Name: Microtiter Plate Format Broth Seyreltme Birinci ve İkinci Line İlaçları Mycobacterium tuberculosis kompleksi Antimikrobiyal Duyarlılık Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-24T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 39 s
Description: Öğrenin, Mycobacterium tuberculosis'un 12 farklı antimikobakteriyel ilaca karşı direncini mikrotiter plaka formatında eş zamanlı test etme yöntemini. Bu prosedür, minimum inhibitör konsantrasyon değerlerinin belirlenmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz çalışma sırasında, yardım ettikleri için Mayo Clinic tüberküloz Laboratuvarı, laboratuvar teknologlar teşekkür etmek istiyorum.

Her laboratuvar, inokulum hazırlanması ve plaka içine inokulum pipetleme için uygun bir biyogüvenlik seviyesini belirlemek için bir risk değerlendirmesi Kurumsal Biyolojik Güvenlik Görevlisi ile işbirliği içinde yerine getirmesi gerekir. Microtiter plakalar inoküle ve plastik bir yapıştırıcı mührü ile mühürlenmiş kadar laboratuar, 3 laboratuvar (BSL3) uygulamaları biyogüvenlik düzeyi kullanabilir. Bu plakalar daha sonra ısı da kapalı bir plastik torba içine yerleştirilir. Kuluçka ve yorumlama okuma mikrotiter plate bir biyogüvenlik düzeyi 2 laboratuvar (BSL2) yapılır. 1. Malzemelerin Etiketleme <ol><li> Etiket kan agar plaka, üç Middlebrook 7H10 plakaları, Middlebrook 7H9 suyu, tuzlu su arasında cam boncuk tüp ve BSL2 uygun tanımlayıcılar (örneğin, hasta ismi, tıbbi kayıt numarası) ile mikrotiter AST plaka. </li><li> Etiket kanlı agar ve "saflık onay" olarak kaplama 7H10. Inokulum Periyodik koloni sayımı, organizmaların uygun bir konsantrasyon testte kullanılan olmasını sağlamak için tavsiye edilir. Yapılan koloni sayımı "1 / 1 koloni sayısı" ve "1 / 50 koloni sayısı" ile etiketlenmiş 7H10 plakaları iki olması gerekir. </li></ol> 2. BSL3 gitmek Teknolog hazırlıkları <ol><li> Uygun kişisel koruyucu ekipmanlar BSL3 çalışması için gerekli olan ve katı ön cüppe, baş örtüsü, eldiven, galoş ve bir maske içerir. Her kurum, kendi kurumu Endüstriyel Hijyen görevlisi ile işbirliği içinde kendi solunum koruma planı oluşturmalıdır. Laboratuvarımızda, motorlu hava temizleme respiratörleri (PAPRs) ve HEPA filtreden donatılmış, N95, yarım yüz gaz maskeleri de dahil olmak üzere çeşitli solunum maskeleri ve var. </li></ol> 3. Biyolojik güvenlik kabini hazırlanması <ol><li> BSL3, yüzey dezenfeksiyon ve yaklaşık 6 inç havalandırma panelinden dezenfektan ile ıslatılmış kağıt havlu yerleştirerek biyolojik güvenlik kabini (BSC) hazırlamak. </li><li> Sol tarafta bir atık kabı ve sağ tarafta küçük nephlometer ve vortexer yerleştirin. </li><li> Aşılamak döngüler, pipetors ve ipuçları kağıt havlu yanında. </li><li> Organizma (et suyu veya katı orta) ve kağıt havlu üzerine McFarland 0.5 standart bir raf yerleştirin. </li></ol> 4. Nephelometeri Kalibrasyonu <ol><li> Nephelometeri tuzlu arasındaki cam boncuk tüp yerleştirin ve tuzlu arasındaki boş kullanarak sıfır araç ayarlamak. </li><li> Nephelometeri McFarland 0.5 standart yerleştirin ve üreticinin talimatlarına göre kalibre. </li></ol> 5. İnokulum Hazırlanması <ol><li> ≥ 0.5 McFarland Standart elde edilinceye kadar uygun etiketli tuzlu arasındaki cam boncuk tüp içerisine steril bir döngü kullanarak katı orta BSC, kazıma koloniler çalışmak. </li><li> Görme örnek incelemek ve McFarland Standart karşılaştırın. </li><li> 30-60 saniye için Vortex örnek. </li><li> 15 dakika boyunca yerleşmek için bir zamanlayıcı ayarlamak inokulum izin verin. </li></ol> 6. Mikrotiter plate Aşılanması <ol><li> McFarland 0.5, 4.1 ve 4.2 adımları kalibre nephelometeri kullanarak tuzlu arasında suyu ile inokulum ayarlayın. Bu 30 dakika (ortalama üretici özellikleri) içinde tamamlanması gerekir. </li><li> 200 mcL pipetter ve tuzlu boncuk arasındaki tüp TOP 1 / 3 üncü inokulum 100 mcL kaldırmak için bir UZUN aerosol dayanıklı pipetlemeyin ucu kullanın. Middlebrook 7H9 Broth inoküle edin. 20 saniye boyunca inoküle 7H9 suyu yavaş yavaş girdap. </li><li> AST mikrotiter plate üreticinin paketinden çıkarın. Folyo paket hasarlı ise kurutucu mavi veya kullanmayın. </li><li> 01:50 seyreltme hazırlanmasında daha sonra kullanmak üzere steril bir tüpe steril su 50 mcL pipetleme 1:50 sulandırma tüpü hazırlayın. </li><li> 7H9 broth inokulum bir çukur içine dikkatlice dökün. AEROSOLS JENERATÖR KAÇININ. </li><li> AST mikrotiter plate etiketi ile karşı karşıya koyun. </li><li> 12-kanal pipetter, her bir kuyunun 100 mcL inokulum eklemek için kullanın. </li><li> Koloni sayımı için dilüsyonları hazırlayın: <ol type="a"><li> 1 / 1 seyreltme, "1 / 1" etiketli 7H10 plaka üzerinde 1 ul döngü şeritli de pozitif kontrol (H12) hazırlanır. </li><li> 1 / 50 dilüsyon de pozitif kontrol (H12) 1 ul döngü yukarıda hazırlanan su borusu 50 ul ile aşılama ve tüp içine dönen tarafından hazırlanmıştır. Bu seyreltme plaka Streak 1 mcL "1 / 50" olarak etiketlenmiş. </li></ol></li><li> Uygun bir şekilde etiketlenmiş kanlı agar ve 7H10 plaka ve