Name: Erken Civciv Embriyo morfogenetik Doku deformasyonlar Takibi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Öğrenin, erken civciv embriyolarında morfogenetik doku deformasyonlarını yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile izleme yöntemlerini. Floresan boyalar ve polistiren mikroküreler kullanılarak doku dinamikleri gerçek zamanlı analiz edilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH hibe, R01 GM075200 ve R01 HL083393 (LAT) tarafından desteklenmiştir. Biz BAF için burs desteği kabul NIH T90 DA022871 ve Mallinckrodt Radyoloji Enstitüsü ve Amerikan Kalp Birliği hibe 09PRE2060795 VDV için.

1. Genel Deneysel Hazırlık <ol><li> Laminer akış kaputu doku kültür ortamı hazırlayın. <ol><li> Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta (DMEM) (1 4.5g / L glikoz ile L şişe, sodyum bikarbonat ve L-glutamin) seyreltilir. 10 ml penisilin / streptomisin / neomisin antibiyotik ekleyin. </li><li> DMEM, 100 ml, steril bir transfer pipet yardımıyla çıkarın ve civciv serum 100 ml ile değiştirin. </li><li> Kısım steril 15 ml konik şişeleri ve donma içine DMEM/10% civciv serum /% 1 antibiyotikler. </li></ol></li><li> Fosfat hazırlayın tamponlu salin (PBS), kalsiyum ve magnezyum ile takviye. 100 ml 10X PBS, 900 mL deiyonize su ve konsantre bir kalsiyum ve magnezyum çözüm (100 mg / ml CaCl 2 • 2H 2 O, 100mg/mL MgCl 2 • 6H 2 O), 1 ml karıştırın . </li><li> Hamburger ve Hamilton 1 (yani 23-25 ​​HH aşamada 5 saat veya 42 tarafından tanımlandığı şekliyle istenilen aşamaya uzunlamasına yönde yumurta inkübeHH aşamaları 11-12) -48 saat. </li><li> Filtre kağıdı taşıyıcı yöntemi kullanarak yumurta embriyolar çıkarın. <ol><li> Çatlak yumurta alt tarafta A150 mm petri. Alttan kabuk ayrı çekin ve yemeğin içine yumurta içeriğini boşaltmak. </li><li> Künt forseps kullanarak yumurta kalın, viskoz akı çıkarın. </li><li> Whatman # 2 filtre kağıdı 2-3 cm daireler kesin. çapındadır. Filtre kağıdı ortasında tek bir delikli zımba, zımba delikleri kullanma. Halka merkezi deliğinden embriyo görünür tutar bir şekilde sarısı filtre kağıdı halkalardan birini yerleştirin. </li><li> Microscissors ile filtre kağıdı dış çapı yaklaşık kesin. Ince forseps ile yumurta sarısı, kağıt çıkarın. </li><li> PBS içinde embriyo yapışık sarısı parçacıkları çıkarmak için hafifçe yıkayın. (HH5 embriyolar kalan yumurta sarısı kaldırmak için 15-20 dakika gibi uzun emmek için gerekebilir). Banyosundan filtre kağıdı aksamını çıkarın ve bir ventral tarafta yere kadar35 mm kültürü çanak. Halkalar arasında embriyo sandviç ilk tepesinde ikinci bir filtre kağıdı yüzük, yerleştirin. Embriyo güvenliğini sağlamak için filtre kağıdı sandviç (2 cm çapında ≈ 1.5) dışında etrafında bir metal halka koyun. </li><li> Batmak kültür ortamında embriyo. Uygun morfolojisi ve parlak bir alan mikroskobu ile embriyonik aşamada olun. </li></ol></li><li> Sonraki doku diseksiyonu ve etiketlenmesi için, ince uçlu cam iğneler (1.5 mm iç çapı) (Dünya Hassas Aletler, Sarasota FL) hazırlamak için bir pipet çektirmesi kullanın. </li></ol> 2. Manyetik Demir Parçacıklar kullanarak HH Sahne DII Etiketleme 5 Embriyolar <ol><li> Demir tozu oda sıcaklığında küçük bir miktar (demir azalmış, Mallinckrodt Baker, Inc Phillipsburg, NJ) doymuş DII birkaç damla alkol ekleyin ve kurumaya bırakın. (Bu genellikle alkol buharlaştı sonra birlikte pasta parçacıkların neden olur.) Kümesinin demir parçacıkları break up çekti mikropipet ucu kullanınbir mikrosantrifüj tüpe aktarmak ve onları birkaç kez yıkayın ve deiyonize su ile kaplayın. </li><li> HH evre 5 embriyo ektodermal hücreler etiketlemek için, kültür ortamı cömert bir tabaka ile kaplı 35 mm kültür kaplarına (yani, tüm filtre kağıdı montaj) dorsal tarafına hasat edilen embriyo yeri ve diseksiyon mikroskop altında çanak koymak. Vitellin membran kaldırmak ve ektodermal hücreler ortaya çıkarmak için cam bir iğne kullanın. (Delmeyin embriyo dikkat edin.) </li><li> Pasteur pipeti içine etiketli demir partikülleri (deiyonize su) bir sütun çizin. Diseksiyon mikroskobu, batığın embriyo üzerinde sadece sıvı yüzey ve pozisyon altında pipet kullanılması. Yavaş yavaş parmaklarınızın arasında ileri ve geri pipet Rolling pipiette parçacıkların dışarı çekmeye çabalamaktadır ve embriyo üzerinden serpin. </li><li> Embriyo kez dikkatli bir şekilde yaklaşık 10 dakika boyunca 37 ° C inkübatör, parçacıklar ile kaplıdır. Bir kuluçka embriyo alınd parçacıklar kaldırmak için güçlü bir mıknatıs kullanın. </li><li> Şekil 2A, B. gösterildiği gibi, parlak alan