Memeli Doku Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Merhaba, benim adım Rob Edwards. University of California Irvine Lazer Yakalama mikroskobu tesisinin direktörüyüm. Size burada bulunan lazer yakalama mikroskobunun kullanımını anlatacağım.

Kullandığımız cihaz, yaklaşık üç yıl önce satın aldığımız bir Leica A-S-L-M-D'dir. İki farklı lazer yakalama sistemi türü bulunmaktadır. Bunlardan biri, doku parçasının bir cam lam üzerinde ve dokuyu örten plastik bir membranın altında yer aldığı bir nokta kaynağına benzetilebilir.

Ardından, membranı eritmek için bir lazer kaynağı kullanılır; bu işlemle doku aslında membrana nokta kaynağı ile sabitlenmiş olur ve daha sonra membran, yakalanan dokuyu da beraberinde götürerek çıkarılır. Tamam. LCM sistemini başlatmak için buradaki bir dizi cihazı sırayla açıyoruz. Buradan güç verdiğimiz A-S-L-M-D kontrol kutusu ile başlayacağız.

Ardından bilgisayarı basitçe açıyoruz. Yakalanacak hücrelerin tanımlanması için floresan optik gerektiren bir örneğiniz varsa, floresan aydınlatma için cıva lambasını açarsınız. Bu demonstrasyon için bunu kullanmayacağız.

Numunelerin işlem öncesi ve sonrası yüksek kaliteli görüntülerini yakalamak istiyorsanız, mantık kutusu ve bilgisayar açıldıktan sonra buradaki spot kamerayı ayrıca açabilirsiniz; ardından, cihazın arkasında alt kısımda bulunan bir anahtar ile çalıştırılan lazer güç kontrol ünitesini açın. Son olarak, bilgisayar monitörü açılır. Ekranda aşina olmanız gereken bir dizi kontrol bulunmaktadır.

Bunları oldukça düzenli olarak kullanacaksınız. Bu, klasik bir Microsoft Windows tabanlı programdır, bu nedenle üzerinde duracağımız bir dizi menü bulunmaktadır. Ancak önce buradaki masaüstü hakkında konuşayım.

Mikroskobun gerçekte ne gördüğünü size gösterecek canlı bir pencere bulunmaktadır. Buradaki menü çubuğunun üst kısmında canlı görüntüler için bir düğme görebilirsiniz ve ayrıca, dokunun izole edildiğini belgelemek için, örneğin görüntüleme öncesinde ve sonrasında dokunun bir bölümünün sabit görüntülerini yakalamak amacıyla etkinleştirebileceğiniz bir dondurma düğmesi mevcuttur. Mikroskop, hematoksilen karşıt boyamalı dokuları mı yoksa floresan boyalı dokuları mı görüntülediğinize bağlı olarak, açık alan veya floresan modunda çalıştırılabilir.

Sonraki iki buton, mikroskop tablasının düzlemine odaklanan numune modunu ve ardından lamı kenara çekerek toplama tüpünün üst kısmındaki yakalanan dokuyu görselleştirmenize olanak tanıyan toplayıcı modunu içerir. Bu, bir kalite kontrol ayarıdır. Menü çubuğunda daha sonra, yakalamak istediğiniz doku bölümlerini veya hücreleri belirlemek için kullanacağınız bir dizi çizim aracı yer alır.

Ekranın sağ tarafında ise bazı çizim şekli seçenekleri, bazı kesme seçenekleri ve kesme kontrol düğmelerini içeren ek çizim ve yakalama araçları bulunmaktadır. Ayrıca alt kısımdaki kontrol panelinde, mikroskobun sahnesinin altında yer alan ve dokunuzun yakalandığı einor tüplerini tutan toplayıcı cihaz bulunmaktadır. A, B, C ve D olarak etiketlenmiş bu dört düğme, yakalanan örneğin doğrudan altına hangi tüpün hareket ettirileceğini kontrol eder.

Bu, lazer yakalama mikrodissection işlemi için hazırlanmış tipik bir dondurulmuş kesit doku örneğidir. Bunlar, bir pen foil lam üzerine yakalanmış fare embriyonik başının koronal kesitleridir. Bunlar, sekiz mikron kalınlığında dondurulmuş kesitler olup ardından kurutulmuş, hematin ile karşıt boyama yapılmış ve kullanıma kadar minus 80 degrees Celsius'ta saklanmıştır.

Bu lamları mikroskoba yerleştirmek için, mikroskopla birlikte gelen özel bir tutucu kullanılır; dokunun, tabla düzleminin altında bulunan bir Eppen tüpüne aktarılacağını unutmayın. Dolayısıyla doku, lamın bu tarafındadır. Lam, doku tarafı aşağı bakacak şekilde lam tutucuya şu şekilde yerleştirilecektir.

