Sıçan Beyin Dilimlerinde Sinaptik Olayların Optogenetik Stimülasyonu ve Elektrofizyolojik Kaydı

Farklı bir beyin bölgesinden ışığa duyarlı bir akson ile bağlantılı hedef nöron bölgesini içeren bir sıçan beyin dilimi ile başlayın.

Dilimi suya batırılmış kayıt odasına yerleştirin ve bir dilim ankrajı ile sabitleyin.

Mikroskop altında, istenen katmanı bulun ve hedef piramidal nöronu tanımlayın.

Dilim yüzeyi ile bir menisküs oluşturmak için mikroskop objektifini kaldırın.

Hücre içi kayıt solüsyonu ile doldurulmuş bir cam mikropipeti bu menisküsün içine indirin.

Zarda bir girinti oluşturmak için tanımlanan piramidal hücreye pipet ucuyla dokunun.

Bir conta oluşturmak için emme uygulayın.

Membran yırtılana kadar emmeyi artırın ve tam hücre konfigürasyonu oluşturun.

Monte edilmiş bir ışık kaynağı kullanarak dilime ışık darbeleri uygulayın.

Bu ışık darbeleri, ışığa duyarlı aksonda bir aksiyon potansiyelini tetikleyerek sinaptik yarıkta nörotransmiterleri serbest bırakır.

Sinaptik verimliliği analiz etmek için piramidal nöronun bu salınımlara verdiği tepkileri kaydedin.

Hedef hücre tanımlaması için, dilimi kayıt odasına yerleştirin ve bir dilim ankrajı kullanarak hareketsiz hale getirin. Düşük büyütme altında, kızılötesi aydınlatma kullanarak LEC katman 5'e gidin. Ardından, yüksek büyütmeli suya daldırma hedefine geçin ve piramidal nöronları tanımlayın.

Hücrenin monitördeki konumunu bantla işaretleyin. Daha sonra, tam hücreli bir yama kelepçesi oluşturmak için, bir borosilikat cam mikropipet üretin ve hücre içi kayıt çözeltisi ile doldurun. Doldurulmuş mikropipeti elektrot tutucusuna yerleştirin ve elektrot tutucu yan bağlantı noktasına bağlı bir ağızlığa sertçe üfleyerek pozitif basınç uygulayın.

Mikroskop objektifini bir menisküs oluşacak şekilde kaldırın ve elektrodu mikroskopta görülene kadar menisküsün içine yerleştirin. Sızdırmazlık testi penceresini açın ve pipet direncinin üç ila beş megaohm olup olmadığını belirleyin. Ardından, tanımlanan hücreye bir pipet ucuyla dokunarak hücre zarında bir girinti oluşmasına neden olur.

Ardından, ağızlıktan emerek negatif basınç uygulayın ve pipet direncini artırın. Hücre zarı yırtılana kadar kademeli olarak negatif basınç uygulamaya devam edin, bu da tüm hücre kapasitansı geçişlerine neden olur. Akım-kelepçe konfigürasyonuna girmek için, filtre küpleri ve uygun optiklerle mikroskop ışık yoluna yönlendirilmiş monte edilmiş bir LED kullanın ve 40x objektif aracılığıyla dilime ışık darbeleri uygulayın. Presinaptik salınım özelliklerini araştırmak için 5 Hertz, 10 Hertz ve 20 Hertz'de çoklu ışık darbeli trenler iletin.