelerde bağışıklık yanıtlarını ve genetik yatkınlık bakterilerin hücre içi eğitim için bir model organizmadır. Bu yöntem, bakteri yükü ölçmek ve Listeria enfeksiyonu nedeniyle bağışıklık hücreleri değişiklikleri belirlemek için FACS analiz için farelerin karaciğer ve dalak tek hücre süspansiyonları oluşturmak için bir olanak sağlar.

Ile Enfekte Fare Bakteriyel Yük ve Bağışıklık Yanıtları Ölçüm Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria), Gram-pozitif, fakültatif intraselüler bir patojendir1. Fare çalışmaları tipik olarak ... intravenöz enjeksiyonunu kullanmaktadır.

Bu video, fare karaciğeri ve dalağından bakteriyel yükün ölçülmesi ile tek hücreli süspansiyonların oluşturulması ve analiz edilmesi için kullanılan bir yöntemi göstermektedir. İlk olarak, bir listeria inokülümü hazırlanır ve farelere intravenöz olarak enjekte edilir. Ardından, seçilen zaman noktalarında ötanize edilen farelerden kan, karaciğer ve dalak örnekleri toplanır.At kanı agar plaklarında kültüre edilen AC'den elde edilen doku homojenatları ve hasatlanmış dokulardan tek hücreli süspansiyonlar hazırlanır. Elde edilen hücre süspansiyonları, canlılık ve bağışıklık hücresi içeriği açısından fax analizi ile incelenebilirken, bakteriyel yük koloni oluşturan birimler temel alınarak belirlenir. Bu yöntem, enfekte organlardaki bakteri yükünü aynı anda belirlerken, duyarlı ve dirençli mal suşları arasındaki farklar gibi steroid enfeksiyonuna verilen bağışıklık yanıtlarının karakterize edilmesine yardımcı olabilir.Bu prosedüre, listeria inokülümünü istenen konsantrasyonda hazırlayarak başlayın; listeria kültürü, saklanması ve hazırlanmasına ilişkin talimatlar ekteki yazılı protokolde yer almaktadır. İnokülüm hazır olduğunda, 1:10 dilüsyon hazırlamak için 100 µL'lik iki alikotu, 900 µL PBS içeren steril mikro füze tüplerine aktarın, ardından her bir dilüsyondan 100 µL'yi at sığır kanlı agar (HBA) plaklarına aktarın ve koloni oluşturan birim (CFU) sayımlarını gerçekleştirmek için steril bir yayma çubuğu ile iyice yayın; daha sonra plakları 37 °C'de, ters çevrilmiş şekilde gece boyunca inkübe edin. Sonrasında, fareleri temiz bir kafese aktarın.Kuyruk veninin genişlemesini sağlamak için kafesi 250 watt'lık bir kızılötesi lambanın 50 santimetre altına beş dakika boyunca yerleştirin. Bu işlem, enjeksiyon sırasında daha iyi bir görselleştirme sağlar; burada, listeria'yale dirençli fare suşu C 57 black six ve listeria'ya duyarlı fare suşu BALB/c enjekte edilecektir. Tüpü birkaç kez ters çevirerek listeria süspansiyonunu nazikçe karıştırın.Ardından, fare başına 200 µL enjekte etmek için 27 gauge iğneli bir mililitrelik bir şırınga doldurun. Enjeksiyondan önce şırıngadaki tüm hava kabarcıklarının dışarı atıldığından emin olun. Fareyi bir sabitleme cihazına yerleştirin.Ardından, önce dorsal tarafın ortasında bulunan kuyruk arterini belirleyerek farenin lateral kuyruk venini bulun. Sonra veni tespit etmek için kuyruğu hafifçe lateral tarafa çevirin. Kuyruğu %70 etanolle ıslatılmış bir mendille nazikçe silin ve şırıngayı geri çektikten sonra enjeksiyonu gerçekleştirin.Giriş yarasına steril bir gazlı bezle kısa süreli baskı uygulayın. Enjeksiyondan sonra siyah renkli farelerde kuyruk venini tanımlamanın çok daha zor olduğunu unutmayın. Tüm fare plakası enjekte edildikten sonra fareyi kafesine geri koyun ve koloni oluşturan birim sayımları için geri kalan inokülumu inkübe edin.Bir önceki günde olduğu gibi, koloni sayısını sayın ve listeria inokulumunun enjeksiyon öncesi ve sonrası konsantrasyonlarını belirleyin. Burada gösterilen, tekil kolonileri çevreleyen karakteristik hale beta hemolizden kaynaklanmaktadır. Enjeksiyon öncesi ve sonrası sayımlar belirlendikten