Protein Biyobelirteç Tespiti için Bir Kapiller Elektroforez İmmünoassay

Hastalıkla ilişkili bir protein biyobelirtecini tespit etmek için bir immünoassay plakası alın.

Plaka, boyuta dayalı protein ayrımı için gerekli olan önceden doldurulmuş ayırma ve istifleme matrislerini içerir.

Proteinleri ve immünoassay reaktiflerini farklı plaka kuyucuklarına yükleyin.

Çalıştırmayı bir CEI analizörü içinde başlatın. Analizördeki kılcal kartuş, her bir kılcal damar içinde bir jel oluşturmak için matrisleri aspire eder.

Kılcal damar daha sonra proteinleri aspire eder. Elektroforez sırasında, proteinler moleküler ağırlıklarına göre göç eder ve ayrılır.

Analizör, kılcal damardaki proteinleri hareketsiz hale getiren UV ışığı verir.

Yıkama tamponu, matrisleri ve bağlanmamış proteinleri uzaklaştırır. Engelleme arabelleği daha sonra içeri akar ve spesifik olmayan etkileşim sitelerini engeller.

Analizör, biyobelirteçlere bağlanan birincil antikorları, ardından birincil antikorlarla etkileşime giren peroksidaz konjuge ikincil antikorları ekler.

Yıkayın ve ardından kemilüminesans substratını ekleyin. Peroksidaz, substratı oksitleyerek lüminesans yayar.

Lüminesans yoğunluğunu ölçün ve biyobelirteç tespiti için protein standardıyla karşılaştırın.

ALS hastalarından ve sağlıklı deneklerden 100 mikrolitre insan trombosit lizatı topladıktan sonra, kılcal damar yerleşimi ve numune hazırlama için kurum içi oluşturulan şablonları doldurun. Numune karışım hazırlama tablosu dinamiktir ve kaynaktan ne kadar hacim çıkarılması gerektiğini otomatik olarak hesaplar. Oda sıcaklığında kalması gereken standart paket hariç tüm tahlil reaktiflerini buzun üzerine yerleştirin.

Floresan ana karışımını hazırlamak için, berrak bir DTT tüpüne 40 mikrolitre deiyonize su ekleyin ve 20 mikrolitre 10X numune tamponu ve hazırlanan 400 milimolar DTT solüsyonundan 20 mikrolitre ekleyin.

Biyotinile edilmiş merdiveni hazırlamak için, kitte verilen beyaz tüpe 16 mikrolitre deiyonize su, 2 mikrolitre 10X numune tamponu ve hazırlanan 2 mikrolitre 400 milimolar DTT solüsyonu ekleyin. Nazikçe karıştırdıktan sonra, denatüre etmeden önce merdiven solüsyonunu 200 mikrolitrelik bir PCR tüpüne aktarın.

600 mikrolitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne 1,5 mikrolitre 10X numune tamponu ve 148,5 mikrolitre deiyonize su ekleyin. ve tüpü buzun üzerine yerleştirmeden önce karıştırmak için girdap. İlgilenilen antikorları tabloda belirtildiği gibi doğrudan seyrelticiye ekleyin ve homojen bir antikor çözeltisi elde etmek için pipet ucunu birkaç kez yıkayın.

Kılcal numune karışımını hazırlamak için, tüm PCR tüplerini açın ve tabloda belirtildiği gibi her tüpe 1,6 mikrolitrelik floresan 5X numune tamponu ekleyin, ters pipetleme tekniği kullanarak, tampon eklenirken her tüpü hemen kapatın. Tamponun tamamı eklendiğinde, tüm tüpleri açın ve tabloda belirtildiği gibi hacimlerde 0.1x'lik bir numune tamponu ekleyin, tampon eklenirken her tüpü hemen kapatın.

Ardından, tüm tüpleri açın ve protein örneklerini tabloda belirtildiği gibi ekleyin ve her bir tüp kapağını hemen kapatın. Tüm numuneler eklendiğinde, tüm tüpleri bir tezgah üstü santrifüjde kısaca santrifüjleyin. Karıştırmak için girdap yapın ve numuneleri tekrar santrifüjleyin.

İkinci santrifüjlemenin sonunda, tüm tüpleri ısıtılmış kapaklı bir termodöngüleyiciye yerleştirin ve numuneleri belirtilen koşullar altında denatüre edin. Denatürasyonun sonunda, numuneleri tekrar santrifüjleyin, karıştırın ve santrifüjleyin ve tüm tüpleri buz üzerinde bir tüp rafına yerleştirin.

Şekli kılavuz olarak kullanarak, D1 kuyusuna 10 mikrolitre streptavidin yaban turpu peroksidazı, D2'den D5'e kadar olan kuyucuklara 10 mikrolitre uygun ikincil antikor, B sırasındaki her bir oyuğa ve C1 kuyusuna 10 mikrolitre antikor seyreltici, C2'den C25'e kadar olan kuyulara 10 mikrolitre uygun primer antikor, 1 numaralı PCR tüpünden A1 kuyusuna 5 mikrolitre biyotinillenmiş merdiven, A2'den A25'e kadar olan sıralara 3 mikrolitre numune ve E sırasının her bir oyuğuna 15 mikrolitre taze hazırlanmış luminol peroksit.

Numune karışımının ve reaktiflerin küçük kuyuya doğru sırayla pipetlenmesi, deneyin başarısı için kritik öneme sahiptir, bu nedenle çok dikkatli bir şekilde yapılmalıdır.

Daha sonra, belirlenen her bir yıkama tamponu kuyusuna 500 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin ve plaka içeriğini santrifüjleme ile döndürün.