izolasyonu için çizgi üzerine 50 mcL pipetleme çukur saflığı plakalarını aşılamak. </li><li> YerAST mikrotiter plate üzerinde yapışkan bir mühür. Beyaz arka mühür kullanılarak yeterli sızdırmazlık sağlamak için her bir kuyunun üzerine sıkıca bastırın. Kırışıklıkların oluşmasını önlemek. </li><li> Mikrotiter plate bir ısı mühür veya bant ile plastik bir torba ve yakın bir tüberkülsit dezenfektan ve yer mikrotiter plate ile ıslatılmış kağıt havlu ile silinerek dezenfekte edin. <ol type="a"><li> Plastik torba birincil plakanın bir sızıntı veya dökülme var olmalıdır tüm suyu yer olduğundan emin olmak için ikincil bir konteyner olarak hizmet vermektedir. </li></ol></li></ol> 7. Malzemelerin dezenfeksiyonu ve biyolojik güvenlik kabini <ol><li> Aerosollerin üretimi önlemek için hafifçe atmak konteyner içine koymadan önce başka bir çukur inoküle çukur üstüne yerleştirin. </li><li> Tüberkülsit bir dezenfektan ile silerek nephlometer, vortexer, tabak, tüpler, vb de dahil olmak üzere tüm malzemeler dezenfekte edin ve üreticinin talimatlarına göre BSC çıkarmadan önce dezenfeksiyon sigortalamak için uygun zamanı bekleyin. Örneğin, Prospray, kullandığımız tüberkülsit dezenfektan, mikobakteriler öldürmek için 15 dakika gerektirir. </li><li> Otoklav önce, bir biohazard çanta ve mühür atın kap yerleştirin. </li></ol> 8. Kuluçka <ol><li> Tabaklar medya ile aşağı inkübe edilmelidir ve bakım, herhangi bir sıvı dökmekten veya sıçramasını önlemek için alınmalıdır. </li><li> 35-37 ° C inkübatör AST mikrotiter tabak tabak, 7H10 ve kan agar plaklarına BSL2 laboratuar% 5-10 CO 2 ile% 5-10 CO 2 ile inkübe edin. <ol class="lalpha"><li> Plaka iyi kapalı ve mühürlü bir plastik torba içinde, çünkü bizim laboratuar, bu kabul edilebilir. </li></ol></li><li> 2'den fazla mikrotiter AST plakaları, üreticinin talimatlarına göre kuvöz yığılmış olmalıdır. </li></ol> 9 - Temsilcisi sonuçları Sonuçların yorumlanması: Mühürlü AST microtiter plakalar elle bir ayna kullanarak, bir yardımcı olarak ya da Vizyonumuz (TREK Diagnostics) gibi bir otomatik plaka okuyucu ile okunabilir. Plakalar aşılama sonra en kısa sürede 7 gün olarak incelenebilir. (Yani, iyi altındaki hücreleri mevduat) pozitif olup olmadığını belirlemek için, H11 ve H12 pozisyonları büyümesini kontrol kuyuları inceleyin. Büyümesini kontrol kuyuları olumlu değilse, plaka reincubate ve büyümesini kontrol kuyuları pozitif olana kadar (örneğin, 10 gün, 14 gün) periyodik olarak yeniden gözden. <ol type="a"><li> Ayna okuyun: <ol type="i"><li> Platform üzerine yerleştirin AST mikrotiter plate mühürlü; </li><li> 7 gün inkübasyondan sonra büyümesini kontrol kuyuları okuyun; bu negatif, reincubate AST mikrotiter plate ise; </li><li> Büyümesini kontrol eden kabul edilebilir ise, o zaman ilaç içeren kuyu okuyun. Her ilaç için, büyüme, büyüme kontrolü ile ilaç kuyu karşılaştırarak ilk seyreltme kaydedin. </li><li> Büyüme, bulanıklık gibi ya da bir kuyunun dibinde hücreleri bir depozito olarak görünür. </li></ol></li><li> Enstrüman okuyun: üreticileri yönergeleri izleyin; aşağıdaki talimatları okuma Vizyonumuz platformu ile ne yapılabilir bir örnektir: <ol type="i"><li> Giriş yap </li><li> "MYCOTB" AST plaka yazılımı kullanın. </li><li> Kullanıcı bakan barkod ile mühürlü plaka koyun. Büyüme, bulanıklık gibi ya da bir kuyunun dibinde hücreleri bir depozito olarak görünür. </li><li> Büyümesini kontrol eden bu negatif, reincubate AST mikrotiter plate ise; pozitif büyüme göstermez, her ilacın ilk sıra ile ekrana dokunarak plaka okursanız. </li></ol></li></ol> Saflık plakaları okuyun. Kan agar plaka 48 saat sonra, herhangi bir büyüme göstermesi gerekir ve 7H10 saflık plakası, bir organizma türü konfluent büyüme olmalıdır. Kontamine olursa, AST mikrotiter testi saf kültür tekrarlanması gerekir. Aşağıdaki tabloyu kullanarak pozitif kontrol koloni sayıları hesaplayın: Colony Sayısı Anahtar <table border="1"><tbody><tr><td> # Koloniler "1 / 1" etiketli plaka sayılır </td><td> # Koloniler sayılır "1 / 50" etiketli plaka </td><td> İnokulum Koloni Sayısı (kob / ml) </td></tr><tr><td> &lt;50 </td><td> 0 </td><td> &lt;5 X 10 4 </td></tr><tr><td> 50-100 </td><td> 0-2 </td><td> 5 X 04-1 Ekim X 10 5 </td></tr><tr><td> &gt; 100 </td><td> ≤ 10 </td><td> 1 X 10 5 5 X 10 5 </td></tr><tr><td> &gt; 100 </td><td> &gt; 10 </td><td> &gt; 5 X 10 5 </td></tr></tbody></table> Mycobacterium tuberculo bazı suşları para-aminosalisilik asit ile sondaki olabilirsis. Bu pelet var tüm kuyu bakıyor ve bitiş noktası olarak bir sonraki seyreltme aynı boyutta pelet ilk iyi kullanarak yorumlanabilir. Direnç, bu ilaç ile nadirdir. <img src="/files/ftp_upload/3094/3094fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. MYCOTB plaka kullanarak Temsilcisi sonuçlanır. <table border="1"><tbody><tr><td> İlaç kısaltma </td><td> Ilaç </td><td> MIC μ / ml </td></tr><tr><td> Odasındaki </td><td> ofloksasin </td><td> 16 </td></tr><tr><td> MXF </td><td> moksifloksasin </td><td> 8 </td></tr><tr><td> RIF </td><td> rifampin </td><td> &gt; 16 </td></tr><tr><td> AMI </td><td> amikasin </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> STR </td><td> streptomisin </td><td> 16 </td></tr><tr><td> RFB </td><td> rifabutinin </td><td> 8 </td></tr><tr><td> PAS </td><td> p-aminosalisilik asit </td><td> ≤ 0.5 </td></tr><tr><td> ETH </td><td> etionamid </td><td> 5 </td></tr><tr><td> CYC </td><td> sikloserin </td><td> 4 </td></tr><tr><td> INH </td><td> izoniazid </td><td> 2 </td></tr><tr><td> KAN </td><td> kanamisin </td><td> 1,2 </td></tr><tr><td> EMB </td><td> etambutol </td><td> 4,0 </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Wengenack, N., Hall, L., Labombardi, V., Parrish, N. Evaluation of the New Sensititre (MYCOTB) MIC Plate for the Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) to First and Second Line Drugs. Presented at 50th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2010 Sept. 12, Boston, MA, , Abstract 2450 (2010).</li>
<li>HHS Publication No. (CDC) 21-112: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22U.S.+Department+of+Health+and+Human+Services+Centers+for+Disease+and+Preventions%22">U.S. Department of Health and Human Services Centers for Disease and Preventions</a>. , 5th Edition, National Institutes of Health. (2009).</li>
<li>Morcillo, N., Imperiale, B., Digiulio, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+MGIT+960+and+the+colorimetric-based+method+for+tuberculosis+drug+susceptibility+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Tuberc+Lung+Dis%22%5BJournal%5D)">Evaluation of MGIT 960 and the colorimetric-based method for tuberculosis drug susceptibility testing.</a> Int J Tuberc Lung Dis. 14, 1169-1175 (2010).</li>
<li>Bemer, P., Bodmer, T., Munzinger, J., Perrin, M., Vincent, V., Drugeon, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicenter+Evaluation+of+the+MB%2FBACT+System+for+Susceptibility+Testing+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multicenter Evaluation of the MB/BACT System for Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis.</a> J Clin Microbiol. 42, 1030-1034 (2004).</li>
<li>SENSITITRE MYCOTB Susceptibility Plate: For Mycobacterium Susceptibility Testing. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Product+Insert%22">Product Insert</a>. , TREK Diagnostic Systems. Cleveland, OH. (2010).</li>
<li>CLSI. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Susceptiblity+Testing+of+Mycobacteria%2C+Nocardia%2C+and+Other+Aerobic+Actinomycetes%3B+Approved+Standard.+Document+M24-A%22">Susceptiblity Testing of Mycobacteria, Nocardia, and Other Aerobic Actinomycetes; Approved Standard. Document M24-A</a>. , CLSI. Wayne, Pennsylvania. (2003).</li>
<li>Sullivan, N., Sotos, J., Anhalt, K., Allen, S. Preliminary results from a new TREK Sensititre Mycobacterium tuberculosis MIC plate (MYCOTB). C-151 presented at 110th American Society for Microbiology, Annual Meeting, San Diego, CA, , Abstract C-151 (2010).</li>
<li>VersaTREK MYCO SUSCEPTIBLITY KIT. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Product+insert%22">Product insert</a>. , TREK Diagnostic Systems. Cleveland, OH. 7115-7160 (2008).</li>
<li>Parrish, N. M., Carroll, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+the+Clinical+Mycobacteriology+Laboratory+in+the+Diagnosis+and+Management+of+Tuberculosis+in+Low+Prevalance+Settings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Role of the Clinical Mycobacteriology Laboratory in the Diagnosis and Management of Tuberculosis in Low Prevalance Settings.</a> J Clin Microbiol. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Kam, K. M., Sloutsky, A., Yip, C. W., Bulled, N., Zingol, M., Espinal, M., Kim, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+critical+concentrations+of+second-line+anti-tuberculosis+drugs+with+clinical+and+microbiological+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Tubercl+Lung+Dis%22%5BJournal%5D)">Determination of critical concentrations of second-line anti-tuberculosis drugs with clinical and microbiological relevance.</a> Int J Tubercl Lung Dis. 14, 282-288 (2010).</li>
<li>Woods, G. L., Warren, N. G., Inderlied, C. B. Susceptibility Test Methods: Mycobacteria, Nocardia, and Other Actinomycetes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWoods%2C+GL+%22Manual+of+Clinical+Microbiology%22">Manual of Clinical Microbiology</a>. Murray, P. R., Barron, E. J., Jorgensen, J. H., Landry, M. L., Pfaller, M. A. , 9th Ed, ASM Press. Washington DC. 1223-1247 (2007).</li>
<li>Bergmann, J. S., Woods, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+ESP+Culture+System+II+for+Testing+Susceptibilities+of+Mycobacterium+tuberculosis+Isolates+to+Four+Primary+Antituberculosis+Drugs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the ESP Culture System II for Testing Susceptibilities of Mycobacterium tuberculosis Isolates to Four Primary Antituberculosis Drugs.</a> J Clin Microbiol. 36, 2940-2943 (1998).</li>
</ol>

