Görüntüleme G-protein Coupled Reseptör (GPCR) aracılı Sinyal Olaylar Kontrolü Kemotaksis Diktiyostelyum diskodeyum

Bu prosedürün genel amacı, dictyostelium discoid dium hücrelerinde kemosensing sırasında sinyal olaylarının uzaysal-zamansal dinamiklerini izlemek için gelişmiş floresan konfokal mikroskopi uygulamaktır. İlk olarak, kemotaktik olarak yetkin dictyostelium discoid dium hücreleri hazırlanır. Ardından, kemoatraktan konsantrasyonu ile floresan yoğunluğu arasında doğrusal bir ilişki kurmak için kontrollü bir kemoatraktan gradyanı görüntülenir. Üçüncü adım, cyclic A MP gradyan algılamasında yer alan sinyal olaylarının görüntülenmesi için hareketsiz bir hücre sistemi elde etmektir.

Son adım, canlı hücrelerde iki G PCR R kontrollü sinyal iletim olayının; heterotrimerik G-proteini aktivasyonu ve PIP three üretiminin eş zamanlı olarak izlenmesidir. Nihayetinde, bir kemoatraktan ile stimüle edilen tek hücrelerdeki floresan yoğunluklarındaki spatiotemporal değişiklikler, gelişmiş konfokal mikroskopi ile canlı hücre görüntüleme aracılığıyla görselleştirilebilir. Cyclic A MP.

Bu tekniğin temel avantajı, canlı hücrelerdeki sinyal olaylarına ilişkin uzaysal-zamansal bilgileri elde etmemize olanak tanımasıdır. Bu canlı hücre ölçümleri, G-protein kenetli reseptör (GPCR) sinyal ağının bir kemoatraktan maddeyi nasıl tespit edebildiğinin ve uygun yanıtları nasıl oluşturabildiğinin daha iyi anlaşılmasını sağlar. Prosedürü, canlı hücre görüntüleme yöntemleri konusunda uzman olan Dr. Shu uygulamalı olarak gösterecektir. Kemotaktik siklik AMP kemoatraktanına yanıt veren Dictyostelium hücreleri üretmek için, 22 °C'deki çalkalamalı bir kültürden D3 trich media ortamında büyütülen hücreler toplanır.

Hücreleri, 400 Gs'de beş dakika boyunca santrifüj ederek besinsiz gelişimsel tamponu ile iki kez yıkayın. Oda sıcaklığında, hücreleri mL başına 2 × 10⁷ hücre yoğunluğunda DB tamponu içinde yeniden süspanse edin. 10 mL gelişimsel tampon içindeki 20 milyon hücreyi 250 mL'lik bir erlene aktarın ve ardından hücreleri 22 °C'de, 100 RPM'de bir saat boyunca çalkalayın.

Ardından, 75 nanomolar cyclic AMP final konsantrasyonuna ulaşmak için, sonraki altı saat boyunca her altı dakikada bir, 10 mililitre hücreye 100 mikrolitre 7.5 mikromolar cyclic AMP stok çözeltisi ekleyin. Şimdi, cyclic AMP kemoatraktan yetkin hücreleri bu kez 200 ×g'de santrifüjle toplayın ve ardından hücreleri 2.5 milimolar kafein içeren DB tamponu ile yeniden süspanse edin. Kemotaksis için hücreleri duyarlaştırmak amacıyla hücreleri 22 °C'de, bu kez 200 RPM'de 20 dakika boyunca tekrar çalkalayın.

Öncelikle bir mikropipeti, DB tamponu içerisinde hazırlanmış 1 µM cyclic AMP ve 0,1 µg/µL Alexa 594 içeren taze hazırlanmış 30 ml çözelti ile doldurun. Ardından bir Femto ucu mikropipet tutucuya takın ve boruları bir basınç besleme cihazına bağlayın. Kararlı bir gradyan oluşturmak için mikropipet düzeneğini motorlu bir mikromanipülatöre sabitleyin.

Tek kuyucuklu bir lab tech haznesini altı mililitre DB tamponu ile doldurun ve ardından hazneyi, Brightfield optikleri merkezinde, Femto uç görüş alanındayken konfokal mikroskoptaki 40 x yağ daldırma lensinin üzerine yerleştirin. Ardından, basınç kaynağını açın ve cyclic A MP Alexa 5 94 karışımının bir gradyanını oluşturmak için kompanzasyon basıncını 70 Hector Pascal olarak ayarlayın. 543 nanometrelik bir lazer hattı ile eksitasyon kullanarak, istenen konsantrasyondaki cyclic A MP ve Alexa 5 94 floresan karışımını izleyerek cyclic A MP gradyanını görselleştirin.

Son olarak, mikropipeti istenen konumlara yerleştirmek için mikro manipülatörün otomatik konumlandırma işlevini kullanın ve hücrelerin maruz kaldığı gradyanı manipüle etmek için birinci konumu, ikinci konumu ve üçüncü konumu ayarlayın. Kafein uygulamasının ardından, hücrelerden bir alikot alın ve hücreleri 500 Gs'de üç dakika boyunca çöktürün. Oda sıcaklığında, tamponu uzaklaştırın ve hücreleri mililitre başına 5 × 10⁵ hücre olacak şekilde seyreltin.

