Microtiter Plate Format Broth Seyreltme Birinci ve İkinci Line İlaçları Mycobacterium tuberculosis kompleksi Antimikrobiyal Duyarlılık Testi

Mikobakteri tüberkülozunu tedavi etmek için nispeten az sayıda ilaç mevcuttur, bu nedenle herhangi bir ilaca direnç bir endişe kaynağıdır. Bu video makalesinde, M tüberkülozunun aynı anda 12 farklı mikrobiyal ilaca karşı antibiyotik direncini test etmek için bir prosedür açıklanmaktadır. Bu nedenle, M tüberkülozunun antimikrobiyal direncini hızlı bir şekilde tespit etme yeteneği, antibiyotik duyarlılığını test etmek için burada direnç suşlarının artışını kontrol etme çabasında çok önemlidir.

M tüberkülozu ilk olarak bir bakteri süspansiyonu olan katı veya et suyu ortamında büyütülür. İnkükülasyon hazırlanır ve inkübasyonu takiben birinci basamak ve ikinci basamak ilaçlar dahil olmak üzere 12 ilacın farklı konsantrasyonlarını içeren bir mikrotitre plakasına eklenir. Her bir kuyucuktaki büyüme derecesi, bir ayna kutusu kullanılarak manuel olarak veya yarı otomatik bir plaka okuyucu kullanılarak belirlenir.

Elde edilen veriler, test edilen her ilaç için minimum inhibitör konsantrasyonu gösterir ve test edilen TB suşunun hangi antibiyotiklere dirençli olduğunu gösterir. Bu sonuçlar tüberküloz tedavisi için uygun ilacın seçilmesine yardımcı olur. Merhaba, benim adım Nancy Ek ve Rochester, Minnesota'daki Mayo Clinic'teki Myco Bakteriyoloji Laboratuvarı'nın direktörüyüm.

Bugün, mycobacterium tuberculosis için antibiyotik duyarlılık testi yapmak için bir yöntem açıklayacağız. Bu tekniğin makro et suyu seyreltme gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, her ilaç için bir MİK belirlenmesi ve aynı anda 12 antibiyotiğin test edilmesidir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımda kalite uzmanı olan ve bir laboratuvar tezgahında çalışan Kurt Jude olacak.

Bir kan agar plakası, üç Middlebrooks yedi H 10 plakası, bir salin ara cam boncuk tüpü ve hastanın adı ve numune kimlik numarası ile bir mikrotitre plakası etiketleyerek bu prosedüre hazırlanın. Ek olarak, kan agarını ve yedi H 10 plakasını saflık olarak etiketleyin. Bu yedi H 10 plakasından birini bire bir koloni sayısı ve diğerini bir ila 50 koloni sayısı olarak etiketleyin.

Ardından tepsiyi geçişe yerleştirin. Ardından, sağlam bir ön önlük, baş örtüsü eldivenleri, galoşlar ve bir solunum cihazı giyerek üçüncü seviye biyogüvenlik BSL üç tesisinde çalışmaya hazırlanın. Burada bir pappa solunum cihazı kullanılır.

Ardından tepsiyi geçişten alın. Daha sonra BSL üç tesisinde, biyolojik güvenlik kabininin yüzeyini dezenfekte edin. Ardından, kağıt havlunun yanındaki havalandırma panelinden yaklaşık altı inç uzakta, davlumbazın içine dezenfektanla ıslatılmış bir kağıt havlu yerleştirin.

Aşılama halkaları, pipetleyiciler ve uçlar, uygun bir atık imha kabı, bir nephi, TER ve bir girdap yerleştirin. Başlık hazırlandıktan sonra, organizmayı McFarland 0.5 standart A yedi H dokuz et suyu ve OADC içeren bir tuzlu su tüpü olan bir raf ile birlikte kağıt havlu üzerine yerleştirin. Bu kurulum katı, orta seviyeden yapılır.

Bir hastanın örneğinden katı bir orta kültürden inokülum hazırlayın. Kolonileri kazımak için steril bir halka kullanın ve bunları tuzlu ara cam boncuk tüpüne aktarın. Süspansiyonu 30 ila 60 saniye boyunca girdaplayın.

Numuneyi McFarland standardıyla karşılaştırarak görsel olarak inceleyin. Aktarılan miktar standarda eşit veya standarttan daha büyük olmalıdır. Değilse, daha fazla bakteri örneği ve girdap ekleyin. Yine.

McFarland standardı eşleştikten sonra, daha büyük bakteri kümelerinin yerleşmesine izin vermek için aşının 15 dakika oturmasına izin verin. Ardından, asılı bakterilerin yoğunluğunu sıfıra kadar ölçmek için bir nefi TER kullanın. Nefis ter.

Önce nephiter'e boş bir tuzlu su boncuk ara tüpü yerleştirin. Cihazı sıfırlamak için kalibrasyon düğmesine basın, ardından McFarland 0.5 standardını Nephiter'e yerleştirin ve kalibrasyon düğmesine tekrar basın. Cihaz kalibre edildikten sonra, McFarland standardını çıkarın ve aşıyı yerleştirin.