sonra, enjeksiyon öncesi ve sonrası koloni oluşturan birim sayılarını toplayıp ikiye bölerek ortalama koloni oluşturan birim sayısını hesaplayın.Son olarak, enjeksiyondan sonraki çeşitli zaman noktalarında, ötenazi yapılan farelerden kan toplayın ve karaciğer ile dalağı alın. Eğer faks analizi yapılacaksa, kanı uzaklaştırmak için karaciğer çıkarılmadan önce perfüze edilmeli, ötenaziden hemen sonra kardiyak kanama gerçekleştirilmeli ve uygun bir toplama tüpüne mümkün olduğunca fazla kan toplanmalıdır. Karaciğeri perfüze etmek için öncelikle abdominal boşluğu açın, safra kesesini çıkarıp atın.Vena cava inferior, omurgaya paralel seyreden ve karaciğer dahil vücudun alt kısmından kalbe kan taşıyan bir toplardamardır. Perfüzyon sıvısının çıkışı için bir çıkış kanalı oluşturmak amacıyla, bir makas kullanarak toplardamarı kalbin hemen altından kesin. Ardından, karaciğer loblarını başa doğru çevirin ve karaciğerin alt kısmına giren hepatik portal veni açığa çıkarmak için bağırsakları sağa doğru itin.Sağ alt taraftan, hepatik portal vene kıvrılmış yarım inç uzunluğunda 26 gauge bir iğne yerleştirin ve 10 mililitre PBS enjekte edin. Bir ila iki mililitre PBS enjekte edildikten sonra karaciğer, koyu kırmızı renkten açık kahverengiye dönecektir. Enjekte edilen solüsyon, kesilmiş inferior vena cava'dan çıkacaktır. Karaciğer perfüzyonu, toplanan hücrelerin dolaşımdaki kandan değil, karaciğerden gelmesini sağlar.Ardından, perfüze edilmiş karaciğeri farenin vücut boşluğundan çıkarın ve buz üzerindeki facts tamponu tüpüne daldırın. Sonra dalağı çıkarın ve bir sonraki bölümde açıklanan benzer şekilde işlemek üzere buz üzerine yerleştirin. Karaciğerden tekli hepatik hücre süspansiyonları elde etmek için, perfüze edilmiş karaciğeri fax tamponundan 60 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirilmiş 70 mikronluk bir hücre süzgecine aktararak başlayın.Beş litrelik bir şırınga pistonu kullanarak, dokuyu hücre süzgecinden geçirip Petri kabına itin. Tek hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik konik vidalı kapaklı bir tüpe aktarın ve soğuk fax tamponu ile toplam hacmi 40 mililitreye tamamlayın.Hücre süspansiyonunu vorteksleyin. Ardından, bakteriyel yük tayini için bir mililitrelik bir alikot ayırın. Prosedürün ilerleyen aşamalarında, 50 mililitrelik tüpü santrifüje yerleştirin ve hücreleri 4 °C'de beş dakika boyunca 500 ×g ile döndürerek peletleyin.Süpernatantı attıktan sonra, pellet 40 mililitre soğuk fax tamponunda süspanse edilip santrifüjle çevrilerek bu yıkama adımı tekrarlanır. Pellet tekrar 20 mililitre izotonik per hole içinde oda sıcaklığında süspanse edilir ve hücre süspansiyonu oda sıcaklığında 12 dakika boyunca 700 ×g'de santrifüjlenir.Santrifüj işleminin ardından, hepatositlerden oluşan disk benzeri bir tabaka perolün üzerinde yüzecek ve lökositler tüpün dibinde tekrar çökecektir; hepatosit tabakasını ve perolü bir atık kabına dökerek uzaklaştırın. Ardından, lökosit içeren peleti, eritrositleri liz etmek için dört mililitre TAC tamponunda yeniden süspande edin ve hücreleri sık sık ters çevirerek oda sıcaklığında 10 dakikaya kadar inkübe edin. İnkübasyonun ardından, hücre süspansiyonunu 100 mikronluk bir naylon membran üzerinden yeni bir 10 mililitrelik santrifüj tüpüne filtreleyin.Filtrelenmiş hücre süspansiyonunun altına, burada gösterildiği gibi bir mililitre FACS EDTA tamponu ekleyin. Ardından, 4 °C'de beş dakika boyunca 350 ×g'de santrifüjleyin. Döndürme işleminden sonra, beş mililitre FACS EDTA tamponu ile tekrar süspanse edin, ardından tekrar döndürün ve peleti, peletin boyutuna bağlı olarak 0,5 ila 3 mililitre FACS EDTA tamponu içinde yeniden süspanse edin; canlı hepatik lökosit sayısını, trypan