Fagozom Oluşumu ve Kapanışının TIRF Mikroskobu Tabanlı Görselleştirilmesi

Yüzeyine yapışmış IgG-opsonized kırmızı kan hücreleri veya RBC'ler içeren polimer kaplı bir cam alt tabak alın.

Çanağı, fizyolojik sıcaklıkta tutarak toplam iç yansıma floresan mikroskobu aşamasına yerleştirin.

Hücre iskeleti görselleştirmesini kolaylaştıran, polimerize aktine bağlanan floresan etiketli sitoplazmik peptitler içeren makrofajlar ekleyin.

Görüntüleme sırasında, bir lazer ışınını kritik açıdan daha üstün bir açıyla yönlendirerek temas noktasında iç yansımaya ve geçici dalga oluşumuna neden olur.

Buharlaşan dalgalar, cam numune arayüzündeki floroforları seçici olarak aydınlatır ve fagositozun gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesini sağlar.

Makrofaj Fc reseptörleri, IgG-opsonize RBC'ye bağlanır ve temas alanı etrafında reseptör kümelenmesine neden olur.

Kümelenme, hücre içi sinyal yollarını ve GTPaz aktivasyonunu tetikleyerek aktin polimerizasyonunu ve dinamin alımını hızlandırarak psödopodlar oluşturur.

Psödopodlar, RBC'nin etrafına uzanır ve fagositik bir kap oluşturur.

Sonunda, psödopod uçları birleşir. Biriken dinamin, opsonize RBC'yi içselleştirerek hücre zarından fagozom ayrılmasına aracılık eder.

SRBC'lerin kovalent olmayan fiksasyonu için, polilizin kaplı tabakların her birine 2 mililitre IgG-opsonize hücre dökün ve numuneleri sallanan bir rotor santrifüjünde santrifüjleyin. Süpernatanları atın ve parçacıkları 2 mililitre PBS ve% 10 BSA ile bir kez yıkayın.

Daha sonra, parçacıkları 2 mililitre taze PBS artı% 10 BSA ile oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin, ardından 2 mililitre PBS ile üç yıkama yapın. Son yıkamadan sonra, PBS'yi 2 mililitre 37 santigrat derece serumsuz mikroskopi ortamı ile değiştirin.

Mikroskop tablasına SRBC kodlu bir tabak yerleştirin. Daha sonra, ilgilenilen transfekte edilmiş hücreleri kültür kabının altından kazıyın ve tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için hücreleri birkaç kez pipetleyin. Kopyalanan hücreleri SRBC kaplı kaba ekleyin.

Canlı alım yazılımını başlatın. Floresan etiketli proteinleri ifade eden bir hücre bulun ve çanağın konumunu, ilgilenilen bir hücre alanın ortasında olacak şekilde ayarlayın. Bir uyarma dalga boyunda 0,01 derecelik artışlarla 0 ila 5 derece arasında farklı açılarda 500 görüntü elde edin.

Gelen ışığın cam-ortam arayüzünde tamamen yansıtılması ve geçici bir dalga oluşturması için kritik açıyı belirlemek için, görüntü dizisini uygun görüntüleme yazılımında açın. Hücrede tek tip floresan ile ilgili bir bölge seçin.

Ardından, Görüntü sekmesi altında Yığınlar'ı seçin ve Z ekseni profilini çizin. Z ekseni profilini çizmek için, X ekseni üzerindeki açıların fonksiyonu ile ilgilenilen bölgede ölçülen ortalama floresan yoğunluğu. X ekseninde kritik açıdan daha üstün olan herhangi bir açı değeri daha sonra mikroskopi oturumu sırasında bir TIRF sinyali elde etmek için kullanılabilir.