Mikroglia tarafından Tau proteini alımını değerlendirmek için hücre bazlı bir test

Beyindeki yapışmış murin mikroglia - fagositik hücreleri içeren düz tabanlı çok kuyulu bir plaka ile başlayın.

İmmünokompleksler içeren serum içermeyen bir ortam tanıtın. Bu kompleksler, belirli nörodejeneratif hastalıklar sırasında oluşan fosforile Tau protein agregatlarına bağlı antikorlardan oluşur.

Tau agregaları, pH'a duyarlı yeşil floresan boya ile etiketlenmiştir.

İnkübasyon sırasında, bu immünokompleksler, mikroglial hücrelerin Fc reseptörleri ile etkileşime girerek yutulmalarını kolaylaştırır.

Bu immünokompleks içeren endozom bir lizozom ile birleşerek bir endolizozom oluşturur. Endolizozomun asidik ortamı, boya moleküllerinin floresan oluşmasına neden olur.

İçselleştirilmemiş immünokompleksleri çıkarmak için yıkayın.

Hücreleri ayırmak için tripsin-EDTA çözeltisi ile tedavi edin.

Endolizomu stabilize etmek için hücre süspansiyonunu buz üzerine yerleştirilmiş bir U-alt plakaya aktarın. Hücreleri pelet haline getirin ve süpernatanı atın.

Hücreleri FACS tamponu ile yıkayın ve yeniden süspanse edin.

FACS'ı kullanarak, tek canlı hücreleri tanımlayın ve mikroglia tarafından Tau alımını değerlendirmek için yeşil floresan yoğunluğunu ölçün.

Deneyin ilk gününde, BV-2 hücrelerini önce kültürlendikleri şişede 1x PBS ile yıkayarak hazırlayın. Daha sonra, şişeden ayrılana kadar% 37 santigrat derecede% 0.05 tripsin EDTA ve% 5 CO₂ ile inkübe edin. 3 ila 5 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri kültür ortamında yeniden süspanse edin.

Hücreleri sayın ve mililitre başına 200 mikrogram heparin içeren kültür ortamında mililitrede 100.000 hücre nihai konsantrasyonuna sahip bir hücre süspansiyonu hazırlayın. 96 oyuklu bir doku kültürü düz tabanlı plakada oyuk başına bu hücre süspansiyonundan 250 mikrolitre ekleyin. Plakayı gece boyunca% 5 CO₂ ile 37 santigrat derecede inkübe edin.

Önceden hazırlanmış pH boya-Tau agregalarını buz üzerinde çözdürdükten sonra, 500 nanomolar bir çözelti elde etmek için serumsuz ortam koşulu başına 65 mikrolitre seyreltin. İstenen konsantrasyonu iki katına çıkarmak için antikorları 65 mikrolitre serumsuz ortamda seyreltin. pH boya-Tau agregalarını ve antikorları 96 oyuklu bir U-alt plakada karıştırın. Bu seyreltme plakasını kapatın ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Ertesi gün, ortamı BV-2 hücreleri ile 96 oyuklu plakadan çıkarın. Her bir kuyucuktaki hücreleri 100 mikrolitre oda sıcaklığında 1x PBS ile yıkayın. PBS'yi BV-2 hücre plakasından çıkarın. 125 mikrolitre immünokompleksi seyreltme plakasından 96 oyuklu BV-2 hücre plakasının her bir oyuğuna aktarmak için çok kanallı bir pipet kullanın ve% 5 CO₂ ile 37 santigrat derecede iki saat inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, immünokompleksleri hücrelerden çıkarın ve hücreleri her bir kuyucukta 100 mikrolitre oda sıcaklığında 1x PBS ile yıkayın. 1x PBS'yi çıkardıktan sonra, 50 mikrolitre% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin ve% 5 CO₂ ile 37 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin. Bundan sonra, 200 mikrolitre kültür ortamı ekleyin ve hücreleri ayırmak için yukarı ve aşağı pipetleyerek kuyuyu yeniden süspanse edin.

Hücreleri 96 oyuklu bir U-alt plakaya aktarın ve 4 santigrat derecede 5 dakika boyunca 400 kez g'de santrifüjleyin. Plakayı buzun üzerine yerleştirin ve ortamı çıkarın. 150 mikrolitre buz gibi soğuk 1x PBS ekleyin ve 4 santigrat derecede 5 dakika boyunca 400 g'da tekrar santrifüjleyin. Plakayı buzun üzerine yerleştirin ve önceden eklenen 1x PBS'yi çıkararak ve oyuk başına 150 mikrolitre buz gibi soğuk PBS ekleyerek tekrar yıkayın. Aynı koşullar altında tekrar santrifüjleyin.

Plakayı buzun üzerine yerleştirin ve önceden eklenen PBS'yi çıkararak ve kuyucuk başına 150 mikrolitre FACS tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın. 4 santigrat derecede 5 dakika boyunca 400 g'da tekrar santrifüjleyin. Plakayı buzun üzerine yerleştirin ve önceden eklenen FACS tamponunu çıkarın ve hücreleri oyuk başına 200 mikrolitre FACS tamponunda yeniden süspanse edin. Canlı hücre kapısında 20.000 olay elde etmek için hemen FACS ile analize devam edin.