Bir AST mikrotiter plate pozitif büyüme kontrolleri bir örnek Şekil 1&#39;de gösterildiği ve uç nokta her ilaç için MIC (mcg / ml) daire. Laboratuvarımızda yapılan bir çalışmada AST mikrotiter plate yöntemi Mycobacterium tuberculosis duyarlılık testi için altın standart agar oranı yöntemi eşdeğer olduğunu belirtti. AST mikrotiter plate ve agar oranı yöntemi 14 ve 21 gün için son yorumu ile geleneksel agar oranı yöntemine göre sonuçların daha hızlı raporlama mikrotiter AST mikrotiter plate ile elde edildi, respectively.The AST mikrotiter plate ilk test avantajı vardır ikinci satırda aynı anda ilaçlara dirençli suşlar ile haddini gecikmeler önlemeye yardımcı olabilir. AST mikrotiter plate de APM daha kurmak ve okumak çok daha kolay ve Vizyonumuz gibi manuel ayna ve yarı otomatik bir sistem plakaları okumak için kullanılır. TB ilaç direnç testi için MIC değeri durumu, özellikle &quot;borderline&quot; duyarlılığı olanlar izolatları için, geleneksel kritik konsantrasyon değerine göre hekimlere değerli yeni bilgiler verebilir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> AST microtiter plakalar ve yapışkan mühür </td><td> TREK Diagnostics, Cleveland Ohio </td><td> MYCOTB </td></tr><tr><td> McFarland 0.5 standardına </td><td> TREK Diagnostics, Cleveland, Ohio </td><td> E1041 </td></tr><tr><td> Middlebrook 7H10 plakalar </td><td> Balıkçı </td><td></td></tr><tr><td> Kan Agar Tabaklar </td><td> Balıkçı </td><td></td></tr><tr><td> Steril mcL 1 döngüler </td><td> Balıkçı </td><td></td></tr><tr><td> Steril döngüler 10 mcL </td><td> Balıkçı </td><td></td></tr><tr><td> Sensititre Tuzlu-Tween cam boncuk broth </td><td> TREK Diagnostics, Cleveland, Ohio </td><td> 27143 </td></tr><tr><td> 7H9 OADC broth </td><td> TREK Diagnostics, Cleveland, Ohio </td><td> T3440 </td></tr><tr><td> Uzun pipetleyin İpuçları </td><td> Balıkçı </td><td></td></tr><tr><td> Steril Oluklar </td><td> TREK Diagnostics, Cleveland, Ohio </td><td></td></tr><tr><td> M. tuberculosis </td><td> ATCC </td><td> 27294 </td></tr><tr><td> Pipeters: 1000, 200, 20μL </td><td> Balıkçı </td><td></td></tr><tr><td> İpuçları 1000, 20, 20 mcL </td><td> Balıkçı </td><td></td></tr><tr><td> Çok Kanallı Pipetter </td><td> Balıkçı </td><td></td></tr><tr><td> İnkübatör% 5-10 CO 2 </td><td> Balıkçı </td><td></td></tr><tr><td> Plastik torbalar, küçük, CO 2 geçirgen </td><td> Poli Plastik, Delano, PA </td><td></td></tr><tr><td> TB dezenfektan (Böyle ProSpray C-60 gibi) </td><td> Certol, Uluslararası Ticaret City, CO </td><td> PSC60/32 </td></tr><tr><td> Ayna Kutusu Okuyucu </td><td> Balıkçı </td><td></td></tr></tbody></table>