blue dışlama yöntemine dayalı bir hemositometre kullanarak belirleyin.Tek hücre süspansiyonları daha sonra istenen hücre yüzey belirteçlerine özgü antikorlarla işaretlenebilir ve FACS ile analiz edilebilir. Karaciğer ve dalak dokularından tek hücre süspansiyonları oluşturulduktan sonra, prosedürün bazı kısımları için bakteriyel yükler belirlenecektir. Sızıntıyı önlemek için ağzı kapalı bir stomacher torbası tutan bir stomacher cihazı, dokuyu homojenize etmek için kullanılacaktır.Temiz bir tezgah üzerinde düz bir şekilde yayarak başlayın. Doku torba içerisinde ezilene kadar üzerinde kalın, yuvarlak bir kalem gezdirin. Ezilmiş doku içeren her bir mide torbasına beş mililitre PBS ekleyin.Mideyi veya torbaları stomacher cihazına yerleştirin ve 10 dakika boyunca yüksek hızda çalıştırın. Stomacher cihazı, mideyi veya torbaları belirli bir hızda presleyen iki palete sahiptir; bu işlem içeriği tekdüze bir homogenata dönüştürür ve oluşabilecek aerosolleri hapseder. Ardından bir pipet kullanarak, torbadaki homogenatı karıştırın. Daha sonra, 300 µL'lik örnekleri çift paralel şeklinde 96 kuyucuklu düz tabanlı bir plakaya aktarın.96 kuyucuklu plaka kuyucukları içerisinde, 10⁻⁵ seyreltmeye kadar 1/10'luk seri seyreltme işlemi gerçekleştirin. Her bir doku homojenat örneği için, her seyreltmeden 0,1 mililitreyi önceden kurutulmuş bir HBA plakasına steril bir yayma çubuğu kullanarak dikkatlice yayın. Plakaları 37 °C'de gece boyunca inkübe edin.Ertesi gün, her dilüsyon için koloni oluşturan birim sayısını sayın ve doku dilüsyon faktörlerinin kısmını ve homojenat hacmini dikkate alarak doku başına düşen koloni oluşturan birim sayısını hesaplayın. C 57 black six farelerinin yaklaşık 2000 koloni oluşturan birim listeria ile enfekte edilip edilmediğine bakın; enfeksiyondan sonraki üçüncü ve yedinci günlerde fareler ötanize edilmiş, karaciğer perfüze edilmiş ve dalakla birlikte toplanmıştır. Bakteriyel yükü belirlemek için splenik homojenat veya hepatik tek hücre süspansiyonunun dilüsyonları HBA plaklarında kültüre edilmiştir.Burada gösterilen sonuçlarda, noktalı çizgi organ başına 100 koloni oluşturan birim düzeyindeki tespit sınırını belirtmektedir. Listeria yükünün üçüncü günde, yedinci güne göre daha yüksek olduğuna dikkat edin. Bunun sebebi, yedinci güne gelindiğinde çeşitli bağışıklık hücrelerinin listeria temizlenmesini sağlamasıdır.Bu iki dokuda, dalak ve karaciğerde, tek hücre süspansiyonları tripan mavisi ile boyanmış ve bir hemositometreye yüklenmiştir. Kırmızı kutu ile belirtilen sayım alanı içindeki hücreler sayılacaktır. Canlı olmayan hücreler tripan mavisini tutarak mavi görünecek, canlı hücreler ise boyanmamış kalacaktır.Burada gösterildiği üzere, solda sunulan dalaktaki canlı hücre sayısı ve sağda sunulan karaciğerdeki canlı lökosit sayısı enfeksiyon süresince artmaktadır. Bu artış, aktive olan, prolifere olan ve bu iki enfeksiyon bölgesine göç eden nötrofiller ve lenfositler dahil olmak üzere bağışıklık hücrelerinden kaynaklanmaktadır. Listeria enfeksiyonu seyri sırasındaki bağışıklık hücresi seviyelerine örnek olarak, temsili faks grafikleri ve CD eight pozitif T hücrelerinin sayısı burada gösterilmiştir.Spleende lenfopeni nedeniyle CD sekiz pozitif T hücrelerinin sayısı ikinci ve üçüncü günlerde geçici olarak azalır, ardından enfeksiyon sonrası beşinci günden itibaren hem spleende hem de karaciğerde belirgin şekilde artar. Bu prosedürün ardından, listeria enfeksiyonuna karşı verilen bağışıklık yanıtlarını daha ayrıntılı karakterize etmek için androjenlerin osilasyonu, antijene özgü T hücreleri ve ayrıştırılmış bağışıklık hücrelerinin fonksiyonel analizleri gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

