İmmünohistokimya: Parafin Bölüm Vektör Labs Vectastain ABC Seti

Merhaba, ben Victor Chi ve California Irvine Üniversitesi Fizyoloji ve Biyofizik Bölümü'ndeki Chandy Lab'da yüksek lisans öğrencisiyim. Bugün, Vector Laboratories'den A, b, C kitini kullanarak parafin gömülü bölümlerin nasıl boyanacağını göstereceğim. Bu prosedür, parafine gömülü bölümlerin mumlanmasını ve hidratlanmasını, antijenleri maskelemek, peroksidazı bloke etmek ve spesifik olmayan protein bağlanmasını engellemek için ısıya bağlı antijen alımının gerçekleştirilmesini, CD dört ve tirozin hidroksilaz ve ikincil antikorlarla inkübe edilmesini ve slaytın geliştirilmesini ve monte edilmesini içerir.

Öyleyse başlayalım. Slaytlar parafin ile kodlandığı için ilk adım lamların mumunun alınmasıdır. Bu, genellikle bir çeker ocakta, her yıkama için beş dakikadan oluşan üç yıkamadan sonra üç kavanoz ksilen kullanılarak yapılır.

Slaytlar daha sonra yüzde yüz etanol içine konur. Slaytlardaki balmumunun gittiğini fark edeceksiniz, ancak slaytları eldivenle tutmamaya dikkat edin çünkü ksilen eldivenlerin kauçuğunu çözecektir. Oradan, yüzde yüz etanol içindeki slaytları, hidrasyon gradyanına tabi tutulacakları laboratuvara geri taşırsınız.

Bu yüzden burada size slaytlarımızı geçirecek olan hidrasyon gradyanı hakkında konuşacağım. İlk önce yüzde yüz etanolün iki banyosu ile başlar. Oradan kaydıraklarımızı %95 etanolden oluşan iki banyoya aktarıyoruz.

Daha sonra slaytlarımızı %70 etanol içeren bir banyoya aktarıyoruz ve oradan slaytlarımızı %50 etanol içeren bir banyoya aktaracağız. Bundan sonra slaytlarımızı %30 etanole aktarıyoruz ve iki dakika sonra slaytlarımızı çift damıtılmış suya aktaracağız. Ve çift damıtılmış su ile muamele ettikten sonra, slaytımızın PBS'de oturmasına izin vereceğiz.

Şimdi size kaydırakları vagonlarda bir banyodan diğerine nasıl taşıyacağınızı göstereceğim. Bu nedenle ilk adım, taşıma tutucunuzu kullanmak, slaytları çıkarmak ve fazla sıvıyı çıkarmak için hafifçe kazımaktır, böylece bir sonraki banyonuza çok fazla sıvı taşımazsınız. Oradan, içine daldırın ve bir sonraki gradyan değişikliğine kadar iki dakika bekleyin.

Pek çok kez dokular sabitlendiğinde, antijen maskelenir, böylece antikor ona bağlanamaz. Şimdi yapacağım şey size sodyum sitrat kullanarak ısı ile indüklenen antijen elde etme yöntemini göstermek. Şimdi burada, mikrodalga fırındayız, burada CD sekiz antijenimin maskesini çıkaracağım, ki bu antijeni immünohistokimya kullanarak tespit etmeye çalışacağım.

Ve burada solüsyonumu koyacağım ve 15 dakika mikrodalgada pişireceğim. Bu yüzden slaytlarımızın kurumasını sağlamak için sodyum sitratımızı slaytlarımızla 15 dakika kaynatacağız. Slaytlarımızı izleyeceğiz, böylece kaynattıktan sonra slaytların nemli kaldığından emin olmak için sodyum sitrat ile yeniden dolduracağız.

Bu yüzden slaytlarımı sodyum sitratın içine koymadan önce, çözeltimi 45 saniye önceden ısıttım. Sonra slaytlarımı sodyum sitratın içine koydum ve şimdi sodyum sitratımı 15 dakika ısıtıyorum. İçindeki slaytlarla, genellikle çözelti kaynatma işlemine yaklaşık iki ila iki buçuk dakika kala kaynamaya başlayacaktır.

Bu noktada, kaybedilen sodyum sitratı durdurup taze sodyum sitrat ile değiştireceğim. Sodyum sitratı 15 dakika kaynattıktan sonra slaytlarımızı ve solüsyonumuzu çıkarıp soğutmak istiyoruz. Ve bunu yapmanın en iyi yolu, sürgü tutucunuzu kapatmak, fazla sıvıyı dökmek ve kavanozun içindeki çözelti oda sıcaklığına soğuyana kadar bir soğuk su akışı üzerinde çalıştırmaktır.