microtiter plate format broth seyreltme birinci ve İkinci line İlaçları mycobacterium tuberculosis kompleksi antimikrobiyal duyarlılık testi

Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format

Antimikrobiyal direnç hızlı algılama dirençli Mycobacterium tuberculosis (MTB) artışı kontrol etmek için çaba önemlidir. MTB antimikrobiyal duyarlılık testleri (AST), geleneksel oran agar yöntemi veya macrobroth test / BACTEC (Becton Dickinson, Sparks, MD), VersaTREK (TREK Diagnostics, Cleveland, OH) veya BacT gibi bir araç tarafından yapılmıştır ALERT (bioMérieux, Hazelwood, MO). Agar oranı yöntemi olarak kabul ederken, AST &quot;altın&quot; standardı, yoğun emek ve uyuşturucu ücretsiz agar göre uyuşturucu içeren agar üzerinde koloni sayımı yaparak direnç hesaplama gerektirir. Uyuşturucu ücretsiz orta karşılaştırıldığında ilaç içeren orta ≥% 1 büyüme varsa, organizma o ilaca dirençli olarak kabul edilir. Macrobroth yöntemleri enstrümantasyon ve ilk satırı ilaçlar için test kırılma noktası (&quot;kritik&quot;) ilaç konsantrasyonları (izoniazid, etambutol, rifampin ve pirazinamid) gerektirir. Burada anlatılan yöntemi 96 mikrotiter plate formatında piyasada bulunan [MYCOTB (TREK Diagnostics)] ve amikasin (her ikisi de ilk (izoniazid, rifampin, etambutol) ve ikinci basamak ilaçlar da dahil olmak üzere, tüberküloz tedavisinde kullanılan 12 antimikrobiyaller artan konsantrasyonlarda içeren, sikloserin, etionamid, kanamisin, moksifloksasin, ofloksasin, para-aminosalisilik asit, rifabutin, ve streptomisin). Pirazinamid, ilk satırı ilaç, asidik test koşulları için ihtiyacı nedeniyle mikrotiter plate dahil değildir. Mikrotiter sistemin avantajları, hem de kurmak kolaylığı ve geleneksel agar oranı (21 gün) ile karşılaştırıldığında daha hızlı dönüş süresi (14 gün) içerir. Buna ek olarak, et suyu ya da katı besiyeri kullanılarak hazırlanan inokulum plaka kurmak olabilir. Mikrotiter plate formatı yeni ve MTB laboratuvar benzersiz güvenlik sorunları beri, bu protokol, güvenli bir şekilde kurulum nasıl anlatacağız bu yana, inkübasyon ve mikrotiter plate okuyun.