measuring-bacterial-load-immune-responses-mice-infected-with-listeria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Lo, B. C. ve diğerleri. Kronik Salmonella enfeksiyonu bağırsak fibrozisine neden olmuştur. J. Vis. Exp. (2019)Video, streptomisin dirençli Salmonella typhimurium ile kronik enfeksiyonun fare modelinde bakteriyel yükün nicelendirilmesini gösteriyor. Ötenazi ve steril diseksiyondan sonra, çek ve dalak dokuları toplanır, bakteriler salınmak için çelik boncuklarla homojenleştirilir ve seri olarak seyreltilir. Sulandırmalar seçici agar'da kaplanır ve görünür koloniler sayılır; böylece...

Kronik bağırsak enfeksiyonu fare modelinde doku bakteriyel yükünün nicelendirilmesi

Kaynak: McMullen, P. D., Freitag, N. E. Listeria monocytogenes kullanılarak enfekte farelerde kültürde kardiyak hücrelerin bakteriyel invaziyası ve kalp kolonizasyonunun değerlendirilmesi. J. Vis. Exp. (2015)Bu video, bir farenin kuyruk damarına Listeria monocytogenes'in enjekte edilip sistemik enfeksiyon oluşturulmasını gösteriyor. Bakteriyel dolaşımı, organ kolonizasyonu ve dokuyu homojenleştirerek, seri seyreltme ve kaplama yoluyla kalpteki bakteri yükünün nicelendirilmesini gösterir.

Listeria monocytogenes'in kuyruk venine enjeksiyonu sonrası fare kalbinde bakteriyel yükün nicelendirilmesi

Source: Ahn, J. J., et al. Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (2016)The video demonstrates bacterial load measurement in spleen and liver tissues isolated from mice infected with an intracellular bacterial pathogen. Bacteria, accumulated within tissue-resident phagocytes during systemic infection, are released using detergent-based lysis and mechanical disruption. Serial dilutions of the homogenates are plated on...

