Name: Allelotyping belirlenmesi için bir PCR Salmonella enterica Serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg ve Typhimurium (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: Öğrenin, Salmonella enterica serovarlarını hızlıca tanımlamak için çoklu PCR yöntemini. Bu teknik, epidemiyolojik çalışmalarda ve gıda güvenliği izlemede patojen tespitini kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, ABD Tarım Bakanlığı Hibe 1999-35212-8680 2.005-01.378 ve 2010-04288-01, USDA Formula Fonları ve Gürcistan&#39;ın Veterinerlik Tarımsal Araştırma Grant Devlet tarafından desteklenen olmuştur. Bu yayında açıklanan protokol yönettiği araştırma derslerin bir parçası olarak lisans öğrencileri tarafından kullanılmak için geliştirilmiştir: MIBO 4900L, GENE 4960H, BCMB 4960L, ve Georgia Üniversitesi BIOL 4960H ve Maurer birkaç moleküler epidemiyoloji araştırma projeleri öğrenciler tarafından kullanılan laboratuvar. Maurer ve Lee laboratuvarlar araştırmalar yapmış, pek çok lisans öğrencileri ve Bölüm Başkanı John Glisson araştırma ile lisans eğitimi bütünleştirmek için çabalarımızı desteklemek için teşekkür etmek istiyorum.

<ol><li>Dauga, C., Zabrovskaia, A., Grimont, P. A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+fragment+length+polymorphism+analysis+of+some+flagellin+genes+of+Salmonella+enterica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Restriction fragment length polymorphism analysis of some flagellin genes of Salmonella enterica.</a> J. Clin. Microbiol. 36, 2835-2843 Forthcoming.</li>
<li>Hong, Y., Liu, T., Lee, M. D., Hofacre, C. L., Maier, M., White, D. G., Ayers, S., Wang, L., Berghaus, R., Maurer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+screen+of+broth+enrichments+for+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis%2C+Hadar%2C+Heidelberg%2C+and+Typhimurium+using+an+allelotyping+multiplex+PCR+that+targets+O+and+H+antigen+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">A rapid screen of broth enrichments for Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium using an allelotyping multiplex PCR that targets O and H antigen alleles.</a> J. Food Prot. 72, 2198-2201 (2009).</li>
<li>Hong, Y., Liu, T., Lee, H. ofacre, Maier, C. L., White, M., Ayers, D. G., Wang, S., Berghaus, L., R, M. aurer <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((J.Rapid+screening+of+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis%2C+Hadar%2C+Heidelberg+and+Typhimurium+using+a+serologically-correlative+allelotyping+PCR+targeting+the+O+and+H+antigen+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">J.Rapid screening of Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg and Typhimurium using a serologically-correlative allelotyping PCR targeting the O and H antigen alleles.</a> BMC Microbiol. , (2008).</li>
<li>Liu, T., Liljebjelke, K., Bartlett, E., Hofacre, C. L., Sanchez, S., Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+nested+PCR+to+detection+of+Salmonella+in+poultry+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">Application of nested PCR to detection of Salmonella in poultry environments.</a> J. Food Prot. 65, 1227-1232 (2002).</li>
<li>Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+and+limitation+of+molecular+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Food+Sci.+Tech%22%5BJournal%5D)">Rapid detection and limitation of molecular techniques.</a> Ann. Rev. Food Sci. Tech. 2, 259-279 (2011).</li>
<li>Moscoso, H., Alvarado, I., Hofacre, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+infectious+bursal+disease+virus+from+bursal+tissues+collected+on+FTA+filter+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Avian+Dis%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of infectious bursal disease virus from bursal tissues collected on FTA filter paper.</a> Avian Dis. 50, 391-396 (2006).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory%22">Molecular cloning: a laboratory</a>. , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).</li>