Ve bu genellikle yaklaşık 10 ila 15 dakika sürer. Bu yüzden slaytlarımızı lavabodan çıkardıktan sonra, dokulardaki endojen peroksidaz aktivitesini bloke etmemiz gerekiyor. Yani, yapacağımız şey, %30 hidrojen peroksit kullanarak ve %1'lik bir hidrojen peroksit çözeltisi oluşturan bir hidrojen peroksit çözeltisi yapmak.

Ve buradan, slaytları doğrudan hidrojen peroksit çözeltisine aktarıyorum. Ve şimdi slaytlarımızı hidrojen peroksit içinde 20 dakika boyunca kuluçkaya yatıracağız. Şimdi, 20 dakika geçtikten sonra, endojen peroksidazı bloke ettikten sonra, şimdi PBS yıkamaları kullanarak hidrojen peroksiti slaytlardan yıkayacağım.

Bu yüzden slaytlarımı arabaya aktaracağım ve her biri beş dakikadan oluşan üç yıkama ile yıkayım. Bu nedenle, dokuya zarar verebilecek diğer slaytlarla teması önlemek için bu slaytlar sırt sırta yerleştirilmiştir. Bu yüzden sadece slaytlardan kayıyorum ve slaytları, dokunun camla temas etme olasılığı olmayacak şekilde düzenliyorum.

Orada slaytlarımızı PBS'ye aktarıyoruz. Bu yüzden slaytlarımızı PBS ile yıkadıktan sonra, şimdi proteinlerin spesifik olmayan bağlanması için slaytları %5 BSA %5 keçi serumu ve %0.1 sodyum azid çözeltisi ile bloke edeceğim. Yani keçi antikorları ile çalışıyorsanız keçi serumunu başka bir türle değiştirmek istersiniz.

Bu yüzden şu anda, slaytları slayt tutucumuza koyacağım ve çözümümüzle dolduracağım. Bu yüzden normalde yarıya kadar doldururum, böylece slaytların hacmi dokuların suya batırıldığından emin olur. Bu nedenle, slaytları kabın içine koyarken emin olmak istediğiniz bir şey, bu dokunun kabın kenarlarına temas etmesini önlemektir.

Bu nedenle, son slayt için, doku kabın içine değmeyecek şekilde içe doğru döndürün. Artık slaytlarımı bir gecede bloke ettiğime göre, fazla engelleme solüsyonunu PBS'de beş dakikadan oluşan beşli üç yıkama ile yıkayacağım. Bu noktada, dokumuzun etrafına sıvı bloker kullanarak bir daire çizmek istiyoruz, böylece kullanılan antikor miktarını en aza indirmiş oluruz.

Antikoru koruma konusunda endişelenmiyorsanız, slaytları her zaman engelleme adımını yaptığımız aynı kılıflarda inkübe edebilirsiniz. Bu noktadan sonra, size dokumuzun etrafına sıvı bloker ile nasıl çizdiğimizi göstereceğim. Bu yüzden önce fazla sıvıdaki kanı alıyoruz, dokuya dokunmamaya dikkat ediyoruz.

Bu yüzden fazla sıvıyı çıkarmak için köşelerden silin. Yine dokuya dokunmamaya çok ama çok dikkat etmek. Sıvı engelleme pimini alın, hafifçe bastırın, akışı başlatın ve oradan dokuyu kaleminizle çevreleyin.

Sıvı engelleyicinin yaklaşık 15 saniye kurumasını bekleyin. Bu noktada, birincil antikoru eklemek istiyoruz. Ve böylece bir pipet kullanarak, dokuyu birincil antikorunuzla kapladığınızdan ve nem kontrollü kutunuza aktardığınızdan emin olun.

Bu yüzden bir Kim mendili kullanıyoruz. Birincil antikorla kuluçkaya yatarken slaytın kurumasını önlemek için bu kutuda bir miktar di su ile evlendim. Birincil antikorumuz bir saattir kuluçkaya yattığına göre, slaytlarımızı çıkaracağız ve fazla antikoru PBS ile yıkayacağız.

Bu yüzden yine, sıvının boşalmasına izin verin ve PBS yıkamanıza yerleştirin. Ve yine, beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Beş dakikalık üç yıkamadan sonra, ikincil antikorunuzu, birincil antikorunuzu eklediğimiz gibi dokumuza ekleyeceğiz.

Bu yüzden sadece dokularınızı kaplayacak kadar hacim kullanarak, keçi önleyici tavşan kullandığımız ikincil antikorunuzu ekleyin ve slaytınızı nem kontrollü odaya geri taşıyın. Ve bu yüzden ikincil bir antikor kullanıyoruz, bu biyotinile edilmiş keçi tavşanı anti-tavşanı, ki bu A BC yöntemini kullanırken çok önemlidir. Bu yüzden slaytımızı nem kontrollü odaya aktarıyoruz ve bunun bir tanesi için kuluçkaya yatırılmasına izin veriyoruz.