Quantification of Bacterial Load in Mouse Spleen and Liver After Systemic Infection

Source: Ahn, J. J., et al., Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the preparation of mouse splenocyte cultures from Listeria monocytogenes-infected mice for downstream cytokine analysis. It includes ex vivo bacteria-derived antigen stimulation and sample processing to study T cell responses.

In Vitro Stimulation of Mouse Splenocytes with Heat-Killed Listeria monocytogenes

Bu video, Listeria monocytogenes ile enfekte olmuş perfüze fare beyninden enfektif bakteri yükünün niceliğinin ölçülmesini göstermektedir.

Listeria monocytogenes Enfeksiyonunu Takiben Bir Fare Beyninde Bakteriyel Kolonizasyonun Değerlendirilmesi

Bu kağıt kullanılarak farenin oral enfeksiyonu için yeni bir yöntemi...

Sözlü İletim<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Kirlenmiş Gıda Yutma ile Farelerde

Listeria monocytogenes gebelerde fetal enfeksiyonlara ve duyarlı popülasyonlarda menenjite neden olur.  Bakterilerin subpopulasyonları kalp dokusunu kolonize ederek hastalarda ve laboratuvar hayvanlarında miyokarditlere neden olabilir.  Burada L. monocytogenes kardiyak hücre invazyonunun in vitro ve enfekte hayvanlarda kardiyak kolonizasyonun nasıl değerlendirileceğini açıklayan bir protokol sunuyoruz.

Listeria monocytogenes Kullanarak Enfekte Farelerde Kültür ve Kalp Kolonizasyonunda Kardiyak Hücrelerin Bakteriyel İstilasının Değerlendirilmesi

Bu protokol, Listeria monocytogenes EGD suşu ile (L. monocytogenes) C57BL / 6J fareleri aşılamak için ve doğal öldürücü (NK) hücreleri, doğal katil T (NKT) hücreler tarafından interferon-y (IFN-γ) tepkilerini ölçmek açıklamaktadır ve adaptif T sonrası enfeksiyon lenfosit. Bu protokol ayrıca patojen modifiye LD 50 dozu ile enfeksiyondan sonra farelerde hayatta kalma çalışmaları yürütmek açıklamaktadır.

Deneysel Enfeksiyon<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Ana İnterferon-γ Yanıtları incelenmesi için Bir Model Olarak

Enfeksiyon sırasında Listeria Monositogenez beyin kolonize etmek kan - beyin bariyerini geçiş yapabiliyor. Bu protokol için organlara enfeksiyon farelerin takip bakteriyel kolonizasyon değerlendirmek nasıl gösterir. Beyin parankimi bakteriyel numaraları belirli tespiti için bütün organ perfüzyon gerçekleştirmek için bir yordam sağlanmıştır.

Listeria Monositogenez Enfeksiyon beyin

Biz faktörler ana bilgisayar kodlama faaliyetlerini analiz için kullanılan her iki tüp bebek ve içinde vivo enfeksiyonu deneyleri tarif.

Bakteriyel Pathogen sonda için hücresel ve Organismic düzeyi ana bilgisayar yanıt için kullanma

Burada etkinliği ve ana bilgisayar bağışıklık yanıtı aşı vivo içinde değerlendirilmesi için zarif bir iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralı eğitim viral, bakteriyel aşı modelleri veya paraziter patojenler için adapte edilebilir.

Ana bilgisayar-patojen yanıt ve aşı etkinliği farelerde değerlendirilmesi

Öğrenin, Listeria monocytogenes ile enfekte farelerde bakteriyel yük ölçümü ve bağışıklık yanıtlarını karakterize etme yöntemini. Bu teknik, karaciğer ve dalaktan tek hücreli süspansiyonlar hazırlayarak FACS analizi ile immün hücre dinamiklerini inceler.

Ile Enfekte Fare Bakteriyel Yük ve Bağışıklık Yanıtları Ölçüm Listeria monocytogenes

Daha fazla video keşfet