<li>Wittwer, C. T., Fillmore, G. C., Hillyard, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+polymerase+chain+reaction+capillary+tubes+with+hot+air%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Automated polymerase chain reaction capillary tubes with hot air.</a> Nucleic Acids Res. 17, 4353-4357 (1989).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Salmonella cinsi (örn. invaziv) özgü hedefleri genlerin tespiti için piyasada bulunan PCR testleri. Ancak, tüm Salmonella insan ve hayvan popülasyonlarının prevalansı hastalığa neden yeteneklerini eşit. Salmonella LPS O-antijen ve flagellinH1 ve H2 antijenleri antijenik farklılıklar erken tanınması, bu antijenik farklılıklar üzerinde 2.500 serovars Salmonella farklılaşma yol açmıştır . Cinsi, Salmonella belirlenen 46 ayrı O antijenleri ve 86 ayrı flagellin (H) antijenleri vardır. Salmonella (H1) ya da iki farklı (H1, H2) flagellins sahip olabilir. O, H1, H2 antijenleri 2500 Salmonella serovars hesabı farklı bir birleşimi bugün kabul etti . Serovar belirlenmesi bireysel O ve H antijenleri elde edilen antijenik formül üzerinde olarak atanır. O antijenik formül olarak şöyle yazılabilir: H1: H2 ve burada &quot;-&quot; O-antijen için negatif Salmonella H1 veya H2 flagellin ve &quot;NT&quot; (tiplendirilemeyen) yokluğu anlamına gelir . Örneğin, bir S. serovar Typhimurium atanır 1,2 Enteritidis bir formülü D1 ile izole edilirken: i: enterica antijenik formül B ile izole g, m: -. Salmonella nüfusunun Bu nedenle PCR ile kolayca yararlanılabilir nükleotid düzeyde farklılıklar antijenik varyasyon dışa tezahürüdür. Biz belirlenmesi S. allelotyping PCR geliştirmek için belirli O ve H alleller ile ilişkili genetik farklılıkları tespit enterica serovars: Enteritidis, Hadar, Heidelberg ve Typhimurium (3). Hadar (C2: z10: e, n, x), Heidelberg (B-H1: Salmonella serovar Enteritidis H2 antijenik formüller (D1:: g, m) doğru atama ve raporlama O ile ilişkili tüm alleller için test : r: 1,2) ve Typhimurium (B: i: 1,2). O aleli veya antijen, H1 g bulgu bilgisi olmadan, tek başına m allel mutlaka Salmonella Salmonella serovars olarak Enteritidis olarak izole tanımlamaz: Agona, California ve Montevideo, aynı zamanda bu aynı allel sahip. Allelotyping PCR başlangıçta ön plana Salmonella serovars belirtilen algılamak için tasarlanmış iken, bu test bir ek 19 serovars (Tablo 3) tanımlayabilirsiniz. Bizim allelotyping PCR aslında O ve H allel tespit etmek için tasarlanmıştır. Pratikte ise, bize değil, O-spesifik antiserumlar kullanılarak izole edilen Salmonella kültürleri ile çalışırken O allelotyping PCR performans, O-antijen slayt aglütinasyon testi ile tespit etmek için daha pratik ve uygun maliyetli hale gelmiştir. Ancak, laboratuvar (2) bir ekran veya Salmonella FTA kartları (6) teslim izole yazmak için bu PCR kullanıyorsa O allelotyping PCR yöntemi tavsiye ve numunelerin ilk ekran ile Salmonella-spesifik PCR (4 include .) Allelotyping PCR PCR veya biyokimyasal / antijen testleri Salmonella olarak tanımlanır sadece bu örnekleri sınırlayın. Bu makalede açıklanan protokol Idaho Teknoloji Rapidcycler, bir çok ısıtma bloğu thermocyclers daha kısa sürede reaksiyon hacmi ve çalışan reaksiyon şartları küçültün sağlayan bir sıcak hava PCR ile kullanım için optimize edilmiştir. Ayarlayarak astar konsantrasyonları; veya MgCl 2 konsantrasyonları ayarlayarak bir ısıtma bloğu PCR ile kullanmak için bu protokol uyarlamak için tavlama sıcaklıkları düşürülmesi / yükseltilmesi deneysel reaksiyon koşulları optimize gerekebilir. Örneğin, MJ Research PTC-200 PCR aşağıdaki gibi protokol uyum sağlamak zorunda kalıyor. Tablo 1&#39;de açıklanan aynı reaksiyon hacmi ile çalışma, çalışma stok concentrationof i astar set 2.5 mcM seyreltilir, tavlama sıcaklığı 55 ° C - 45 ° C ve inkübasyon denatürasyon kez, tavlama ve uzatma adımları düşürülmüştür i / g, m allelotyping PCR için 20 saniye kadar uzatılmış oldu. Yayınlanan protokoller de dahil olmak üzere herhangi bir PCR için başlangıç ​​yukarı ve optimizasyonu, uygun pozitif ve negatif kontroller gereklidir. Hadar (C2: z10: e, n, x), Heidelberg (B: r - Enteritidis (D1:: g, m) Biz özellikle Anatum (E1:: e, h 1,6), bilinen Salmonella