ve embriyo floresan görüntüler elde etmek için ekli video kamera ve uygun filtre ayarları ile floresan mikroskop kullanın </li><li> Etiket yoğunluğu dikkat edin. Yoğun dağılımı isteniyorsa, yine embriyo etiket ve buna göre kuluçka süresini uzatmak için (yukarıda açıklandığı gibi) ek parçacıkları kullanabilirsiniz. Etiketleri çok yoğun iseniz, zaten etiketli parçacıkları ile dolu mikrosantrifüj tüp etiketsiz demir parçacıkları küçük bir miktar ekleyin ve tüp içeriği karıştırın. Yeni bir embriyo ile etiketleme işlemi tekrarlayın ve etiket yoğunluğu tekrar not edin. </li></ol> 3. HH11-12 embriyoların Optik Koherens Tomografi (OCT) Görüntüleme Polistiren Microsphere Etiketleme <ol><li> 35 mm petri PBS içinde siyah 10 mm çap mikroküreler (Polysciences A.Ş., Warrington, PA) bir çözüm hazırlayın. (Boncuk Ekim kontrast üretmek için yeterince büyük olmalıdırgörüntüleme, ama yeterli boncuk boyutu, tek tek hücrelerin sipariş üzerine olduğu gibi küçük. Belirli değerler) OCT sistemi çözünürlüğe bağlı olarak değişir ve dokuların çalışılmaktadır. PBS ml başına stok solüsyonu Bir damla (2.6% katıların-lateks) genellikle yeterlidir. Bu çözüm 22 iğne kullanarak 10cc bir şırıngaya çekin. Vorteksleyin düzgün bir boncuk dağılımını sağlamak için 30 saniye için bir çözüm. </li><li> Konik bir bilgisayarın sabit sürücü 2 kullanılarak çekilmiş cam iğne uçları. İpucu çapı boncuk delikten sığabilecek kadar büyük olmalıdır, ama aynı zamanda, mümkün olduğu kadar küçük enjeksiyon sırasında doku yaralama en aza indirmek için. </li><li> Şırınga kullanarak boncuk çözüm eğimli cam iğne ile doldurun. Çözüm ucu ulaştığını sağlamak için hafifçe mikropipet fiske. </li><li> Bir mikromanipülatör kullanarak, aynı alan içinde embriyo olarak görmek cam iğne yerleştirin. Boncuk pipet ucu dışarı akan olmalıdır. <ol><li> Eğer hiçbir beads mikropipet çıkmak, bir yapışmasına neden olabilir. Bu durumda, yeni bir cam iğne ile 3.2-3.4 adımları tekrarlayın. </li><li> Çok sayıda boncuk görüş alanında bulutu, pipet ucu çok geniş olabilir. Yeni bir pipet ve yeni bir embriyo ile 3.2-3.4 adımları tekrarlayın. </li></ol></li><li> Beyin tüp lümenine pipet ucu takın. Doku ventral katında delmek için emin olun. Boncuklar ve sıvı lümen girerken dokusunun geçici bir şişlik göreceksiniz. Bu başarılı bir entübasyon gösterir; şimdi, hızlı cam iğneyi çıkarın. </li><li> Parlak bir alan mikroskobu kullanarak beyin tüpün iç lümen yeterli bir boncuk yoğunluğu olun. Tarikatı için geçmeden önce 30 dakika - 20 boncuk razı olsun. 4. </li></ol> 4. Veri Toplama * Aşağıdaki yöntemlerden de yukarıda açıklanan floresan etiketleme tekniği için uygundur. Ancak, örnekleri aktarırken Microsphere etiketleme tekniği ile, boncuk bağdakiinkübatör ve görüntüleme sistemleri arasında. Bu durumda (hareket / ajitasyon tamamen örnek önler) 4.2 adıma geçmek için en iyisidir. Her iki yöntemde de, sıvı kültür ortamında batık ise embriyoların kültürü vardır. Embriyo tamamen sular altında (bazı geleneksel doku kültürü teknikleri ile olduğu gibi) değilse, doku geometri, büyük ölçüde anormal derecede yüksek yüzey gerilimi yükleri ve gerilme dağılımları değişmiş doğru normal 3-D morfolojilerinden 3, 4 yakalamak için başarısız olacaktır . Ayrıca, doku daldırarak embriyonik morfolojisi ve işaretleyici koordinatları obscuring OCT görüntüleme sırasında sıvı-gaz ​​arayüzünde görülen parlak kontrast önler. <ol><li> Embriyo Kültürü (genel) <ol><li> Yedi 35 mm kültür kaplarına (embriyolar) ilk görüntüler (parlak alan, floresan, ya da Ekim) aldıktan sonra, 150 mm Petri kabında koymak ve küçük bir plastik torba içinde tüm montaj yerleştirin. Nemlendirme için çanta deiyonize su damlaları bir çift ekleçanta ve% 95 O 2 /% 5 CO 2 karışımı ile doldurun. Embriyoların 37 kuvöz içine yerleştirin ° C (Kuyruk sonraki görüntüleme timepoint kadar istenilen zaman Stabiletherm, Asheville, NC). Bu yöntemi kullanarak, deneyler aynı gün içinde birden fazla embriyolar üzerinde olabilir. </li></ol></li><li> Time-lapse kültür (otomatik) <ol><li> 1.2 ml kültür ortamı içeren bir delta T Bulaşık Bioptechs Butler, PA 35 mm dış çapı, konik yan duvar 23 mm merkezi diyafram, 0.17mm kalınlığında cam içine etiketli embriyolar yerleştirin. </li><li> 37 tutulur bir cam kapak ile çanak Kapak ° C Bioptechs Delta T4 Kültür Bulaşık Controller (yoğunlaşma önlemek için). % 95 O 2 / Mini-Pompa Akış cihazı (Fisher Scientific) verilen% 5 CO 2 gaz karışımı embriyo Superfuse. Önce ulaşan embriyo, ısı ve sıcak bir (&lt;100 ° C) sıcak levha deiyonize su ile köpüren