Erken Civciv Embriyo morfogenetik Doku deformasyonlar Takibi

Burada sunulan tekniklerin genel amacı, erken civciv embriyosunun kültürü için erken gelişim sırasında morfogenetik deformasyonu ölçmek için embriyonik dokuları etiketlemek ve kültürlemektir, bir filtre kağıdı taşıyıcı yöntemi kullanarak embriyoyu yumurtadan çıkararak başlayın. Deneysel uygulamaya bağlı olarak, ekstrakte edilen embriyoyu manyetik demir parçacıkları veya polistiren mikroküreler yoluyla verilen floresan lipofilik boyalarla etiketleyin. Ardından, floresan mikroskobu veya optik koherens tomografi görüntüleme kullanarak kültür sırasında etiketleri izleyin.

Elde edilen morfogenetik gerinim haritalarının görüntülenmesi, hem iki hem de üç boyutta doku uzaması, kısalması ve kesilmesi bölgelerini gösterir. Merhaba, benim adım Ben Philis ve St.Louis'deki Washington Üniversitesi Biyomedikal Mühendisliği Bölümü'nde Dr.Larry Tabor'un laboratuvarında yüksek lisans öğrencisiyim. Bu tür deneylere başlamadan önce, model sisteminizdeki ilgili doku kültürü tekniklerini, erişiminiz olabilecek görüntüleme yöntemlerini ve ayrıca deneylerinizden istediğiniz veri türünü göz önünde bulundurmanız önemlidir.

Örneğin, doku deformasyonlarını iki veya üç boyutlu olarak analiz eden doku ile ilgileniyor musunuz? Bugün burada, erken civciv embriyosunda iki ücretsiz etiketleme tekniği göstererek bu sorulardan bazılarını ele alıyoruz. Merhaba, benim adım Victor Varner ve St.Louis'deki Washington Üniversitesi'nde Dr.Larry Tabor'un laboratuvarında çalışıyorum.

Bu tekniklerin her ikisinde de, erken Civciv embriyosundaki yüzlerce hücreyi hızlı ve aynı anda etiketliyoruz. Bu etiketlerin hareketini izlemek, yalnızca bu hücrelerin sonunda ikamet ettiği dokuları belirlememize değil, aynı zamanda erken embriyoyu şekillendiren doku seviyesi deformasyonunu da ölçmemize olanak tanır. İlk olarak, yumurtaları hamburger ve Hamilton tarafından tanımlandığı gibi istenen aşamaya uzunlamasına bir yönde kuluçkaya yatırın.

Yumurtanın altını 150 milimetrelik bir Petri kabının yan tarafına kırın. Kabuğu alttan ayırın, yumurtanın içindekileri tabağa boşaltın ve künt forseps kullanarak daha kalın viskoz albümini yumurta sarısından çıkarın. Şimdi dairesel bir filtre kağıdının ortasından delikler açın.

Filtre kağıdı halkalarından birini, embriyo halkanın merkezi deliğinden görünecek şekilde yumurta sarısı üzerine yerleştirin. Filtre kağıdı halkasının dış çevresini mikro makasla kesin. Daha sonra ekli embriyo ile kağıdı ince forseps ile yumurta sarısından çıkarın ve embriyoyu bir PBS banyosuna hafifçe batırın Yapışan yumurta sarısı parçacıklarını çıkarmak için, filtre kağıdı düzeneğini 35 milimetrelik bir kültür kabına aktarın.

Ventral tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirerek, embriyoyu ikinci bir filtre kağıdı halkası ile gönderin. Metal bir halka ile sabitleyin ve embriyoyu kültür ortamına batırın. Embriyo tamamen suya batırılmazsa, doku geometrisi ve müteakip morfogenez, anormal derecede yüksek yüzey gerilimi yükleri tarafından büyük ölçüde değiştirilebilir.

Kültür sırasında, parlak alan mikroskobu kullanarak uygun morfolojiyi ve embriyonik aşamayı doğrulayın. İlk olarak, az miktarda demir tozu alın ve birkaç damla doymuş boya ve alkol ekleyin ve çekilmiş bir mikro pipetin ucuyla havayla kurutun. Topaklanmış demir parçacıklarını parçalayın ve bunları bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

İyonize su pozisyonu ile kaplanmış birkaç durulamadan sonra, hasat edilen embriyo dorsal bölgesi, cömert bir kültür ortamı tabakası ile kaplanmış 35 milimetrelik bir kültür kabına kadar uzanır. Diseksiyon mikroskobu altında, vilin zarını çıkarmak ve elektrodermal hücreleri açığa çıkarmak için cam iğneyi kullanın. Şimdi etiketli demir parçacıklarından oluşan bir sütunu bir peor pipetine çizin.