Mycobacterium tuberculosis Antimikrobiyal duyarlılık testi zor ama hasta bakımı için kritik. Bu mikrotiter plate formatı 12 antimikobakteriyel ilaçların test sunar ve uygun tedavi yardımcı olacak minimum inhibitör konsantrasyon (MİK) değerleri sağlar.

Microtiter Plate Format Broth Seyreltme Birinci ve İkinci Line İlaçları Mycobacterium tuberculosis kompleksi Antimikrobiyal Duyarlılık Testi

Antimikrobiyal direncin hızlı bir şekilde tespit edilmesi, dirençli Mycobacterium tuberculosis (Mtb) artışını kontrol altına alma çabalarında önem taşımaktadır. ...

Mycobacterium tuberculosis tedavisi için mevcut ilaç sayısı nispeten azdır, bu nedenle herhangi bir ilaca karşı gelişen direnç endişe vericidir. Bu video makalesi, M tuberculosis'in 12 farklı mikrobiyolojik ilaca karşı antibiyotik direncini aynı anda test etmeye yönelik bir prosedürü tanımlamaktadır. Dolayısıyla, M tuberculosis'in antimikrobiyal direncini hızla tespit edebilme yeteneği, dirençli suşların artışını kontrol altına alma çabalarında oldukça önemlidir; burada antibiyotik duyarlılığı test edilmektedir.M tuberculosis önce katı ortamda veya sıvı besiyerinde, bir bakteriyel süspansiyon şeklinde büyütülür. İnokülum hazırlanır ve inkübasyon sonrası, birinci basamak ve ikinci basamak ilaçlar da dahil olmak üzere 12 farklı ilacın farklı konsantrasyonlarını içeren bir mikrotitre plağına eklenir. Her kuyucuktaki büyüme miktarı, ya bir ayna kutusu kullanılarak manuel olarak ya da yarı otomatik bir plaka okuyucu kullanılarak belirlenir.Elde edilen veriler, test edilen her bir ilaç için minimum inhibitör konsantrasyonunu belirtir ve test edilen TB suşunun hangi antibiyotiklere dirençli olduğunu gösterir. Bu sonuçlar, tb tedavisi için uygun ilacın seçilmesine yardımcı olur. Merhaba, benim adım Nancy Ek; Minnesota, Rochester'daki Mayo Clinic Myco Bakteriyoloji Laboratuvarı'nın direktörüyüm.Bugün, mycobacterium tuberculosis için antibiyotik duyarlılık testi gerçekleştirme yöntemini açıklayacağız. Bu tekniğin, makro besiyeri dilüsyonu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, her ilaç için bir MIC değerinin belirlenmesi ve 12 antibiyotiğin eş zamanlı olarak test edilebilmesidir. Prosedür, laboratuvarımdaki kalite uzmanı Kurt Jude tarafından laboratuvar tezgahında gösterilecektir.Bir kanlı agar plak, üç Middlebrooks 7H10 plak, bir salin tween cam boncuklu tüp ve bir mikrotitrasyon plağını hastanın adı ve numune tanımlama numarasıyla etiketleyerek bu prosedür için hazırlık yapın. Ek olarak, kanlı agar ve 7H10 plaklarını "saflık" (purity) olarak etiketleyin. Bu 7H10 plaklarından birini "1'e 1 koloni sayımı", diğerini ise "1'e 50 koloni sayımı" olarak işaretleyin.Ardından tepsiyi geçiş bölmesine yerleştirin. Daha sonra; önü kapalı önlük, baş kılıfı, eldiven, galoş ve solunum cihazı giyerek seviye üç biyogüvenlik BSL üç tesisinde çalışmaya hazırlanın. Burada, bir PAPA solunum cihazı kullanılır.Ardından tepsiyi geçiş penceresinden geri alın. Sonra, BSL 3 tesisinde, biyogüvenlik kabininin yüzeyini dezenfekte edin. Daha sonra, havlu kağıdı dezenfektanla ıslatıp, hava tahliye paneline yaklaşık altı inç mesafede olacak şekilde kabinin içine yerleştirin.İnokülasyon öze döngüleri, pipetleyiciler ve uçlar, uygun bir atık imha kabı, bir nephi, TER ve bir vorteks yerleştirin. Davlumbaz hazırlandığında, organizmayı, McFarland 0.5 standardı, OADC içeren bir seven H nine besiyeri ve bir salin boncuk tüpü bulunan bir raf ile birlikte kağıt havlunun üzerine yerleştirin. Bu kurulum katı besiyerinden gerçekleştirilir.Bir hastadan alınan örnekten, katı besiyeri kültüründen inokülüm hazırlayın. Kolonileri kazımak için steril bir öze kullanın ve bunları salin tween cam boncuklu tüpe aktarın. Süspansiyonu 30 ila 60 saniye boyunca vorteksleyin.Numuneyi, McFarland standardı ile karşılaştırarak görsel olarak inceleyin. Aktarılan miktar, standartla eşit veya standarttan daha fazla olmalıdır. Eğer değilse, daha fazla bakteriyel numune ekleyin ve tekrar vorteksleyin.McFarland standardı ile eşleşme sağlandıktan sonra, bakterilerin daha büyük kümelerinin çökmesine izin vermek için inokülümü 15 dakika boyunca bekletin. Ardından, süspansiyon halindeki bakterilerin yoğunluğunu sıfırlamak için bir nephi meter kullanın. Nephi meter.Önce neprofometreye boş bir salin boncuklu tüp yerleştirin. Cihazı sıfırlamak için kalibre düğmesine basın, ardından McFarland 0.5 standardını neprofometreye yerleştirin ve kalibre düğmesine tekrar basın. Cihaz kalibre edildikten sonra McFarland standardını çıkarın ve inokülumu yerleştirin.İnokülüm okuması McFarland standart okumasına eşit olmalıdır. Okuma çok düşükse, tüpü çıkarın ve plakadan daha fazla bakteri aktarın. Ardından vorteksleyin ve örneği tekrar okuyun.Okuma değeri çok yüksekse, tüpe saline tween ekleyip vorteksleyin. Ardından örneği tekrar okuyun. Bakteri konsantrasyonu McFarland standardı ile eşleşene kadar inokülumu gerektiği gibi ayarlamaya devam edin.Ardından, tüpün üst üçte birlik kısmından 100 µL inokülumu almak için 200 µL'lik bir pipet ve uzun, aerosolle dirençli bir pipet ucu kullanın. Tabana çöken topaklanmaları önlemek için Middlebrook 7H9 besiyerini inoküle edin; inokülumu ekim plakasına aktarmadan önce inoküle edilmiş besiyerini 20 saniye boyunca yavaşça vorteksleyin. İlk olarak mikrotitre plağını üretici paketinden çıkarın. Eğer kurutucu mavi renkteyse veya folyo paket hasarlıysa, plağı kullanmayın.Plaka, her bir kuyucukta test edilecek, en etkili veya birinci basamak ilaçlar ile ikinci basamak ilaçlar da dahil olmak üzere 12 antimikrobiyal maddeyi halihazırda içermektedir. Aerosol oluşmamasına dikkat ederek, yedi H dokuz besiyeri inokülümünü dikkatli bir şekilde bir tüpe boşaltın. Ardından, mikro titrasyon plakasını burada gösterildiği gibi etiketi dışa bakacak şekilde yerleştirin ve her bir kuyucuğa 100 µL inokülüm eklemek için 12 kanallı bir pipet kullanın.Ardından, koloni sayımlarını gerçekleştirmek için plakları hazırlayın. İlk olarak, pozitif kontrol kuyucuğundan bir mikrolitre loop ile numune alıp bire bir etiketlenmiş seven H 10 plağına aktararak seyreltilmemiş bir plak hazırlayın. Daha sonra, plağı burada gösterildiği gibi ekim yapmak için loop'u kullanın.Ardından, 1/50'lik bir dilüsyon hazırlamak için, pozitif kontrol