Rat mezenter Anjiyogenez Testi

İsveç'teki Guttenburg şehri GaN Üniversite Hastanesi Patoloji Bölümüne hoş geldiniz. Ben Dr. Klaus Norby; şimdi izleyeceğiniz yöntem benim laboratuvarımda geliştirilmiştir. Hipoksi, solid tümörler veya diğer herhangi bir anjiyogenez hastalığı ile bağlantılı olarak gelişen klinik olarak anlamlı anjiyogenez, neredeyse tamamen doğal olarak vaskülarize olmuş dokularda meydana gelir. Yetişkin küçük kemirgenlerde, ince bağırsağı vücudun arka duvarına bağlayan mezenteri, bir dizi ince membranöz kısım içerir. Sıçanlarda bu mezenterik pencerelerden yaklaşık 40 ila 50 adet bulunur. Bunlar çıplak gözle neredeyse şeffaf, dolayısıyla pencere gibidir ve yetişkin erkek sıçanlarda her bir pencere yağ dokusu ile çevrilidir.

Mezenterik pencereler doğal olarak vaskülarize edilmiştir ve ölçülebilir düzeyde fizyolojik anjiyogenezden yoksundur. Bu nedenle, yetişkin doğal vaskülarize memeli dokusunda de novo anjiyogenezi inceleme fırsatı sunarlar. Yani, farelerdeki tüm normal dokularda olduğu gibi, test dokusunda endojen olarak çalışan anjiyogenez inhibitörlerini aşarak, sıfırdan tam bir anjiyojenik yanıtın başlatılmasını sağlarlar; ancak birçok pencerede ana mikro damarlar olarak işlev görebilecek doğal mikro damarlar mevcut değildir ve bu durum ne yazık ki analizin farelerdeki doğal formda öngörülemez olmasına neden olur.

Yetişkin sıçanlarda mezenterik pencereler normalde çevresel bölgelerde yer alan nispeten az sayıda küçük kan damarı içerir. Bu mezenterik pencereler doğal olarak yalnızca beş ile 10 mikrometre kalınlığındadır. Bu durum, sağlam dokunun lamlar üzerine yayılmasına ve mikroskobik olarak gözlemlenmesine olanak tanıyarak her penceredeki tüm damarların izlenmesini sağlar ve damarlara esasen iki boyutlu bir genişleme kazandırır.

Bu yöntem, kan mikrodamarlarının uzamsal yayılımının, yoğunluğunun, patern oluşumunun ve boyutunun kantitatif ölçümlerini yapmak için eşsiz bir fırsat sunmaktadır. Subkutan bölge, anjiyogenez çalışmaları için popülerdir; ancak, endotelyal hücre heterojenliği ve dokuya özgü özellikler nedeniyle, anjiyogenezin kontrolü ve subkutan dokular ile subkutan olarak büyüyen tümörler; akciğer, karaciğer, kemik ve beyin gibi metastatik visseral organlardaki anjiyogenez kontrolünü öngörmeyebilir. Visseral metastazlar genellikle kanserin letalitesinden nihai olarak sorumlu olduğundan, bu durum dikkat çekicidir.

Mezenterik pencerenin viseral olması bu açıdan avantajlı olacaktır. Projemizin amacı, de novo anjiyogenezin yönlerini kantitatif olarak incelemektir. Bu nedenle, bilinen bir pro-anjiyojenik faktörü veya bir test maddesini intraperitoneal olarak enjekte ediyoruz.

Normal şartlarda, anestezi uygulanmamış yetişkin sıçanlara tek seferde beş mililitre enjeksiyon yapıyoruz. Bu miktardaki bir hacim, tüm mezenterin enjekte edilen sıvıya hızla maruz kalmasını sağlar. Hacmi çok küçük olmadığı sürece intraperitoneal olarak enjekte edilen herhangi bir solüsyon, test dokusundaki tüm hücreleri etkilemelidir; özellikle de son derece ince olan mezenterik pencereyi örten mezotelyal hücre tabakası çözünür maddelere karşı yüksek geçirgenliğe sahiptir. Herhangi bir cerrahi işlem uygulanmadığından, mezenterik pencerede incelenecek olan anjiyogenez, yara iyileşmesinin tetiklediği anjiyogenezden etkilenmez; bu nedenle anjiyojenik tedavi intraperitoneal enjeksiyonlar şeklinde uygulanır.

