SARS-CoV-2'yi Görselleştirmek için İmmüno-RNA Floresan In Situ Hibridizasyonun Kullanılması

Sabit ve geçirgen koronavirüs ile enfekte olmuş Vero hücrelerini alın - interferon eksikliği olan bir memeli hücre hattı.

Konağın içinde, viral RNA, transkripsiyon yoluyla sentezlenen spesifik viral proteinleri kodlayan orta uzunlukta RNA molekülleri olan subgenomik veya sgRNA'lar olarak bulunur.

Hibridizasyon zincir reaksiyonu veya HCR başlatıcı probları ekleyin.

HCR probu, hedef RNA üzerindeki tamamlayıcı dizisine bağlanır.

Floresan etiketli oligonükleotid firkete probları, H-1 ve H-2'yi tanıtın.

Başlatıcı prob, tamamlayıcı H1 kuyruğuna bağlanarak firkete yapısını doğrusallaştırır.

Açıkta kalan H1 dizisi, tamamlayıcı H2 kuyruğuna bağlanır.

Takip eden H2 dizisi, bir H1 kuyruğuna bağlanmaya devam eder, hedef alanın etrafındaki floresan etiketli probları yükseltir ve sağlam bir sinyal üretir.

Konak hücre hücre iskeletini görselleştirmek için uygun antikorlar ekleyin.

DAPI kullanarak çekirdekleri boyayın.

Floresan mikroskobu altında, virüsle enfekte olmuş hücreler sitoplazmada kırmızı floresan gösterir ve bu da hedef RNA'nın varlığını gösterir.

Metin el yazmasında açıklandığı gibi hücreleri sabitledikten ve geçirgen hale getirdikten sonra, 1x PBS çözeltisini kuyulardan çıkarın ve her oyuğa en az 300 mikrolitre amplifikasyon tamponu ekleyin. Numuneleri oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. İstenilen hacmi ayrı tüplerde hızlı bir şekilde soğutarak her bir HCR saç tokasını hazırlayın.

300 mikrolitre amplifikasyon çözeltisi hazırlamak için her saç tokasından 18 pikamole kullanın. Saç tokası solüsyonunu tüplere aktarın ve 95 santigrat derecede 90 saniye inkübe edin. Ardından, karanlıkta 30 dakika oda sıcaklığına soğutun. Çıtçıtla soğutulmuş H1 ve H2 saç tokalarını amplifikasyon tamponuna ekleyerek bir saç tokası karışımı hazırlayın. Parafilm üzerine 30 ila 50 mikrolitre saç tokası karışımı damlatın ve numuneleri gece boyunca karanlıkta oda sıcaklığında inkübe edin.

Slaytları monte etmek için, iki adet 10 mikrolitrelik montaj ortamı damlasını bir slayt üzerine yerleştirin ve damlaların iki lamel üzerine tek bir lamel yerleştirilmesine izin verecek kadar ayrıldığından emin olun. Lamelleri temiz bir havluya vurarak fazla sıvıyı çıkarın. Ardından, hücreler aşağı bakacak şekilde solmaya karşı koruma sağlayan montaj ortamına yerleştirin. Monte edilen numuneleri karanlıkta kuru ve düz bir yüzeye yerleştirin ve kürlenmelerine izin verin.