Bu nedenle, ikincil antikor inkübe edilirken, A BC reaktifini hazırlamamız gerekir. Bu yüzden vektör boyama kitinden vektör laboratuvarları, A, B, C reaktifini kullanıyoruz. Bu nedenle, reaktifi çıkarın, astarlayın ve tüpü sıkmamaya dikkat ederek 15 mililitre PBS'ye üç kez düşmesine izin verin, çünkü damlaların özel olarak ölçülmesi ve belirli bir boyutta olması gerekir.

İkincil antikorunuz yaklaşık bir saat inkübe edildikten sonra, slaytlarınızı alıyorsunuz ve koyuyorsunuz, tıpkı birincil antikorunuzda yaptığınız gibi PBS'de tekrar yıkıyorsunuz. Bu nedenle, her biri beş dakikadan oluşan üç yıkamadan sonra, slaytlarınızı 30 ila 45 dakika önceden hazırladığınız A, B, C reaktifinizi eklediğiniz bu kaba aktarırsınız. Ve böylece A, B, C reaktifinizi buraya ekleyin ve slaytlarınızı doldurun ve bunun 30 ila 45 dakika daha inkübe edilmesine izin verin.

Bu nedenle, slaytlarınız yaklaşık 34 ila beş dakika boyunca a, B, C'de oturduktan sonra, fazla A, B, C solüsyonunu yıkamak istiyoruz. Böylece slaytlarınızı kaldırmanız ve PBS çözümünüze eklemeniz yeterlidir. Bu nedenle, aynı yıkama prosedürünü PBS'de her yıkamada beş dakika boyunca üç kez tekrarlamak istiyoruz.

Slaytlar yıkanırken, vektör laboratuvarlarından DAB peroksidaz substratını hazırlıyorum. PH 7.5 tamponunu alıyorum ve içine iki damla ekliyorum. PH 7.5 tamponundan sonra, DAB substrat reaksiyon reaktifini alıyorum ve bundan iki damla ekliyorum.

Yine, damla boyutu kritiktir, bu nedenle şişeyi sıkmayın ve damlaların düşmesine izin vermeyin. Tampon pH 7.5 için iki damla. Bu nedenle, DAB substrat reaktifinden dört damla eklemek ve aynı zamanda düşmesine izin vermek istiyorsunuz.

Sonunda da eklemek istiyorsunuz, iki damla hidrojen peroksit substrat reaktifi eklemek istiyorsunuz. DAB substrat reaktif karışımı bu şekilde görünmelidir. Artık slaytlara eklemeye, slaytlarınızı kaldırmaya ve PBS'nin slaytlarınızı boşaltmasına izin vermeye hazır.

Böylece zamanla, DAB reaktifi daha kahverengi hale gelir. Bu yüzden bu noktada slaytlarımıza eklemek istiyoruz. Bu yüzden dokuları kaplayacak kadar hacim alın ve doğrudan doku örneklerinin üzerine ekleyin.

Bu nedenle, uygun hacmi alın ve doğrudan doku örneklerinizin üzerine ekleyin ve doku örneklerinizin bir süre sonra daha kahverengi hale gelmesi gerektiğinden, çözeltinin gelişmesine izin verin. DAB solüsyonunuzu ekledikten sonra, bu beyin bölümünde dokunun burada ve burada kahverengiye döndüğünü görebilirsiniz. Kahverengi DAB ayakta durması, orta beyin dopaminerjik nöronlarını içeren bölgeyi ortaya çıkarır.

Slaytlarınızı iki ila 10 dakika arasında herhangi bir yerden geliştirdikten sonra, kendinizinkini eklemek istersiniz, bu yüzden reaksiyonu durdurmak için slaytlarınızı buz gibi soğuk suya eklemek istersiniz. Bu nedenle, çözeltinin akmasına izin verin ve slaytlarınızı doğrudan buz gibi soğuk suya ekleyin. Slaytlarınızı buz gibi soğuk suya batırdıktan sonra, banyonuzu lavaboya götürün ve tüm DAB solüsyonunun bu banyodan boşaltıldığından emin olmak için yaklaşık beş dakika boyunca soğuk su akıtın.

Bu nedenle, lavaboya eklediğinizde, akıntının dokuya çarpmasına izin vermemek için dikkatli olun ve köşelerden birine çarpmasını ve taşmasına izin verin, böylece dokularınız akan su akışından rahatsız olmaz. Bu yüzden slaytlarınızı yıkamadan çıkardıktan sonra karşı leke yapmak istersiniz. Öyleyse neden bir karşı leke isteyebilirsiniz?