Pratik nedenlerle, örneğin VEGF 1 65, 1 64 ve temel FGF gibi tanımlanmış proteinlerin anjiyojenik etkilerini incelerken standart olduğu üzere, Pazartesi sabahından Cuma sabahına kadar beş günlük bir süre boyunca günde iki enjeksiyon içeren bir tedavi protokolü uyguluyoruz. Genellikle taşıyıcı olarak Pharmacia infüzyon solüsyonu kullanılır. Tedavi sayısı fazla görünebilir, ancak VEGF ve temel FGF gibi güçlü pro-anjiyojenik faktörler yaklaşık fizyolojik seviyelerde tek bir doz veya aralıklı birkaç doz şeklinde uygulandığında, istatistiksel olarak anlamlı bir anjiyogenez indüklemenin her zaman mümkün olmadığı gösterilmiştir; dokularda güçlü endojen anjiyogenez inhibitörlerinin faaliyet gösterdiği unutulmamalıdır.

Anjiyogenezi modüle eden terapötik modalitelerin uygulanması, klinik bir tedavi durumunu taklit eder. Bir veya daha fazla anjiyogenez modülatör faktör; sistemik, subkütan, intravenöz veya oral yollarla uygulanabilir. Örneğin.

Bu durum, yalnızca ana molekülün değil, aynı zamanda metabolitlerinin de etkisinin incelenebilmesi bakımından klinik bir tedavi durumunu taklit eder. Sistem, sistemik olarak uygulanan anjiyogenez modüle eden ajanların toksik etkilerinin belirli bir düzeyde kontrol edilmesine olanak tanır. Yetişkin sıçanlar fizyolojik olarak büyüdükleri ve iki veya üç hafta süren bir deney sırasında ağırlıkları yaklaşık %40 oranında artabildiği için, hayvanların tartılmasıyla tedavinin vücut ağırlığı artışını ne derece yavaşlattığına dair bir anlayış elde etmek mümkündür; bu durum toksik etkilerin bir ifadesi olarak kabul edilebilir.

Bu durum, kaçınılması gereken maddelerin, anjiyogenez modülasyon testlerinde toksik dozlar almasını sağlar. Sonuçların spesifik anti-anjiyojenik etkiler açısından yorumlanması imkansız olabileceği için bu önemli bir faydadır. Erişkin sıçanlar, erişkin farelerden önemli ölçüde daha hızlı büyüdüğünden, eğer toksik bir etki söz konusuysa, toksik ajanların vücut ağırlığı artışı üzerindeki etkisi sıçanlarda genel toksik etkilerin daha hassas bir göstergesi olmalıdır.

Şimdi sizlere mezenterik pencere örneklerinin nasıl hazırlandığını göstermek istiyoruz. Bu hayvanlar CO2 kullanılarak öldürülmüştür. Mezenterik pencereler, mezenterin distal kısmından başlanarak üç inç boyutundaki standart artı lamlar üzerine yayılmıştır.

İleosekal valften başlayarak retrograd yönde ilerleyen mezenterik pencerede anjiyogenez çıplak gözle gözlemlenemez. Mezenterin en distal kısmından toplanan dört pencere kullanılır. Lam üzerindeki numune, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca kurutulur.

İntestinal güdük kesilip ayrılır. Örnekler daha sonra -20 °C'deki bir dondurucuda saklanır. Bu sayede örnekler, kalitede belirgin bir bozulma olmaksızın birkaç ay, hatta belki yıllarca saklanabilir.

Boyama, sıçan endotelyumuna karşı monoklonal bir antikor kullanılarak yapılır. Numunenin havada kurumasına izin verin, lam üzerine kapatma camı ile sabitlemeyin. Münferit mezenterik pencerelerdeki kan damarlarının insidanslarının nicelleştirilmesi, toplam optik büyütmesi 14 ile 34 arasında olan bir çizim mikroskobu kullanılarak bilgisayar destekli morfometrik mikroskopi ile gerçekleştirilir. Mezenterik pencerenin tamamı görselleştirilir.