bir gaz nemlendirme. Bu deneysel s şematiket-up Şekil 1'de gösterilmiştir. </li><li> Yazılım, kullanıcı tarafından belirlenen zaman aralıklarında otomatik olarak görüntüler elde etmek için ayarlayın. , Bizim floresan mikroskop için, biz openlabın yazılımı (Perkin Elmer, Waltham, MA) kullanın ve bizim OCT sistemi için, biz süpürüldü kaynak Thorlabs yazılımı (Newton, NJ) kullanın. Bu yöntem şu anda sadece bir time-lapse deneyi taşıma kapasitesine sahip olduğundan bir süre, bu tür kültürlerin bir gecede çalışmasına izin vermek için genellikle en iyisidir. Bir görüntüleme sistemi 5 hem de donanım ve yazılım ile uyumlu bir otomatik çevrilebilir sahne yükleyerek bu sınırlama aşmak. </li></ol></li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Etiketler her bir deney için otomatik olarak izlenir (Volocity kullanarak, Perkin Elmer) veya manuel (ImageJ Manuel İzleme eklentisi kullanarak, NIH). Floresan etiketleme tekniği, biz sağlayan marker koordinatları ile 2 boyutlu yüzeyler sığdırmak için Matlab rutin gridfit morfogenetik yüzey suşları 6, 7 hesaplanacaktır. Standart denklemler embriyonik ilgili bir koordinat sistemi içine bu değerleri dönüştürmek için kullanılır. Alternatif olarak, OCT tekniği, yüzeyler, bölümlenmiş görüntü birimleri (Matlab veya Caret 8 standart yazılımı ile elde edilen) ve suşları oluşturulur örnek 9 maksimum veya minimum eğrilik yönde hesaplanabilir. Biz erken civciv embriyo baş kat oluşumu sırasında ektodermal hücrelerin hareket etiket ve takip etmek için demir partikül tekniği kullanılmıştır. Şekil 2A tasvir gibi, floresan ile işaretlenmiş hücreler tüm embriyo genelinde dağıtıldı. Ex ovo kültürü boyunca farklı aralıklarla Parlak alan ve embriyo floresan görüntüler ele geçirildi. Daha sonra paletli etiketler (Şekil 2B, C) hareketleri baş kat oluşumu sırasında gelişen morfogenetik gerilme dağılımları (Şekil 2D-F) hesaplamak için kullanılır. t "&gt; Benzer şekilde, bizim polistiren Microsphere tekniği erken civciv beynin orta Beyin sınır doku hareketlerini takip etmek için kullanılmıştır. Şekil 3 BD gösterildiği gibi, 6 saat ve suşları için uzunlamasına ve doku deformasyonu karakterize boncuk hareketleri takip edilmiştir dairesel yönde işaretleyici koordinatları hesaplanmıştır. Not boncuk beynin iç lümen (Şekil 3A) tüm tarafların yapışma eğilimi olarak bu yöntem belirgin bir 3-D deformasyonlar taşıma kapasitesine sahip olduğunu. <img src="/files/ftp_upload/3129/3129fig1.jpg" alt="Şekil 1"> Şekil 1 set-up time-lapse doku kültürü için şematik. <img src="/files/ftp_upload/3129/3129fig2.jpg" alt="Şekil 2"> Şekil 2. 2-B doku deformasyonları miktarının takip floresan etiketleri kullanarak erken civciv embriyo. HH evre 5 embriyo demir parçacıkları çıkarılmasından sonra (A) Birleştirilmiş alanında parlak / fluoresan görüntü. DII-etiketed ektodermal hücreler (kırmızı) tüm embriyo dağılmış. (B, C) etiketli hücreleri hareket ImageJ kullanılarak takip edildi. Etiket değiştirmeler embriyo koordinatları (X, Y) hesaplandı. A ve B aynı görüntü olduğunu unutmayın. (DF) boyuna gerilme dağılımları baş kat oluşumu sırasında gelişen Kontur araziler. Boyuna Lagrange suşları, (D) 75 dk sonra (örneğin, A ve B), (E) 120 dakika ve inkübasyon (F) 165 dk 5. aşamada HH göreceli hesaplanan edildi. Bu suşlar, Y-ekseni boyunca başlangıçta odaklı bir çizgi elemanları uzunluğu değişiklikler (evre 5 embriyo) karakterize eder. Filas ve arkadaşları (2007) 6 ve Varner ve ark (2010) 7 morfogenetik suşlar takip etiketi kullanarak hesaplamak için koordinatları hakkında daha fazla bilgi bulunabilir. C ve F aynı görüntü olduğunu unutmayın. Ölçek çubuğu = 500 mm. <img src="/files/ftp_upload/3129/3129fig3.jpg" alt="Şekil 3"> Şekil 3. 3-D doku miktarının derken civciv beyin eformations. (A) Polistiren dorsal (siyah ok) uymak mikroküreler ve ventral (beyaz ok) beyin tüp taraf OCT rekonstrüksiyonlar enine section.Ventral kez dokuları çevreleyen kolayca ayırt orta Beyin sınır yakınındaki Microsphere yerlerde (C), (B) HH12 ve daha sonra 6 saat inkübasyon (M: orta beyin, H: Beyin). Boncuk doku genel deformasyon vurgulamak için çeşitli gruplar özetlenmiştir. (D) Boyuna (D zz) ve çevresel (E θθ) Lagrange suşları bu deformasyonlar hesaplandı. Pozitif orta Beyin sınır boyuna ve olumsuz çevresel suşları kültür sırasında bu bölgede bir uzatma eksenel ve çevresel kısalma yansıtmaktadır. Filas ve ark (2008) 9 morfolojilerinden sırasında karmaşık yüzeyler için morfogenetik suşları hesaplarken hakkında daha fazla bilgi bulunabilir. Ölçek çubuğu = 200 mm.

