Nötralize Edici Antikorlara Karşı İnfluenza Virüsü Kaçış Varyantlarının Üretilmesi

Hem vahşi tip hem de mutant suşları içeren bir grip virüsü süspansiyonu alın.

Hemaglutinin veya HA olarak adlandırılan bir viral zarf glikoproteini, konakçı hücre yüzeyindeki sialik aside bağlanarak viral girişe aracılık eder.

HA'ya bağlanan ve sialik asit bağlanma bölgesini bloke eden azalan konsantrasyonlarda nötralize edici bir antikor ekleyin.

HA'da antikor nötralizasyonunu önlemeye yardımcı olan mutasyonlar taşıyan mutant suşlar, kaçış varyantları olarak adlandırılır.

Karışımı patojen içermeyen embriyonlu tavuk yumurtalarına enjekte edin, virüsleri allantoik sıvıya verin ve inkübe edin.

Antikorla nötralize edilmiş virüsler koryoallantoik zarın hücrelerine giremez. Nötralize edilmemiş mutant virüsler hücrelere girer, çoğalır ve allantoik sıvıya salınır.

Virüs popülasyonu içeren allantoik sıvıyı hasat edin.

Azalan konsantrasyonlarda HA'ya özgü bir antikor ekleyin, bu da kaçış varyantları dışındaki diğer suşları nötralize eder.

Nötralize edilmemiş kaçış varyantları hücrelere bağlanarak eritrositlerin topaklanmasına neden olur - hemaglutinasyon olarak adlandırılır ve kaçış varyantı oluşumunu doğrular.

HI aktivitesine sahip nötralize edici antikorlar, ilk olarak, seyreltme başına 100 mikrolitrelik bir hacimde PBS'nin 1 katı konsantrasyonlarda artan konsantrasyonlarda ilgilenilen antikorun 4 seyreltmesinin hazırlanmasıyla daha fazla analiz edilir. Daha sonra, 400 mikrolitrelik bir hacimde 1 kez PBS'de mililitre başına 1 milyon plak oluşturan birimden oluşan bir virüs stoğu hazırlayın.

Daha sonra, her bir antikor seyreltmesinin 100 mikrolitresi veya 100 mikrolitre PBS'nin 1 katı ile mililitre virüs başına 1 milyon plak oluşturan birimin 100 mikrolitresini karıştırın. Numuneleri% 5 karbondioksit içeren 37 santigrat derece inkübatörde bir saat inkübe edin.

Kısa bir süre girdaplama yaptıktan sonra, her karışımdan 200 mikrolitreyi spesifik patojen içermeyen embriyonlu tavuk yumurtalarına enjekte edin. Daha sonra yumurtaları 40 ila 44 saat boyunca karbondioksit olmadan 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Kuluçka dönemini takiben, virüs bulaşmış enfekte embriyonlu yumurtaları en az 6 saat boyunca 4 santigrat dereceye koyarak kurban edin. Daha sonra, daha önce tarif edildiği gibi allantoik sıvıyı yumurtalardan toplayın.

Son olarak, metin protokolünde açıklandığı gibi HI testini gerçekleştirerek kaçış varyantlarını onaylayın.