kuyucuğundan bir mikrolitre loop ile örnek alın ve 50 µL su içeren tüpün içine aktarıp karıştırın. Bu dilüsyondan 1 µL'yi 1/50 olarak etiketlenmiş plak üzerine ekin. BKT'den 50 µL inokülümü uygun şekilde etiketlenmiş kan agarı ve 7H10 plaklarına pipetleyerek ekim yapın ve izolasyon için çizgi ekimlemesini gerçekleştirin.Ardından, eklemeli trth'nin üzerine bir başka trth daha yerleştirin ve bunları nazikçe atık konteynerine koyun. Mikrotitrasyon plağının üzerine yapışkanlı bir sızdırmazlık bandı yerleştirin. Daha sonra, beyaz destekleyiciyi kullanarak, kırışıklık kalmadığından emin bir şekilde, yeterli sızdırmazlığı sağlamak için her bir kuyucuğa sıkıca bastırın.Mikrotitrasyon plağını, tüberkülozisid bir dezenfektanla ıslatılmış kâğıt havlu ile silerek dezenfekte edin. Ardından mikrotitrasyon plağını plastik bir torbaya yerleştirin ve ısı ile mühürleyerek kapatın. Son olarak, nephi, lter vortex, plaklar ve tüpler dahil tüm malzemeleri tüberkülozisid bir dezenfektanla silerek dezenfekte edin.Burada, dezenfeksiyonun sağlandığından emin olmak için yeterli süre geçtikten sonra pro spray kullanılır. Pro spray için 15 dakika beklenir. Plakalar scotch bantla bantlanıp plastik torbalara yerleştirilir ve mühürlenmiş malzemeler biyogüvenlik kabininden çıkarılarak geçiş kutusuna (pass through) yerleştirilir.Atık kırmızı torba bu noktada kapatılır ve bir bükme bağla mühürlenir; önlük, galoşlar ve eldivenler çıkarılır. Ön odaya geçilip eller yıkandıktan sonra respiratör çıkarılır, tekrar el yıkama işleminin ardından dezenfekte edilerek saklanır, yeni bir önlük giyilir ve BSL 3 süitinden çıkılır. Ardından, atık konteyneri otoklavlanır.Ardından, mikrotitre plakasını ve yedi adet H 10 ve kan auger plakalarını, BSL 2 laboratuvarındaki 35 ila 37 °C sıcaklıktaki ve %5 ila %10 CO2 içeren inkübatöre ağızları yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Plakanın sıkıca mühürlenmiş ve plastik bir torba içinde olması nedeniyle bu işlem uygundur. Mycobacterium tuberculosis nesil süresi yaklaşık 12 ila 24 saattir, bu nedenle kontrol kuyusunun dibinde bir hücre peletinin oluşumu şeklinde büyüme görülene kadar en az bir hafta geçeceği öngörülür. 10. günde, mühürlenmiş AST mikrotitre plakasını aynalı kutunun platformuna yerleştirerek manuel ayna okuması gerçekleştirin.Büyümeyi görselleştirmeye yardımcı olması için bir masa lambası kullanın ve en iyi kontrastı elde etmek için gerektiğinde ayarlama yapın. Aynaya bakarak, bu durumdaki büyüme kontrol kuyucuklarını, yani H 11 ve H 12'yi kontrol edin. Eğer büyüme varsa, kuyucuk burada gösterildiği gibi bulanık görünecek veya tortu varmış gibi görünecektir.Bu örnekte gösterildiği gibi büyüme yoksa, kuyu berrak görünecektir. Bu durumda, plakayı inkübatöre geri yerleştirin ve inkübasyona 21 güne kadar devam edin. Her bir koşul için büyümeyi kontrol grubuyla karşılaştırın.Ardından, her bir ilaç kaydı için, büyüme görülmeyen ilk dilüsyon belirlenir. Bu, ilaç için minimum inhibitör konsantrasyon veya MIC değeridir. Vision gibi otomatik bir plaka okuyucu kullanarak sonuçları incelemek için, önce Myco TB a ST plaka yazılımını açarak oturum açma işlemiyle başlayın; ardından mühürlü plakayı, barkodu dışarıya bakacak şekilde yerleştirin. Burada gösterildiği gibi, büyüme, bilgisayar ekranında bir kuyucuğun dibinde bulanıklık veya hücre çökelmesi şeklinde görülür.Öncelikle, büyüme kontrollerini inceleyin. Daha önce olduğu gibi. Eğer büyüme negatifse, plağı 21 güne kadar inkübatöre geri yerleştirin.Eğer sonuç pozitifse, her bir ilaç için ekranda büyüme göstermeyen ilk kuyucuğa dokunarak sonuçları kaydedin. Bazı durumlarda bakteriler, tortular veya ilaçlar kuyucuğun dibine çöker. "Trailing" (iz sürme) olarak bilinen bu fenomen, aynı boyutta pelet içeren birkaç kuyucuğun varlığı ile kendini belli eder ve aslında pozitif büyüme olarak değerlendirilmez.Ardından, bakteriyel konsantrasyonların belirlenmesi ve saflığın değerlendirilmesi amacıyla yedi H 10 ve kanlı agar plakları incelenir. Kanlı agar plağında 48 saat sonra üreme görülmemelidir. Kanlı agar plağındaki üreme, hızlı büyüyen bakterilerle kontaminasyon olduğunu gösterir.Eğer üreme varsa, mikrotitre testi tekrarlanmalıdır. Yedi H 10 saflık plağında tek bir organizmanın üremesi gerekir. Tip EM tuberculosis; bej renkli, kırışık ve pürüzlü görünmelidir. Kontaminasyon mevcutsa, Mikrotitre testinin saf bir kültürden tekrarlanması gerekir.Bakteriyel konsantrasyonu değerlendirmek için yedi H 10 plakasındaki kolonileri sayın. Ardından, beraberindeki yazılı belgede yer alan tabloyu kullanarak koloni sayılarını hesaplayın. Bir hasta örneğinden Mycobacterium tuberculosis üretilmiş ve antibiyotik direnci bu videoda açıklandığı şekilde değerlendirilmiştir; burada gösterilen plakada, en yüksek konsantrasyonlar üstte ve en düşük konsantrasyonlar altta olacak şekilde, artan konsantrasyonlarda 12 farklı ilaç bulunmaktadır.İlacın minimum inhibitör konsantrasyonu veya MIC'si, herhangi bir üreme göstermeyen en düşük ilaç konsantrasyonu ile belirlenmiş olup, Klinik ve Laboratuvar Standartları Enstitüsü tarafından belirlenen standart kırılma noktaları kullanılarak burada gösterilen görüntüde daire içine alınmıştır. Burada sunulan veriler, bu TB suşunun Isid ve Rifampin'e karşı dirençli olacağını göstermektedir. İn vitro ortamda, oin, moxifloxacin, streptomycin ve rifabutin dahil olmak üzere diğer birçok ilaçta görülen yüksek MIC değerleri, EM tüberküloz suşunun bu ajanlara karşı dirençli olduğunu göstermektedir.MIC sonuçları, tüberküloz tedavisi konusunda deneyimli bir enfeksiyon hastalıkları uzmanı tarafından kişiselleştirilmiş bir tedavi planı oluşturmak için kullanılmalıdır. Bu teknik uzmanlaşıldığında, tek bir izolatın kurulumu yaklaşık 40 dakika sürer. Bu prosedürü uygularken, bunun bir solunum yolu patojeni olduğunu ve aerosol oluşturma riskinin bulunduğunu unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, mikro broth dilüsyon yöntemi kullanılarak mycobacterium tuberculosis antimikrobiyal duyarlılık testinin nasıl kurulacağına dair iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Mycobacterium tuberculosis ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve gerektiğinde solunum koruması gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