<ol><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).</li>
<li>Canfield, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dry+beveling+micropipettes+using+a+computer+hard+drive%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Dry beveling micropipettes using a computer hard drive.</a> J. Neurosci. Methods. 158, 19-21 (2006).</li>
<li>Voronov, D. A., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+looping+in+experimental+conditions%3A+the+effects+of+extraembryonic+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Cardiac looping in experimental conditions: the effects of extraembryonic forces.</a> Developmental Dynamics. 224, 413-421 (2002).</li>
<li>Filas, B. A., Bayly, P. V., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress+as+a+regulator+of+cytoskeletal+contractility+and+nuclear+shape+in+embryonic+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress as a regulator of cytoskeletal contractility and nuclear shape in embryonic epithelia.</a> Ann. Biomed. Eng. 39, 443-454 (2011).</li>
<li>Kozel, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+fiber+formation%3A+a+dynamic+view+of+extracellular+matrix+assembly+using+timer+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Elastic fiber formation: a dynamic view of extracellular matrix assembly using timer reporters.</a> J. Cell. Physiol. 207, 87-96 (2006).</li>
<li>Filas, B. A., Efimov, I. R., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography+as+a+tool+for+measuring+morphogenetic+deformation+of+the+looping+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography as a tool for measuring morphogenetic deformation of the looping heart.</a> Anat. Rec. 290, 1057-1068 (2007).</li>
<li>Varner, V. D., Voronov, D. A., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+head+fold+formation%3A+investigating+tissue-level+forces+during+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mechanics of head fold formation: investigating tissue-level forces during early development.</a> Development. 137, 3801-3811 (2010).</li>
<li>Van Essen, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+software+suite+for+surface-based+analyses+of+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Med.+Inform.+Assoc%22%5BJournal%5D)">An integrated software suite for surface-based analyses of cerebral cortex.</a> J. Am. Med. Inform. Assoc. 8, 443-459 (2001).</li>
<li>Filas, B. A., Knutsen, A. K., Bayly, P. V., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+measuring+deformation+of+folding+surfaces+during+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech.+Eng%22%5BJournal%5D)">A new method for measuring deformation of folding surfaces during morphogenesis.</a> J. Biomech. Eng. 130, 061010-061010 (2008).</li>
<li>Yuan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-registered+optical+coherence+tomography+and+fluorescence+molecular+imaging+for+simultaneous+morphological+and+molecular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Co-registered optical coherence tomography and fluorescence molecular imaging for simultaneous morphological and molecular imaging.</a> Phys. Med. Biol. 55, 191-206 (2010).</li>
<li>Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+digital+image-based+method+for+computational+tissue+fate+mapping+during+early+avian+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis.</a> Ann. Biomed. Eng. 33, 854-865 (2005).</li>
<li>Blanchard, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+tectonics%3A+morphogenetic+strain+rates%2C+cell+shape+change+and+intercalation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Tissue tectonics: morphogenetic strain rates, cell shape change and intercalation.</a> Nat. Methods. 6, 458-464 (2009).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