Görüş alanının mümkün olduğunca büyük bir kısmının numune tarafından kapsanması için büyütme sabit adımlarla seçilir. Pencere ile çevreleyen yağ dokusu arasındaki sınır belirgin olduğundan, pencerenin tüm alanı kolayca tasvir edilebilir. Ardından, tüm damarlı kısımlar dikkatle tanımlanmış kriterlere göre çizilir.

Yüksek büyütmelerde çapının yaklaşık 2,5 ila 3,0 mikrometre olduğu tespit edilen en küçük yeni oluşmuş kan damarları bile net bir şekilde ayırt edilebilmektedir. Sıçan eritrositinin ortalama çapının 6,3 mikrometreye eşit veya daha büyük olması, bu damarların ne kadar küçük olduğunu göstermektedir. Bir penceredeki tüm damarlanmış kısımların alanının, tüm pencere alanına yüzde olarak oranı, bağıl damarlanma alanı va olarak bilinir.

Bu işlem, esasen iki boyutlu bir uzanıma sahip olan damarların uzamsal genişliğinin bir ölçümüdür; örneğin, VA bilgisayar destekli telemetri kullanılarak kolayca ölçülebilir. Bir sonraki adımda, her pencerenin vaskülarize edilmiş alanlarının üç merkezi bölgesi içindeki mikrovasküler yoğunluk ve desen oluşumu kaydedilir. Bu bölgeler, 80 optik büyütmede sistematik olarak rastgele seçilir.

Her bir damar, bir çizim mikroskobu kullanılarak tek bir çizgi şeklinde görselleştirilir. Her bir görüş alanının görüntüsü, dijitalleştirilmiş bir görüntüye ve bir görüntü analizörüne aktarılır ve ardından dijitalleştirilmiş görüntüdeki her bir damar, bir piksel kalınlığına indirgenir. Ardından makine, damarları temsil eden piksel sayısını ölçer ve bu değer, görüş alanındaki tüm piksellerin bir oranı olarak ifade edilir.

Yüzde olarak ifade edilen bu değer, mikrovasküler uzunluk veya MVL, damarlanmış alanın her bir birimindeki mikrodamarların uzunluğunu temsil eder ve mikrodamarlar yoğunluğunun bileşik bir ölçümüdür. Hayvan başına dört pencerenin VA ortalamasının, ilgili tedavi grubunun ortalama MVL değeri ile çarpılmasıyla, hayvan başına toplam mikrovasküler uzunluk olan TMVL hesaplanır. Ayrıca, görüntü analizi kullanarak mikrodamarların yoğunluğu ve bileşiminin ayrıntılı kantitatif analizi için teknikler geliştirmiş bulunmaktayız.

Bunlar arasında iki ardışık mikro damar arasındaki gerçek mesafenin, dallanma noktalarının, IE, münferit mikro damarların uzunluklarının, segment LEMS, mikro damar sayısının, birim doku hacmi başına düşen segmentlerin, NOMS ve birim doku hacmi başına düşen mikro damar dallanma noktası sayısının, NOBP ölçümü yer almaktadır. Mikro damarlardaki kıvrımlılık derecesi MVT, iki ardışık dallanma noktası arasındaki en kısa mesafe ile gerçek mesafe arasındaki farkla belirlenir; ayrıca mikro damarların birbirinin üzerinden geçme sıklığı olan kesişim indeksi INIS ve birbirine bağlanan döngü oluşumu değerlendirilir. Döngü oluşum indeksi INLF de mikro damar ağının çevresinde benzer teknikler kullanılarak doğru bir şekilde ölçülebilir.

Aynı tedavi grubundaki hayvanlar arasında ve hatta aynı hayvanın farklı mezenterik pencereleri arasında önemli farklar olabileceği için, deneyleri tasarlarken filiz uzunluğu, LESP ve birim doku hacmi başına filiz sayısı (NOSP) dahil olmak üzere filizlere ait ilgili değişkenleri de nicelendirebiliyoruz. Gözlem süresi boyunca tedavi grubu başına hayvan sayısının 8 ila 12, VA açısından analiz edilen hayvan başına pencere sayısının, mikrodamar uzunluğu (MVL) açısından analiz edilen her pencere için görüş alanı sayısı, mikro damar segmentlerinin uzunluğu (LEMS), mikro damar segmentlerinin sayısı (NOMS), mikro damar sayısı, dallanma noktaları sayısı (NOBP), mikro damar tortuosity (MVT), kesişim indeksi (I) ve halka oluşumu indeksi (INF) şeklinde bir tasarımın pratik olabileceğini gördük; kontrol olarak araç (vehicle) ile tedavi edilen üç hayvan kullanılır. Mezenterik pencere anjiyogenez testi, doz etkisi çalışmaları ve anjiyogenez kinetik analizleri için oldukça uygundur.