Bunun bir nedeni, dokunuzun yapısını görmek isteyebilmenizdir. Bir diğeri, tüm hücreleri görselleştirmektir. Bu yüzden amaçlarımız için, lekeye çekirdek anlamına gelen hemat toin ile karşı koyacağız.

Bu yüzden slaytlarımızı almak, fazla sıvıyı çıkarmak ve sadece bir kez Hematin çözeltisine batırmak istiyoruz. Birincisi, çıkarın ve doğrudan suya ekleyin. Kaydıraklarınızı musluk suyuna ekledikten sonra, daha önce buz gibi su banyosunda yaptığınız gibi kaydıraklarınızı alıp su altında çalıştırmak istersiniz.

Bu nedenle, hemat Toin yıkaması için, kavanozun içindeki su berraklaşana kadar akan su altında çalışmasına izin verin. Bu yüzden karşı lekeli kaydıraklarımızı sudan çıkardıktan sonra kaydıraklarımızı yeniden kurutmak istiyoruz. Ve böylece onu etanol gradyanımızdan geri koymak istiyoruz, ama ters sırada.

Yani bu, deiyonize su ile bir yıkama, %30 etanol ile bir yıkama, %50 etanol ile bir yıkama, %70 etanol ile bir yıkama, iki yıkama ve %95 etanol ve iki yıkama ve her biri iki dakikadan oluşan %100 etanol olacaktır. Bu yüzden slaytlarınızı çıkarın, fazla sıvıyı silin ve doğrudan %30 etanolünüze ekleyin ve iki dakika bekletin. Bu yüzden son yüzde yüz etanol yıkamasından sonra, slaytları ksilene geri koymak istiyoruz.

Bu yüzden slaytlarınızı tekrar alın, fazla sıvıyı kazıyın, slaytları alın ve beş dakika boyunca ilk ksilenin içine ekleyin. Böylece bu, her biri beş dakika boyunca art arda üç ksilen yıkaması olacaktır. Ve şimdi slaytlarımızı monte etmeye hazırız.

Bu yüzden genellikle yaptığım şey, slaytlar hazır olmadan bir dakika önce, mera pipetimi alırım ve perma montaj solüsyonunu çizerim ve slaytlarım çıkmaya hazır olmadan yaklaşık bir dakika önce bunun gitmesine izin veririm Son ksileni yıkadıktan sonra, eldivenlerinizi suya batırmamaya veya eldivenlerinizi ksilen ile ıslatmamaya dikkat ederek, Bunları bir cımbızla çıkarın, hangi tarafın dokuyu içerdiğine dikkat edin. Dokuya dokunmamaya dikkat ederek XLE'nin fazlalığını bir Kim mendiliyle nazikçe silin, sadece köşeleri ve kenarları dikkatlice silin ve ksilenin çoğunun buharlaşmasına izin verin. Muhtemelen biri kurumadan önce iki slayt üzerinde çalışabilirsiniz.

Bu nedenle, bir slaytı kurutmayı bitirdiğinizde, diğer slaytla çalışmaya hazır olmalıdır. Şimdi tamamen kurumadan önce onlarla çalışmak zorundasın. Bu nedenle, permount'unuzu almak ve dokunduğunuzdan yana ince bir çizgi çizmek istiyorsunuz, dokunmanıza dikkat edin.

Kapak kaymanızı alarak perimount'u çıkarın. 45 derecelik bir açıyla uygulayın ve eğilmesine izin verin. Ardından, perimount'un tüm dokuları kapladığından emin olarak kapak kaymanızı kaydırın.

Sonra yatırın, yatırın ve tüm fazla hava kabarcıklarını gidermek için ortasına hafifçe bastırın. İkinci mendiliniz üzerinde çalışırken kurumasına izin verin, aslında slaytlarımıza bakmanın zamanı geldi, aslında değil. Bu nedenle, slaytlarımıza bakmadan önce kalıcı montajın gece boyunca kurumasına izin vermeliyiz.

Aksi takdirde, mikroskobun ışığı altında, kalıcı montaj köpürür ve ardından numunenizi mahvedersiniz. İşte kimyasallarla boyandıktan sonra beynimizin bölümlerine, tirozin hidroksilaza karşı yönlendirilmiş tavşan poliklonal antikoruna bir bakış. Yine kahverengi DAB boyası orta beyin dopaminerjik nöronlarının yerini gösterir.

Hematin sayacı boyası bu dokudaki tüm çekirdekleri maviye çevirir. Bu yüzden size Vector Laboratories'den A BC kitini kullanarak parafine gömülü bölümleri nasıl boyayacağınızı gösterdim. Şimdi koşulları, boyayacağınız doku tiplerine ve kullanacağınız antikorlara göre ayarlamak isteyeceksiniz.

Deneylerinde iyi şanslar.