İki doku etiketleme teknikleri, erken civciv embriyo ex ovo kültürü için sunulmuştur . Ilk hücre aynı anda yüzlerce etiket, manyetik demir parçacıkları ile teslim floresan lipofilik boyalar kullanır. Ancak, bu yöntem, floresan boyalar genellikle 10 Eki kullanarak çevre dokulara çok az kontrast gösterdiği gibi, şu anda optik koherens tomografi ile uyumlu değildir . Bu nedenle, biz time-lapse OCT analizi için doku etiket polystyrene küreler kullanarak alternatif bir yöntemdir. Bu teknik, 3-boyutlu veri...

<table border="1"><table border="1"><tbody><tr><td> Malzeme / reaktif </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> DMEM - yüksek glukoz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin / Neomisin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4083 </td><td></td></tr><tr><td> Tavuk Serum </td><td> Invitrogen </td><td> 16110-082 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;nun Fosfat Tamponlu Salin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D1408 </td><td> 10X </td></tr><tr><td> Whatman # 2 Filtre Kağıdı </td><td> Whatman </td><td> 1002 090 </td><td> 90mm çap </td></tr><tr><td> Cam mikropipetler </td><td> Dünya HassasInstruments (TEFE) </td><td> TW150-6 </td><td> 1.5mm iç çapı </td></tr><tr><td> DII </td><td> Invitrogen </td><td> D-282 </td><td></td></tr><tr><td> Demir İndirimli </td><td> Mallinckrodt Baker Inc. </td><td> 5320 </td><td></td></tr><tr><td> 10 mikron Çap Mikroküreler (siyah) </td><td> Polysciences Inc. </td><td> 24294 </td><td></td></tr><tr><td> Delta T Dish (time lapse kültür) </td><td> Bioptechs </td><td> 04200415B </td><td> Kalın, siyah 0.17mm </td></tr><tr><td> Delta T4 Kültür Bulaşık Kontrolörü </td><td> Bioptechs </td><td> 0420-4-03 </td><td></td></tr><tr><td> Mini-Pompa Değişken Akışlı Aygıt </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

erken civciv embriyo morfogenetik doku deformasyonlar takibi

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo 

Embriyonik epitel erken embriyo ilkel organları oluşturmak için karmaşık deformasyonlar (örneğin, bükme, kıvırma, katlama, ve germe) tabi tutulurlar. Bu hücresel yaprak yüzeylerde fiducial belirteçleri Takip büyüme, daralma ve kayma gibi morfogenetik miktarlarda tahmin etmek için köklü bir yöntemdir. Ancak, tüm yüzey etiketleme teknikleri, geleneksel görüntüleme yöntemleri kolayca adapte ve farklı avantajları ve sınırlamaları sahip. Burada, iki etiketleme yöntemleri anlatılmakta ve her iki tekniğin yararını göstermektedir. İlk yöntem, yüzlerce floresan etiket, manyetik demir parçacıkları kullanarak embriyonun aynı anda uygulanır. Bu etiketler, daha sonra 2-B doku deformasyonları miktarına morfolojilerinden sırasında kullanılır. İkinci yöntem, polistiren mikroküreler 3-D doku deformasyonları izlemek için non-invaziv optik koherens tomografi (OCT) görüntüleme kontrast ajanlar olarak kullanılmaktadır. Bu teknikler başarılı olmuşturly erken baş kat, kalp ve beyin gelişimi fiziksel mekanizmalar studythe bizim laboratuvarda uygulanan ve geniş bir yelpazede morfogenetik süreçlerine uyarlanabilir olmalıdır.

Bu makale, yüzey etiketleme ve tanımlar<em&gt; Ex ovo</em&gt; Erken civciv embriyo doku kültürü. Time-lapse parlak alan, floresan, ve optik koherens tomografi görüntüleme için uygun teknikler sunulmaktadır. Yüksek uzaysal çözünürlüğü ile Takip yüzey etiketler, iki ve üç boyutlu hem de hesaplanabilir morfogenetik suşlar (deformasyonlar) gibi kinematik miktarlarda sağlar.

Erken Civciv Embriyo morfogenetik Doku deformasyonlar Takibi

Embriyonik epitelyumlar, erken embriyonun ilkel organlarını oluşturmak için karmaşık deformasyonlara (örneğin bükülme, burulma, katlanma ve gerilme) uğrarlar. ...