Diseksiyon mikroskobunu kullanarak, pipeti embriyonun hemen üzerine yerleştirmek için daldırın. Parçacıkları embriyo boyunca serpmek için pipeti parmak uçları arasında yavaşça ileri geri yuvarlayın. 37 santigrat derecede 10 dakikalık bir inkübasyondan sonra, güçlü bir mıknatıs kullanarak parçacıkları çıkarın.

Gerekirse, mıknatısı manyetik bir çift ince forseps'e takın ve kalan demir parçacıklarını dikkatlice çıkarmak için manyetize forsepsleri kullanın. Embriyonun hem parlak alan hem de floresan görüntülerini elde etmeye devam edin. 22 gauge iğne ile.

PBS'de 10 cc'lik bir şırıngaya siyah 10 mikrometre çapında mikro küreler içeren bir çözelti çekin. Ardından, bir bilgisayar sabit diski kullanarak çekilmiş cam iğnelerin uçlarını eğimlendirin ve boncuk çözeltisi ile doldurun. Bir mikro manipülatör kullanarak çözeltinin uca ulaşması için mikro pipeti hafifçe vurun.

Cam iğneyi embriyo ile aynı görüş alanına yerleştirin. Pipet ucundan boncuk akışını onaylayın. Şimdi pipet ucunu beyin tüpünün lümenine yerleştirin.

Dokunun ventral tabanını delmemeye dikkat edin. Boncuklar ve sıvı lümene girerken dokunun geçici şişmesini izleyin. Ardından cam iğneyi hızlıca çıkarın.

Son olarak, beyin tüpünün iç lümeninde yeterli boncuk yoğunluğunu doğrulayın. Parlak alan mikroskobu kullanarak, parlak alan görüntüleri veya optik uyumlu tomografi veri seti elde etmeden önce boncukların 20 ila 30 dakika oturmasına izin verin. İlk görüntüleri elde ettikten sonra, 150 milimetrelik bir Petri kabına 7 adet 35 milimetre kültür kabı yerleştirin ve tüm düzeneği küçük bir plastik torbaya yerleştirin.

Nemlendirme için torbaya deiyonize su damlaları ekleyin ve ardından torbayı %95 oksijen ve %5 karbondioksit karışımı ile doldurun. Embriyoları bir sonraki görüntüleme zaman noktasına kadar 37 derecelik bir inkübatöre yerleştirin, etiketli embriyoları 1.2 mililitre kültür ortamı içeren bir delta T kabına yerleştirin ve tabağı 37 santigrat derecede tutulan bir cam kapakla kapatın Embriyoyu mini pompalı değişken akışlı bir cihazdan sağlanan %95 O2 %5 CO2 gaz karışımı ile süper kaynaştırın. Şimdi yazılımı, zaman aralıkları isteyen görüntüleri otomatik olarak elde edecek şekilde ayarlayın.

Deney boyunca, etiketler otomatik veya manuel olarak izlenebilir ve işaretleyici koordinatları için morfogenetik gerinim haritaları hesaplanabilir. Burada, kafa kıvrımı oluşumu sırasında elektrodermal hücrelerin hareketini etiketlemek ve izlemek için demir parçacığı tekniği kullanıldı. Erken civciv embriyosunda, floresan işaretli hücreler tüm embriyo boyunca dağıtıldı.

Embriyonun parlak alan ve floresan görüntüleri, ex ovo kültür sırasında farklı aralıklarla yakalandı. Broşür etiketlerinin hareketlerini izlemek için. Kümülatif veriler, kafa kıvrımı oluşumu sırasında gelişen morfogenetik gerinim dağılımlarının hesaplanmasına izin verir.

Benzer şekilde, polistiren mikroküre tekniği, erken civciv beyninin orta arka beyin sınırındaki doku hareketlerini izlemek için kullanıldı. Boncuklar beynin iç lümeninin her tarafına yapışma eğiliminde olduğundan, bu yöntemin belirgin bir şekilde 3D deformasyonu işleme yeteneğine sahip olduğunu unutmayın. Boncuk hareketlerini altı saat boyunca izledikten sonra, işaretleyici koordinatlar, uzunlamasına ve çevresel yönlerde doku deformasyonunu karakterize eden suşların hesaplanmasına izin verir.

Bu videoyu izledikten sonra, kendi doku kültürünüzü ve etiketlemenizi uygulamak için gereken bazı deneysel adımlar hakkında iyi bir fikre sahip olmalısınız. Burada sunulan protokol teknikleri, doğal dokulara minimal düzeyde invaziv olmaları ve aynı zamanda düşük maliyetli ve kolayca bulunabilen malzemeleri içermeleri nedeniyle özellikle avantajlıdır. Bu deneyler özellikle embriyonik gelişimin mekaniği üzerine yapılan çalışmalar için yararlıdır.

Etiketli hücrelerin izlenen hareketi kullanılarak hesaplanan deformasyon alanları, morfogenezin fiziksel modellerini hem test etmek hem de oluşturmak için kullanılabilir.