Lam oraya yerleştirilir ve yay basıncıyla sabit tutulur. Ardından bu sağlam parçadaki, bu delik. Lam tutucu, mikroskop tablası üzerine bu iki kılavuz arasına yerleştirilir.

Numuneyi yerinde tutan, sahnenin arkasındaki bir klipsin altına giren küçük bir kertik olduğunu fark edeceksiniz. Bu yerleştirildiğinde, belirgin bir klik sesi duyarsınız. Tamam, kurulacak bir sonraki şey, dokuyu gerçekten yakalayacak olan einor tüpleridir.

0,2 veya 0,5 mililitrelik einor tüpleri kullanma seçeneği mevcuttur; bu tüpler, sahnenin altındaki özel bir yuvaya yerleştirilen tepsi içerisindeki küçük tutuculara sığmaktadır. Böylece doku, aslında einor tüpü kapağının üst kısmında yakalanmış olacaktır. Burada örneklendirme amacıyla 0,5 mililitrelik bir einor tüpü kullanıyorum.

Kapak şu şekilde yerleştirilir, altından kaydırılarak geçirilir ve ardından kapağın dudakları şu dişler tarafından sabitlenir; ardından kapak şu şekilde alttan kilitlenir ve tüm bu kap tutucuya yerleştirilir. Artık, nükleik asitler, özellikle de RNA izolasyonu için yakalama yapılıyorsa, kapağın içine doğrudan birkaç yüz mikrolitrelik bir triol çözeltisi damlası konulabilir. Triol reaktifindeki fenol ve diğer aşındırıcı kimyasallar nedeniyle, bunun cihaza dökülmemesi elbette önemlidir.

Daha önce belirttiğim gibi, bu mikroskobun kontrol ünitesidir; bu cihazda objektifler, aydınlatma ve odaklama tamamen motorize edilmiştir. Odaklama düğmesi burada, üst kısımdadır. Sahnenin Y ekseni öteleme kontrolü ise bu düğmedir.

X çeviri kontrolü buradadır. Sol alt kısımda, aydınlatmayı değiştiren iris kontrolü yer alır; mikroskop, her büyütme seviyesi için hangi aydınlatma düzeyinin ayarlandığını hatırlar. Böylece objektiften objektife geçtiğinizde, aydınlatma otomatik olarak ayarlanır.

Ve son olarak, kontrol ünitesinin sağ tarafında, objektifler arasında geçiş yapmayı sağlayan objektif revolver kontrolü yer almaktadır. Bu cihazda 4x, 10x, 20x, 40x ve 63x olmak üzere beş adet objektif bulunmaktadır. Doku görüntüsü alma sürecindeki ilk adım, ekranda gördüğünüzün gerçekte yakalayacağınız görüntüyle aynı olması için mikroskobu hizalamaktır.

Lazer menü seçeneğine gidiyoruz ve kalibre et'i seçip devam et'e tıklayarak onaylıyoruz. Şu an 4x ayarındayım ve burada nispeten geniş bir membran alanı olduğunu görebilirsiniz. Doku olmadığını not edin.

Hizalamayı lamın bir köşesinde gerçekleştiriyoruz. Lazer, ekranın sağ üst köşesine bir çapraz çizgi (crosshatch) atmıştır; fareyi kullanarak bunu ekranın merkezine getireceğim ve ardından bu çapraz çizginin üzerine tıklayacağım; bilgisayar başka bir çapraz çizgi daha kesecektir. Bununla hizalayıp tıklayacağım ve ardından üçüncü bir çapraz çizgi kesecek, biz de orada hizalama yapacağız.

Mikroskop için 4x objektif kalibrasyonu tamamlanmış, hizalama yapılmış ve doku yakalama işlemi için hazır hale getirilmiştir. Hizalama işlemi sırasında, kesilen çapraz çizgilerin oldukça kalın olduğunu fark etmiş olabilirsiniz. Bunun nedeni, lazer kontrol gücünün çok yüksek bir ayara getirilmiş olmasıdır.

Muhtemelen bu düzeyde bir kesme gücüne ihtiyacımız olmayacak. Bu nedenle, bir çizgi keserek lazer gücünün nasıl ayarlandığını göstereceğim. Ekrana serbest el ile diyagonal bir çizgi çizersem ve ardından bir kapak seçip "start cut" (kesimi başlat) düğmesine basarsam, bilgisayar tanımladığım çizgi boyunca kesim yapacaktır.

Ve bu çizginin ne kadar geniş olduğunu görebilirsiniz. Lazer gücünü düşürmem gerekiyor. Öyleyse bunu yapalım.

Lazer menüsüne gidiyorum, kontrol kısmına giriyorum ve burada yoğunluğun maksimuma çıkarıldığını göreceksiniz. Lazer yoğunluğunu yaklaşık 30 civarına düşüreceğim ve bu ayarı onaylayacağım. Şimdi yeni bir çizgi çizip kestiğimde, yanmış dokunun veya yanmış membranın genişliğinin önemli ölçüde azaldığını göreceksiniz.