Burada sunulan tekniklerin genel amacı, erken gelişim sırasındaki morfogenetik deformasyonu ölçmek için embriyonik dokuları işaretlemek ve kültüre etmektir; erken evre tavuk embriyosu kültürü için, önce filtre kağıdı taşıyıcı yöntemi kullanılarak embriyoyu yumurtadan çıkarın. Deneysel uygulamaya bağlı olarak, çıkarılan embriyoyu manyetik demir partikülleri aracılığıyla iletilen floresan lipofilik boyalarla veya polistiren mikrokürelerle işaretleyin. Ardından, kültürleme sırasında işaretleyicileri floresan mikroskopi veya optik koherens tomografi görüntüleme kullanarak takip edin.Elde edilen morfogenetik gerinim haritalarının görüntülenmesi, hem iki hem de üç boyutta doku uzaması, kısalması ve kayma bölgelerini göstermektedir. Merhaba, benim adım Ben Philis; Washington University in St.Louis Biyomedikal Mühendisliği Bölümü'nde Dr. Larry Tabor'un laboratuvarında lisansüstü öğrencisiyim. Bu tür deneylere başlamadan önce, model sisteminizdeki ilgili doku kültürü tekniklerini, erişebileceğiniz görüntüleme yöntemlerini ve ayrıca deneylerinizden elde etmek istediğiniz veri türünü göz önünde bulundurmanız önemlidir.Örneğin, dokulardaki deformasyonları iki veya üç boyutta analiz etmekle mi ilgileniyorsunuz? Bugün burada, erken evre piliç embriyosunda iki tamamlayıcı etiketleme tekniği göstererek bu soruların bazılarını ele alacağız. Merhaba, ben Victor Varner; Washington University in St. Louis'te, Dr. Larry Tabor'ın laboratuvarında çalışıyorum.Bu iki tekniğin her ikisinde de, erken dönem civciv embriyosundaki yüzlerce hücreyi hızlı ve eş zamanlı olarak işaretliyoruz. Bu işaretlerin hareketinin takibi, hücrelerin sonunda hangi dokulara yerleştiğini belirlememizi sağlamanın yanı sıra, erken embriyoyu şekillendiren doku düzeyindeki deformasyonu da nicelendirmemize olanak tanır. İlk olarak, yumurtaları Hamburger ve Hamilton tarafından tanımlanan istenen aşamaya gelene kadar boylamsal yönde inkübe edin.Yumurtanın alt kısmını 150 milimetrelik bir Petri kabının kenarında kırın. Kabuğu alt kısımdan ayırarak yumurta içeriğini kaba boşaltın ve küt uçlu pens kullanarak, sarısının etrafındaki daha kalın ve viskoz albümini uzaklaştırın. Şimdi, dairesel bir filtre kağıdının ortasına delikler açın.Filtre kağıdı halkalarından birini, embriyo halkanın merkezi deliğinden görünecek şekilde sarının üzerine yerleştirin. Filtre kağıdı halkasının dış çevresini mikro makasla kesin. Ardından, embriyonun yapışık olduğu kağıdı ince pensle sarıdan ayırın ve embriyoyu nazikçe bir PBS banyosunda bekletin. Yapışmış sarı parçacıklarını uzaklaştırmak için filtre kağıdı düzeneğini 35 mm'lik bir kültür kabına aktarın.Embriyoyu ventral tarafı yukarı gelecek şekilde yerleştirin ve ikinci bir filtre kağıdı halkası ile sabitleyin. Bir metal halka ile sabitleyerek embriyoyu kültür ortamına daldırın. Embriyo tamamen suya batırılmazsa, anormal derecede yüksek yüzey gerilimi yükleri doku geometrisini ve ardından gelen morfolojenezi büyük ölçüde değiştirebilir.Kültür sırasında, parlak alan mikroskobu kullanarak morfolojinin ve embriyonik evrenin uygunluğunu doğrulayın. İlk olarak, küçük bir miktar demir tozu alın, üzerine birkaç damla doygun boya ve alkol ekleyin ve çekilmiş bir mikro pipet ucuyla havada kurumaya bırakın. Kümelenmiş demir partiküllerini parçalayın ve bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.İyonize su ile birkaç kez durulama işleminden sonra, toplanan embriyoyu, bol miktarda kültür medyumu ile kaplanmış 35 milimetrelik bir kültür kabına sırt kısmı yukarı gelecek şekilde yerleştirin. Bir diseksiyon mikroskobunun altında, vitelin membranını kaldırmak ve elektrodermal hücreleri açığa çıkarmak için cam iğneyi kullanın. Şimdi, etiketlenmiş demir partiküllerinden oluşan bir sütunu bir mikro pipete çekin.Diseksiyon mikroskobu kullanarak pipeti embriyonun hemen üzerine gelecek şekilde konumlandırın. Partikülleri embriyonun üzerine serpmek için pipeti parmak uçlarınız arasında yavaşça ileri geri yuvarlayın. 