Aşı okuması, McFarland standart okumasına eşit olmalıdır. Okuma çok düşükse, tüpü çıkarın ve plakadan daha fazla bakteri aktarın. Sonra girdap yapın ve örneği tekrar okuyun.

Okuma çok yüksekse, tüp girdabına tuzlu su ekleyin. Ardından örneği tekrar okuyun. Bakteri konsantrasyonu McFarland standardına ulaşana kadar aşıyı gerektiği gibi ayarlamaya devam edin.

Ardından, tüpün üst üçte birlik kısmından 100 mikrolitre aşıyı çıkarmak için 200 mikrolitrelik bir pipetleyici ve aerosole dayanıklı uzun bir pipet ucu kullanın. Dibe çöken herhangi bir topaklanmayı önlemek için, aşılayın, Middlebrook yedi H dokuz suyu, aşılamayı plakalamak için aşılanmış suyu 20 saniye boyunca yavaşça girdaplar Mikrotitre plakasını üreticinin paketinden çıkararak başlayın. Kurutucu maviyse veya folyo paketi hasarlıysa kullanmayın.

Plaka, en etkili veya birinci basamak ilaçlar ve ikinci basamak ilaçlar da dahil olmak üzere her bir kuyucukta test edilecek 12 antimikrobiyal içerir. Aerosol oluşturmamaya dikkat ederek yedi H dokuz et suyu aşısını dikkatlice bir trth'ye dökün. Ardından, mikro baştankara plakasını burada gösterildiği gibi etiket dışarı bakacak şekilde yerleştirin ve her bir oyuğa 12 mikrolitre aşı eklemek için 100 kanallı bir pipetleyici kullanın.

Ardından, koloni sayımlarını gerçekleştirmek için plakalar hazırlayın. İlk olarak, bir mikrolitrelik bir numune halkasını pozitif kontrol kuyusundan bire bir etiketlenmiş yedi H 10 plakasına aktararak seyreltilmemiş bir plaka hazırlayın. Ardından, plakayı burada gösterildiği gibi çizmek için halkayı kullanın.

Daha sonra, bir ila 50 seyreltme hazırlamak için, pozitif kontrol kuyusundan bir mikrolitrelik bir döngü aktarın ve 50 mikrolitre su çizgisi ile tüpe döndürün. Bu seyreltmenin bir mikrolitresi, bir ila 50 olarak etiketlenmiş plaka üzerindedir. Saflık plakalarını, trth'den 50 mikrolitre aşılamayı uygun şekilde etiketlenmiş kan agar ve yedi H 10 plakasına pipetleyerek ve izolasyon için çizgiye maruz bırakarak aşılayın.

Daha sonra aşılanmış trth'nin üzerine başka bir trth istifleyin ve bunları yavaşça atılan kabın içine yerleştirin. Mikrotitre plakasına yapışkan bir conta yerleştirin. Ardından, beyaz desteği kullanarak, yeterli tavanı sağlamak için her bir kuyucuğa sıkıca bastırın ve kırışıklık olmadığından emin olun.

Mikro baştankara plakasını, tüberküloz sidal dezenfektan ile ıslatılmış bir kağıt havluyla silerek dezenfekte edin. Ardından mikrotitre plakasını plastik bir torbaya koyun ve bir ısı yalıtımı ile kapatın. Son olarak, nefi, lter girdabı, plakalar ve tüpler dahil olmak üzere tüm malzemeleri tüberküloz sidal dezenfektan ile silerek dezenfekte edin.

Burada dezenfeksiyonu sağlamak için yeterli zaman geçtikten sonra pro sprey kullanılır. Pro sprey için 15 dakika. Plakalar bantla bantlanır, plastik torbalara yerleştirilir ve sızdırmaz malzemeler biyogüvenlik kabininden çıkarılır ve geçiş yerine yerleştirilir.

Atılan kırmızı torba kapatılır ve bu noktada bir büküm kravat ile kapatılır, önlük, patik ve eldivenler çıkarılır. Antre odasına ilerledikten ve ellerinizi yıkadıktan sonra, solunum cihazını çıkarın ve dezenfekte edin ve tekrar ellerinizi yıkadıktan sonra saklayın, yeni bir elbise giyin ve BSL üç süitinden çıkın. Daha sonra, atılan kap otoklavlanır.

Bunu takiben, mikrotitre plakasını ve yedi H, 10 ve kan burgu plakasını sağ tarafı yukarı bakacak şekilde, 35 ila 37 santigrat derece inkübatörde% beş ila 10 CO2 ile inkübe edin. Bu kabul edilebilir, çünkü plaka iyi kapatılmıştır ve plastik bir torba içinde, mikobakteri tüberkülozu oluşturma süresi yaklaşık 12 ila 24 saattir, bu nedenle büyümenin kontrolün dibinde bir hücre peleti oluşumu olarak görülebilmesi en az bir hafta sürecektir. Peki, 10. günde, sızdırmaz bir ST mikro kısasa bıçak bıçağını ayna kutusunun platformuna yerleştirerek manuel bir ayna okuması gerçekleştirin.