Genel bir prensip olarak, buharlaşan doku miktarını minimize etmek için lazer kontrol gücü mümkün olan en düşük ayara getirilmelidir. Şimdi, bu yansıtıcı gözü kullanarak bazı dokuların gerçek yakalama işlemini göstereceğim. Şu anda 4x objektif lensindeyim ve nispeten büyük bir doku parçasını yakalamayı deneyeceğim.

Bu gözün merkezinden lensin tamamını izole edeceğiz. Bunu yapmak için serbest el ile kesim yapacağım. Bu nedenle, ekranın üst kısmındaki çizim kontrolünü kullanarak kesme işlemini gerçekleştireceğim.

Yakalanacak örneğin etrafına bir çizgi çizeceğim. Bunu çok düşük büyütmede yapıyorum. Daha hassas kesimlerle veya daha küçük doku alanlarıyla ilgileniliyorsa, belli ki daha yüksek bir büyütmede yakalama yapılabilir.

Kesilecek alanı seçtim ve şekil çizme menüsüne geçiyorum; genellikle kapalı çizgiler seçeneğini açık tutarım. Kapalı çizgiler özelliği, bir nesnenin etrafında düzensiz bir şekil çizildiğinde ve yakalanacak nesne tamamen çevrelenmediğinde, şeklin açık uçları arasına düz bir çizgi çizer. Kesilecek alan belirlendikten sonra kesme işlemine başlayacağız ve kontrol kutusunun lazeri ilgili alanlara odakladığını ve alanı neredeyse tamamen kestiğini göreceksiniz.

Büyük doku parçaları yakalarken genellikle "hanging Chad" (tam ayrılmamış doku parçası) durumuyla karşılaşırız. Doku tamamen ayrılmaz. Bu nedenle denenecek ilk şey, dokuyu tekrar kesmektir; böylece lazer dokuyu çevreleyerek takip edecektir.

Alternatif olarak bazen, dokunun asılı kaldığı yere küçük bir boşluk çizip oradan keserek dokunun düşmesini sağlayabilirsiniz. Böylece dokunun bu kısmını almış olduk. Daha önce belirttiğim gibi, toplayıcı moduna geçerek doku parçasının gerçekten toplayıcıda veya einor tüp kapağında olduğunu doğrulayabiliriz.

Şimdi buradaki toplayıcı kontrol düğmesine basacağım ve mikroskobun görüntüyü değiştirdiğini göreceksiniz. Şu an inner tüpün iç yüzeyine bakıyoruz ve ekranın sağ alt kısmında yakalanan doku parçası yer alıyor; odaklandığımızda bireysel hücreleri görebiliyoruz. Böylece, seçtiğimiz dokuyu gerçekten yakaladığımızı doğrulamış olduk.

Şimdi, yakalama işlemi yüzde yüz verimle gerçekleşmez çünkü yakalanan bu dokular temel olarak düşen yapraklar gibidir. Yakalanan doku fragmanlarının belirli bir küçük yüzdesi einor tüp kapağının içine düşmeyecektir, ancak istenen doku yakalandıktan sonra kayıp oranı çok düşüktür. Bir sonraki adım, elbette, yakalanan dokuyu içeren einor tüpünü cihazdan çıkarmak ve kapağını güvenli bir şekilde kapatmaktır.

Bunu yapmak için, tutucuyu şu şekilde çok nazikçe düz bir şekilde dışarı çekiyoruz. Ardından, tüp kapağının dik kalması gerektiğini unutmadan, tutucuyu tepside çıkarın ve sonra tüpü çok nazikçe çekin. Şu şekilde kaydırın, tutucudan dışarı çıkarın ve ardından kapağı değil, iç kısmı şu şekilde hareket ettirin.

Şimdi, eğer kapağa önceden bir damla triol yerleştirdiyseniz, dokunuz çözünme sürecine çoktan başlamış olacaktır; böylece laboratuvarınıza dönebilir ve RNA izolasyonunuzu tamamlayabilirsiniz. Amon'un tercih ettiğimiz üretici olması gibi, mikro ölçekli RNA izolasyon kitleri üreten birçok üretici bulunmaktadır. İşte hepsi bu kadar.

Böylece bugün size UC Irvine'deki lazer yakalama mikroskobu tesisini tanıtmış oldum. Söz konusu dokulardan RNA izolasyonu hazırlığı kapsamında, pen foil kaplı lamlardan dondurulmuş kesit dokuların nasıl yakalandığını gösterdik. İlginiz için teşekkürler ve kendi lazer yakalama mikrodisseksiyon çalışmalarınızda başarılar dilerim.