37 °C'de 10 dakikalık inkübasyonun ardından, partikülleri güçlü bir mıknatıs yardımıyla uzaklaştırın.Gerektiğinde, mıknatısı ince uçlu manyetik bir penset setine tutturun ve kalan demir partiküllerini dikkatlice temizlemek için mıknatıslı penseti kullanın. Embriyonun hem brightfield hem de floresan görüntülerini almaya geçin. 22 gauge iğne ile.PBS içindeki 10 mikrometre çapındaki siyah mikroküre çözeltisini 10 cc'lik bir şırıngaya çekin. Ardından, bir bilgisayar sabit sürücüsü kullanarak çekilmiş cam iğnelerin uçlarını eğimlendirin ve boncuk çözeltisi ile doldurun. Çözeltinin uca ulaşması için bir mikro manipülatör kullanarak mikro pipete hafifçe vurun.Cam iğneyi embriyo ile aynı görüş alanına yerleştirin. Boncukların pipet ucundan akışını onaylayın. Şimdi pipet ucunu beyin tüpünün lümenine yerleştirin.Dokunun ventral tabanını delmemeye dikkat edin. Boncuklar ve sıvı lümene girerken dokudaki geçici şişmeyi izleyin. Ardından cam iğneyi hızla çıkarın.Son olarak, beyin tüpünün iç lümeninde yeterli boncuk yoğunluğu olduğunu doğrulayın. Parlak alan görüntüleri veya bir optik koherens tomografisi veri seti elde etmeden önce, boncukların çökelmesi için parlak alan mikroskobu altında 20 ila 30 dakika bekleyin. İlk görüntüleri elde ettikten sonra, numunelerin bulunduğu 7 adede kadar 35 milimetrelik kültür kabını 150 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin ve tüm düzeneği küçük bir plastik torbaya koyun.Nemlendirme için torbaya deiyonize su damlaları ekleyin ve ardından torbayı %95 oksijen ve %5 karbondioksit karışımıyla doldurun. Embriyoları, bir sonraki görüntüleme zaman noktasına kadar 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin; etiketlenmiş embriyoları 1,2 mL kültür ortamı içeren bir delta T kabına yerleştirin ve kabı 37 °C'de tutulan bir cam kapakla kapatın. Embriyoya mini pompa değişken akış cihazından sağlanan %95 O2 %5 CO2 gaz karışımı ile süperfüzyon uygulayın. Şimdi, istenen zaman aralıklarında otomatik olarak görüntüler alacak şekilde yazılımı ayarlayın.Deney süresince etiketler otomatik veya manuel olarak takip edilebilir ve işaretçi koordinatları için morfogenetik gerinim haritaları hesaplanabilir. Burada, kafa kıvrımı oluşumu sırasında elektrodermal hücrelerin etiketlenmesi ve hareketlerinin takip edilmesi için demir partikül tekniği kullanılmıştır. Erken evre tavuk embriyosunda, floresanla işaretlenmiş hücreler embriyonun tamamına dağıtılmıştır.Embriyonun parlak alan ve floresan görüntüleri, ex ovo kültürü sırasında farklı aralıklarla kaydedilmiştir. Bu işlem, izleme etiketlerinin hareketlerini takip etmek için yapılmıştır. Kümülatif veriler, baş kıvrımı oluşumu sırasındaki gelişen morfogenetik gerinim dağılımlarının hesaplanmasına olanak tanır.Benzer şekilde, erken evre civciv beyninin orta arka beyin sınırındaki doku hareketlerini izlemek için polistiren mikrosfer tekniği kullanılmıştır. Boncukların beynin iç lümeninin tüm yanlarına yapışma eğiliminde olması nedeniyle, bu yöntemin belirgin şekilde 3B deformasyonları yönetebildiğine dikkat edilmelidir. Boncuk hareketleri altı saat boyunca izlendikten sonra, işaretleyici koordinatları, boylamsal ve çevresel yönlerdeki doku deformasyonunu karakterize eden gerinimlerin hesaplanmasına olanak tanır.Bu videoyu izledikten sonra, kendi doku kültürünüzü ve etiketlemenizi gerçekleştirmek için gereken bazı deneysel basamaklar hakkında iyi bir fikir edinmiş olmalısınız. Burada sunulan protokol teknikleri, özellikle doğal dokular için minimum düzeyde invaziv olmaları, ayrıca düşük maliyetli ve kolayca temin edilebilen malzemeler içermeleri nedeniyle avantajlıdır. Bu deneyler, özellikle embriyonik gelişim mekaniği üzerine yapılan çalışmalar için oldukça kullanışlıdır.Etiketli hücrelerin takip edilen hareketleri kullanılarak hesaplanan deformasyon alanları, morfogenezin fiziksel modellerini hem test etmek hem de oluşturmak için kullanılabileceğinden.