antimicrobial-susceptibility-testing-mycobacterium-tuberculosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Mikroskopik gözlem ilaç duyarlılık (MODS) tayini, düşük maliyetli, yüksek performanslı bir algılama tüberküloz (TB) ve çoklu ilaca dirençli tüberküloz (MDRTB) düşük teknolojili bir araçtır. Bu video MODS sıvı medya kültürü yöntemi açıklanmıştır.

MODS tüberküloz tanısı için yöntem ve dirençli tüberküloz ilaca

Belli koşullarda kültüre zaman Mycobacterium tuberculosis ilaç hoşgörülü biyofilm oluşturmaktadır. Burada kültür M. yöntemleri tarif tuberculosis biyofilmler ve ilaç tolerans persisters sıklığını belirlenmesi. Bu protokoller M. ilaç hoşgörü mekanizmalarına daha sonraki çalışmalar için faydalı olacaktır tüberküloz.

Büyüme Mycobacterium tuberculosis Biyofilmler

Kaynak: Koeth, LM, et. al., Aerobik Olarak Büyüyen Bakterilerin Dalbavancin İn Vitro Duyarlılık Testi için Bir Referans Et Suyu Mikroseyreltme Yöntemi. J. Vis. Uzm. (2015).Bu video, Gram pozitif bakterilere karşı bir lipoglikopeptid antibiyotiğin minimum inhibitör konsantrasyonunu (MIC) belirlemek için et suyu mikroseyreltme yöntemini göstermektedir. Bakteri kolonisi izolasyonu, seyreltme, değişen antibiyotik konsantrasyonları ile mikroplaka kuyularının aşılanması ve kültür saflığının ve hücre...

Gram Pozitif Bakterilerin Antibiyotik Duyarlılık Testi İçin Bir Et Suyu Mikrodilüsyon Yöntemi

Bu video, ilaçların Mycobacterium tuberculosis (Mtb) enfeksiyonuna karşı etkinliğini değerlendirmek için bir testi göstermektedir. İn vivo enfeksiyonu taklit eden Mtb/makrofaj agregatları içeren bir in vitro enfeksiyon modeli oluşturulur. Uygun antibiyotikler eklendikten sonra, artan ilaç konsantrasyonları ile bakterilerin hayatta kalmasını izlemek için etkinlikleri resuzarin testi ile test edilir.

Mycobacterium tuberculosis Enfeksiyon Modeline Karşı İlaç Etkinliğini Değerlendirmek İçin Bir Test

Bu video, Mycobacterium tuberculosis'e karşı antibiyotik etkinliğini belirlemek için bir et suyu içi testi göstermektedir. Bakteri kültürü, farklı konsantrasyonlarda bir bakterisidal antibiyotik ile inkübe edilir. Bakterisidal etkinlik, bir resazurin testi kullanılarak canlı bakterilerin varlığının değerlendirilmesiyle ölçülür.

Bir Test Bileşiğinin Et Suyundaki Mikobakterilere Karşı Etkinliğinin Değerlendirilmesi

Charcoal agar r esazurin assay (CARA), test ajanlarının replike eden, replike olmayan veya her ikisi olan mikobakterilere karşı aktivitesini değerlendirmek için yarı kantitatif, orta verimli bir yöntemdir.  CARA, zamana ve konsantrasyona bağlı aktivitenin hızlı bir şekilde değerlendirilmesine izin verir ve koloni oluşturan birim (CFU) tahlilleri ile izlenecek parametreleri tanımlar.

Mikobakteriler Yarı kantitatif, Orta hacimli Sayımı İçin Kömür Agar Resazurin Testi görselleştirme

Bu hücre içi, Mycobacterium tuberculosis karşısında roman bileşiklerin bulunması hedefleme için ve in suyu memeli konakçı hücreye karşı bakteri hem de sitotoksisite büyüyen modüler yüksek verimli bir tarama sistemini geliştirdik.

Hücre içi Hedefleme İnhibitörleri Etkinliği ve Sitotoksisite Taraması için sistem<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Yeni nesil anti-tüberküloz ilaçlar için erken ilaç geliştirme sürecini iyileştirecek yeni modeller ve testler oldukça arzu edilmektedir. Burada, Mycobacterium tuberculosis'e karşı ilaç etkinliğini değerlendirmek için yüksek verimli tarama için kolayca uyarlanabilen hızlı, ucuz ve BSL-2 uyumlu bir testi açıklıyoruz.

Bir Yüksek verim Uyumlu Deneyi Makrofaj, pasajlamaya karşı ilaç etkinliğini değerlendirmektir<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Hücre içi M. tuberculosis büyümesinin hızlı ve etkili bir şekilde ölçülmesi, tüberküloza (TB) karşı gelişmiş tedavilerin sürdürülmesi için çok önemlidir. Bu protokol, aday konakçı tarafından yönlendirilen tedavilerle tedavi edilen makrofajlarda Mtb büyümesini ölçmek için otomatik bir sıvı kültür sistemi kullanan et suyu bazlı bir kolorimetrik tespit testini tanımlar.

Tüberküloz için Ev Sahibi Tarafından Yönlendirilen Tedavilerin Preklinik Testlerinde Kullanılmak Üzere Otomatik Bir Kültür Sistemi

Burada, fenotipik tarama yoluyla potansiyel anti-tüberküloz ilaç adaylarını belirlemek için bir protokol sunuyoruz; bu protokol 4-aminokinolin bileşiğinin kimyasal sentezini, Mycobacterium tuberculosis karşısında minimum inhibitör konsantrasyonunun belirlenmesini ve memeli hücre hatlarında sitotoksisitesinin değerlendirilmesini kapsıyor.

Potansiyel Anti-TB Adaylarının Tanımlanması: Memeli Hücrelerinde Sentez, MIC Belirleme ve Sitotoksisite Değerlendirmesi için Adım Adım Rehber

Öğrenin, Mycobacterium tuberculosis'un 12 farklı antimikobakteriyel ilaca karşı direncini mikrotiter plaka formatında eş zamanlı test etme yöntemini. Bu prosedür, minimum inhibitör konsantrasyon değerlerinin belirlenmesini sağlar.

Microtiter Plate Format Broth Seyreltme Birinci ve İkinci Line İlaçları Mycobacterium tuberculosis kompleksi Antimikrobiyal Duyarlılık Testi (Video) | JoVE Journal

Microtiter Plate Format Broth Seyreltme Birinci ve İkinci Line İlaçları Mycobacterium tuberculosis kompleksi Antimikrobiyal Duyarlılık Testi

Daha fazla video keşfet