Bu işlem, hayvan gruplarının farklı dozlarda pro-anjiyojenik faktörle tedavi edilmesi ve bu hayvanların anjiyojenik yanıt sırasında farklı zaman noktalarında sakrifiye edilmesiyle gerçekleştirilebilir. Böylece ekspansif faz, zirve noktası ve ardından gelen anjiyo-regresif faz nicel terimlerle ayırt edilebilir. Bu tür çalışmalar, test edilen herhangi bir büyüme faktörü sitokinine karşı verilen de novo anjiyojenik yanıtın; hız, etkinlik ve süre açısından spesifik olarak doza bağımlı olduğunu ortaya koymuştur.

Ayrıca, yeni damarların mekânsal yayılım ve mikrovasküler yoğunluktaki değişimler açısından örüntüsü, yaklaşık fizyolojik dozlardaki VEGF veya temel FGF tarafından aracılık edilen anjiyogenez ile karşılaştırıldığında genellikle belirgin şekilde doz ve zamana bağımlıdır. Mast hücrelerinin in situ seçici aktivasyonu yoluyla indüklenen mast hücresi aracılığıyla anjiyogenez (MCMA), önemli ölçüde daha yüksek potansiyel ve dikkat çekici derecede daha uzun süreli etki gösterir. Aslında, objektif anjiyogenez değişkenlerini nicelendirme yeteneği, sistemin yüksek derecede biyolojik uygunluğu ve toksik tedavilerin kontrol edilebilme olasılığı nedeniyle, mast hücresi aracılığıyla anjiyogenez ilk kez bu analiz kullanılarak tanımlanmıştır.

Bu metodoloji, yapı-aktivite ve doz-yanıt analizleri için benzersiz bir şekilde uygundur. Sıçan MWAA, fizyolojik anjiyogenezin bulunmadığı ve cerrahi işlemden etkilenmeyen, yetişkin ve doğal olarak vaskülarize olmuş bir visseral dokuda anjiyogenezi incelemek için bir model sunar; böylece yara iyileşmesinin tetiklediği anjiyogenezin herhangi bir etkisi dışlanmış olur. Deney gerçek anlamda kantitatiftir ve mikrodamarların uzamsal yayılımını, yoğunluğunu ve patern oluşumunu tanımlayan biyolojik olarak ilgili bir dizi objektif değişkeni doğru bir şekilde değerlendirir.

Bu analiz; anjiyogenezin sistemik etkilerini, modüle eden faktörleri ve yapı-aktivite ile doz-yanıt çalışmalarını incelemek için oldukça uygundur. Burada açıklanan metodoloji, İsveç'teki Göteborg Üniversitesi'ne bağlı Reka Üniversite Hastanesi Patoloji Bölümü'nde Dr. Kloss Carl Norby laboratuvarında geliştirilmiştir. Bu projedeki tüm çalışmalar, İsveç Tıbbi Araştırma Konseyi'nin 5 9 4 2 numaralı projesi tarafından desteklenmiştir.

Projenin başlangıcından beri dahil olan Bayan Gun Effer, burada bulunmayan Bayan Monica Anderson ve Bayan Ann Nemar Lindgren'in becerikli teknik destekleri minnetle kabul edilmiştir.

Umarım bu kısa sunum, analizin potansiyeli hakkında size bir fikir vermiştir. Eğer bu analizi laboratuvarınızda kullanırsanız, herhangi bir teknik sorunla karşılaştığınızda size yardımcı olmaktan mutluluk duyarım. Ayrıca, iletebileceğiniz her türlü öneriyi memnuniyetle karşılarım.

Teşekkür ederiz.