2.5 millimolar kafein içeren taze DB tamponu ile. Ardından, hücre süspansiyonunun bir mililitresini tek kuyucuklu bir hazneye uygulayın. Hücrelerin yapışması için 10 dakika bekledikten sonra, yapışmamış hücreleri uzaklaştırmak için tamponu dikkatlice pipetle çekin ve ardından görüntülemeyi başlatmak için aynı hacimde kafeinli taze DB tamponu ile değiştirerek mikroskop altında istenen hücreleri bulun.

Ardından, sabit bir gradyana maruz kalan hücrelerdeki sinyal bileşenlerinin dinamiklerini izleyin. Herhangi bir deneyden önce hücreleri 10 dakika boyunca beş mikromolar LA truculent B ile muamele edin. Bu şema, bu videodaki yönsel algılamanın kısa bir sinyal yolunu göstermektedir.

Siklik AMP gradyanının, PIP3 probunu eksprese eden D. discost hücrelerinde hızlı kemotaksiyi nasıl indüklediği görülebilmektedir. P-H-G-F-P yeşil renkte görünmektedir. Alexa 594 ile görselleştirilen gradyan ise burada kırmızı renkte görünmektedir.

Siklik AMP konsantrasyonu ile bir floresan boyanın yoğunluğu arasında doğrusal bir ilişki elde etmek için basit bir yöntem. 10 µg/mL Alexa 594 ile karıştırılmış 2 µM siklik AMP'den oluşan bir dilüsyon serisi gösterilmiştir.

Ardından, bir gradyanın siklik AMP konsantrasyonunun Alexa 594 yoğunluğu ile nicel ölçümünün nasıl belirleneceği grafiksel olarak gösterilmiştir. Bu şekil, hareketliliği bir aktin polimerizasyon inhibitörü olan latrunkulin B ile baskılanmış hücrelerin, yönsel algılama yeteneklerini nasıl koruduklarını göstermektedir. Hücreler, PIP3 probu olan PH-GFP eksprese ederek yeşil görünürken, kırmızı renkteki gradyan Alexa 594 ile görselleştirilmiştir.

Bu videoda, polarize olmamış basitleştirilmiş bir hücre sisteminin ve manipüle edilebilir cyclic AMP stimülasyonunun kullanımının, yönsel algılama ile ilgili temel soruları nasıl yanıtlayabileceği görülebilir. Yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlüğe sahip canlı hücre görüntülemesinin uygulamasını göstermek için burada, kırmızı ile belirtilen sabit bir cyclic AMP gradyanına maruz kalmaya yanıt olarak PIP3'ün bifazik ekspresyonunu sergileyen yeşil renkli bir hücre gösterilmektedir.

Bu görüntü, PIP three üretim kinetiğinin ölçümü için ilgi bölgelerini göstermektedir. Sabit bir gradyana maruz kaldığında hücrelerin ön ve arka kısımlarındaki PIP three üretim kinetiği burada sunulmuştur; ön ve arka kısımlardaki PIP three üretimi sırasıyla siyah ve gri ile temsil edilmiştir. Canlı hücre görüntüleme yöntemini uygulayarak, siklik A MP stimülasyonundan PIP three üretimine kadar yönsel algılamaya özgü bir sinyal iletim ağının dinamiklerini sistematik olarak ölçtük.

Bu şema, siklik AMP stimülasyonundan PIP3 üretimine kadar olan yönsel algılama sinyal ağını göstermektedir. Her bir bileşenin kinetiği aynı renkteki bir çizgi ile sunulmuştur. Bu ilk figürde, tekdüze olarak uygulanan bir siklik AMP stimülasyonunun, geçici bir PIP3 üretimini tetikleyen kalıcı bir G proteini aktivasyonunu nasıl başlattığı bu videoda temsil edilmektedir.

G ve pH hücrelerinin gökkuşağı renkli görüntüleri, tekdüze uygulanan bir cAMP stimülasyonunun hücre çevresinde kalıcı bir G-proteini aktivasyonunu tetiklediğini ve bunun aynı zamanda geçici bir PIP3 üretimini başlattığını göstermektedir. Burada, tekdüze uygulanan bir cAMP stimülasyonu sonrası G proteini aktivasyonu ve PIP3 üretiminin kinetiği gösterilmiştir. Bu deneyler yapılırken, temel noktanın reaktif hücreler elde etmek olduğu, hücrelerin farklı genetik arka planlarının ve çevresel koşulların önemli olduğu unutulmamalıdır.

Görüntüleme edinme koşullarının tamamı hücre fizyolojisini değiştirir ve hücreyi daha az duyarlı hale getirebilir. Bu prosedürün ardından, bir sinyal ağındaki dinamik etkileşimlerin nasıl bir hücre davranışına yol açtığı gibi ek soruları yanıtlamak için hesaplamalı modelleme uygulanabilir. Bu yöntemler, ökaryotik kemotaksi alanındaki araştırmacıların önünü açmaktadır.

Kemotaktik çekici algılamanın hesaplamalı bir modelini geliştirebiliriz. Bu model, bir sinyalizasyon olayının dinamiklerini simüle etmek için kullanılabilir. Modelin iyileştirilmesi ile yaşam tarzı ölçümleri arasındaki etkileşim, kemotaksis konusunda daha derin bir anlayış sağlayabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, canlı hücrelerdeki sinyalizasyon olaylarını izlemek için gelişmiş floresan konfokal mikroskopinin nasıl uygulanacağı konusunda daha iyi bir anlayış kazandığınızı umuyoruz. Bu yöntemi kendi çalışmalarınıza uygulayabilmenizi dileriz.