tracking-morphogenetic-tissue-deformations-in-the-early-chick-embryo

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu makale, kraniyofasiyal gelişimi sırasında sinyalizasyon ve yüzey sefalik ektoderm desenlendirme özellikleri test etmek için tasarlanmış bir doku nakli tekniği açıklar.

Kraniofasial Geliştirme sırasında Ektodermal Epiteli Sinyal Özellikleri değerlendirilmesi

Gelişim sırasında tavuk embriyosunu görüntülemek ve ona erişmek zor olabilir. Basit, uygun maliyetli ve bir sınıfta veya araştırma ortamında kolayca kullanılabilecek bir ex ovo yöntemi geliştirdik. Bu yöntem, embriyonik gelişimin geç aşamalarına kadar embriyoya erişim sağlar (HH 40).

Optimize Ex-ovo Kalkınma Gelişmiş Aşamaları Chick Embriyolar ekimi

Büyüme faktörlerine veya sinyal yollarının spesifik inhibitörlerine batırılmış boncukları gelişmekte olan embriyolara aşılayarak, etkilerini in vivo olarak doğrudan test etmek mümkündür. Bu protokolde, bu moleküllerin gen ekspresyonu ve sinyal iletimi üzerindeki etkilerini belirlemek için boncuklar uzuv tomurcuğuna aşılanır.

Gen İfade Etkileyen Sinyal İletimi Pathways tanımak Tavuk Embriyo uzuvlar Geliştirme içine Boncuk eklenme

Ekstremite oluşumu için gerekli olan civciv embriyosunda ana gövde ekseni ve yan dokuları arasındaki indüksiyon olaylarını engellemek için geçirimsiz bariyerler kullanan protokoller anlatılmaktadır. Aday indüktif sinyallere batırılmış boncuklar, bariyer yerleşiminin etkisinin üstesinden gelmek için kullanılır ve gen ekspresyonunun analizi bunu doğrular.

Aday Faktörü Soaked Boncuk ile birlikte Geçirimsiz Engelleri Uygulama Chick Endüktif Sinyalleri Eğitim için

Burada, yeni eski-ovo deneyleri ve morfogenetik mekaniği erken piliç embriyonik beyin burulma sırasında çalışmak için fiziksel modelleme yaklaşımlar bir dizi tanıtımı iletişim kuralı mevcut.

Roller erken piliç embriyonik morfogenez fiziksel güçlerinin sondalama

Bu protokol, meyve sineği metamorfoza uğrarken Drosophila abdominal epitelde hücre oryantasyonu ve doku büyüme dinamiklerinin görüntülenmesi ve analizi için tasarlanmıştır. Burada açıklanan metodoloji Drosophila veya diğer model organizmalarda farklı gelişimsel aşamaların, dokuların ve hücre altı yapıların incelenmesine uygulanabilir.

Pupal Evrelerinde Gelişen Drosophila Epitelinde Doku Oryantasyonu ve Büyüme Dinamiğinin Görüntülenmesi ve Analizi

Bu makalede, kraniyofasiyal gelişim sırasında bazal ön beynin sinyal ve paternleme özelliklerini test etmek için tasarlanmış bir doku nakli tekniği anlatılmaktadır.

Yüz Gelişimini Değerlendirmek için Kuş Ön Beyin Kimeraları Oluşturmak

Rekombinant uzuvlar, hücre farklılaşma sürecini ve embriyonik sinyallerin etkisi altında kalıpların üretilmesini incelemeye izin veren güçlü bir deneysel modeldir. Bu protokol, farklı organizmalardan elde edilen diğer hücre tiplerine uyarlanabilen, tavuk ekstremite-mezodermal hücrelere sahip rekombinant uzuvlar üretmek için ayrıntılı bir yöntem sunar.

Morfogenez, Desenleme ve Hücre Farklılaşmasında Erken Adımları Anlamak için Tavuk Rekombinant Uzuvları Testi

Islatılmış boncuk testi, hücre farklılaşmasının ve morfogenezinin düzenlenmesini incelemek için herhangi bir gelişimsel zaman noktasında test reaktifinin hedeflenmiş olarak verilmesini içerir. Üç farklı tipte ıslatılmış boncuk hazırlamak ve bunları bir tavuk embriyosunun ara rakamlarına implante etmek için herhangi bir deneysel hayvan modeline uygulanabilir ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır.

Islatılmış Boncuk Tahlili Kullanılarak Tavuk Embriyogenezi Sırasında Hücre Farklılaşması, Morfogenez ve Desenleme Analizi

Burada, doku etkileşimlerini, 4D görüntüleme timelapse filmini (3D artı zaman), moleküler fonksiyonun küresel veya yerel bozulmasını ve sistem biyolojisi karakterizasyonunu incelemek için kullanılabilecek üç tip kuş embriyonik deri eksplant kültürü için protokolleri açıklıyoruz.

Doku Desenini ve Organogenezi İncelemek için Kuş Derisi Eksplantlarının Kullanılması

Bu protokol, civciv embriyo nörülasyonu sırasında nöral plak dokusunun mekanik özelliklerini uzunlamasına izlemek için geliştirilmiştir. Bir Brillouin mikroskobu ve bir sahne inkübasyon sisteminin entegrasyonuna dayanır ve ex ovo kültürlenmiş civciv embriyolarında nöral plaka dokusunun canlı mekanik görüntülemesini sağlar.

Civciv Embriyosunun Nöral Tüp Kapanması Sırasında Dokunun Mekanik Gelişiminin İzlenmesi

Öğrenin, erken civciv embriyolarında morfogenetik doku deformasyonlarını yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile izleme yöntemlerini. Floresan boyalar ve polistiren mikroküreler kullanılarak doku dinamikleri gerçek zamanlı analiz edilir.

Erken Civciv Embriyo morfogenetik Doku deformasyonlar Takibi

Daha fazla video keşfet