Büyümeyi görselleştirmeye yardımcı olması için bir masa lambası kullanın, en iyi kontrastı elde etmek için gerektiği gibi ayarlayın. Bu durumda büyüme kontrol kuyularını, H 11 ve H 12'yi aynaya bakarak kontrol edin. Büyüme varsa, kuyu bulanık görünecek veya burada gösterildiği gibi tortu varmış gibi görünecektir.

Bu örnekte gösterildiği gibi bir büyüme yoksa, kuyu açık görünecektir. Bu durumda, plakayı tekrar inkübatöre yerleştirin ve 21 güne kadar inkübatöre devam edin. Her koşul için, büyümeyi kontrolle karşılaştırın.

Öyleyse, her ilaç kaydı için, büyümesi olmayan ilk seyreltme. Bu, ilacın sonuçları incelemesi için minimum inhibitör konsantrasyon veya MIC'dir, örneğin vizyon gibi otomatik bir plaka okuyucu kullanarak, bir ST plaka yazılımı olan Myco TB'yi açarak ve barkodun dışarı bakacak şekilde mühürlü plakayı yerine oturtarak başlayın. Burada gösterildiği gibi, büyüme bulanıklık veya bilgisayar ekranında bir kuyunun dibinde bir hücre birikintisi olarak görünür.

İlk olarak, büyüme kontrollerini inceleyin. Daha önce olduğu gibi. Bu büyüme için negatifse, plakayı 21 güne kadar inkübatöre geri koyun.

Bu pozitifse, her ilaç için ekranda büyüme göstermeyen ilk kuyucuğa dokunarak sonuçları kaydedin. Bazı durumlarda, bakteri, tortu veya ilaçlar kuyu dibine çökelir. Takip etme olarak bilinen bu fenomen, aynı boyutta pelete sahip birkaç kuyu ile gösterilir ve aslında pozitif büyüme olarak kabul edilmez.

Daha sonra, bakteri konsantrasyonlarını belirlemek ve saflığı değerlendirmek için yedi H 10 ve kan agar plakası incelenir. Kanlı agar plakası 48 saat sonra büyüme göstermemelidir. Kan agar plakasındaki büyüme, hızla büyüyen bakterilerle kontaminasyonu gösterir.

Büyüme varsa, mikrotitre testi tekrarlanmalıdır. Yedi H 10 saflık plakası bir organizmanın büyümesine sahip olmalıdır. Tip EM tüberkülozu devetüyü, renkli, buruşuk ve pürüzlü görünmelidir Kontamine ise, Mikrotitre testinin saf bir kültürden tekrarlanması gerekir.

Bakteri konsantrasyonunu değerlendirmek için, yedi H 10 plakasındaki kolonileri sayın. Daha sonra ekteki yazılı belgedeki tabloyu kullanarak koloni sayımlarını hesaplayın. Mycobacterium tuberculosis bir hasta örneğinden büyütüldü ve antibiyotik direnci bu videoda tarif edildiği gibi değerlendirildi, burada gösterilen plakada, en yüksek konsantrasyonlar üstte ve en düşük konsantrasyonlar altta olmak üzere artan konsantrasyonlarda 12 farklı ilaç mevcuttur.

İlacın minimal inhibitör konsantrasyonu veya MIC'i, herhangi bir büyüme göstermeyen ve Klinik ve Laboratuvar Standartları Enstitüsü tarafından belirlenen standartlaştırılmış kesme noktaları kullanılarak burada gösterilen resimde daire içine alınan ilacın en düşük konsantrasyonu ile gösterildi. Burada gösterilen veriler, bu TB suşunun Isid ve Rifampin'e dirençli olacağını göstermektedir. İn vitro olarak, oin, moksifloksasin, streptomisin ve rifabutin dahil olmak üzere diğer bazı ilaçlarda görülen yüksek mikroplar, EM tüberküloz suşunun bu ajanlara karşı direncini düşündürmektedir.

MİK sonuçları, kişiselleştirilmiş bir tedavi planı geliştirmek için tüberküloz tedavisinde deneyimli bir bulaşıcı hastalık uzmanı tarafından kullanılmalıdır: Bir kez ustalaştıktan sonra, bu tekniğin bir izolat oluşturması yaklaşık 40 dakika sürer. Bu prosedürü denerken, bunun bir solunum yolu patojeni olduğunu hatırlamak önemlidir ve bir kez aerosol ürettikten sonra, bu videoyu izledikten sonra, mikro et suyu seyreltme yöntemini kullanarak antimikrobiyal duyarlılık testi olan mycobacterium tuberculosis'in nasıl kurulacağını iyi anlamanız gerekir. Mycobacterium tuberculosis ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve gerektiğinde her zaman solunum koruması gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.