serovars elde önermektedir. : 1,2), Montevideo (C1: g, m, s: 1,2,7) ve Typhimurium (B: i: 1,2) ve bir laboratuvar Escherichia coli K12 suşu (DH5α LE393, JM109, vb . sırasıyla bu makalede anlatılan allelotyping PCR testleri pozitif ve negatif kontrolleri gibi). Bu Salmonella serovars birkaç test edildiği allel bağlı olarak, pozitif veya negatif kontrol olarak hizmet verecek. Bazı önlemler ve kurallar Bu ve diğer herhangi bir teşhis PCR yaparken takip edilmesi gerekir. İlk olarak, fiziksel ayırmaşablon hazırlama, PCR set-up ve jel elektroforezi mümkün PCR carry-over, kirlenme ve yanlış pozitif hatalı raporlama önlenmesinde kritik önem taşımaktadır. Ayrıca, bu kontroller olarak ortaya çıkan sorunları belirlemek ve sonuçları (5) yorumlanmasına yardımcı olarak gerekli kontrollerin dahil herhangi bir rutin PCR gereklidir. En önemlisi, tutarlılık Amplikon boyutu Amplikon (PCR ürünü) algılama andestimation elektroforetik koşulları açısından, özellikle önemlidir. Bu noktayı açıklamak için, biz bilerek Şekil 1A amaçlanan daha önceki elektroforez askıya aldı. Moleküler ağırlık standartları (şerit 1 ve 13) ve pozitif kontrol (2 şeritli), yeterince doğru boyutları tahmin ya da küçük boyutlarda farklılıklar vardır (~ 50 bp) DNA parçalarının ayrılması gözlemlemek için ayrılmış değildir. Yeterli DNA parçalarının ayrılması, özellikle moleküler ağırlık standartları, pozitif Amplikon boyutu ve bazen herhangi bir PCR (5 günlük çalışma gözlenen non-spesifik amplikonlarının ayırt &quot;gerçek pozitif&quot; doğru tahmin bağlıdır esastır .) Örneğin, Şekil 1B, şeritli 7 (boyut olarak ~ 700 bp) non-spesifik bir Amplikon vardır. Boya ön agaroz jel yarı yolda noktada sadece elektroforez, çok erken kesilmeli olsaydı, 500 bp ve 700 bp DNA parçalarının arasında çok az bir farklılaşma var olacaktır. Bu nedenle, örnek şeritli 7 yanlışlıkla i ve g, m allel hem de olumlu bildirilmiştir olurdu. Son olarak, herhangi bir test ile ilgili sınırlamaları tanımak gerekir. 1,5, 1,6, 1,7 antijen kompleksi; e, n, x / e H2 1,2 ait alleller ince genetik farklılıkları ayırt etmek H1/H2 allelotyping PCR çeşitli ayrımcı güç yok? n, g, m allel Z15 antijen içeren karmaşık ve H1 G antijen kompleksi,. Bir ya da iki farklı epitoplar bu flagellar antijenleri bulunan amino asit değişiklikleri oluşturmaktadır. Bu nedenle bize flagellin gen sekansı (3), bu bazen tek bir baz çifti farklılıklar yararlanabilir primerler dizayn için zordu. Örneğin, Salmonella serovars Dublin (D1: g: p) ve Berta (D1: f, g, t:) primerler mallelotyping, g da PCR pozitif. Bradford (1,5: r B), Heidelberg (1,2 B: r), Lagos (: i 1,5 B) H2 allelotyping primerler Typhimurium (1,2: i B) ayırt edemez Glostrup&#39;dan ikinci Winneba (B: r: 1,6), ya da Remo (C2: z10: e, n, Z15) (B: ​​r: 1,7), ya da Hadar (e, n, x C2: z10). Bu serovars karşılaşma ihtimalini de beraberinde getirir: Lagos, Bradford, Winneba, Remo veya Glustrup uzak bir olasılık ve ya testler sınırlama veya başka bir doğrulayıcı test feragatname sağlayan gerektirir. Sonuç olarak, bu PCR tabanlı serotipleme hızla S. tanımlar enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg ve Typhimurium ve O, H1 ve H2 allel 19 ek serovars ile ilişkilidir. Bu testte serotipleme Salmonella geleneksel mikrobiyolojik yaklaşım hızlı, düşük maliyetli bir alternatif.

<table border="1"><tbody><tr><th> Malzeme Adı </th><th> Tip </th><th> Şirket </th><th> Katalog Numarası </th><th> Yorum </th></tr><tr><td> Luria Bertani </td><td></td><td> Balıkçı </td><td></td><td> (Ya da herhangi bir karşılaştırılabilir tek bir kaynak) </td></tr><tr><td> Mikrofuge&#39;de tüpler </td><td> 1.5 ml kapasiteli </td><td> Balıkçı </td><td></td><td> (Ya da herhangi bir karşılaştırılabilir tek bir kaynak) </td></tr><tr><td> Etanol </td><td> 200 kanıtı </td><td> Balıkçı </td><td></td><td> (Ya da herhangi bir karşılaştırılabilir tek bir kaynak) </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> Moleküler Biyoloji </td><td> Sigma </td><td></td><td> (Ya da herhangi bir karşılaştırılabilir tek bir kaynak; PCR sadece) </td></tr><tr><td> 10 x PCR Buffer: </td><td> 20 mM MgCl 2 </td><td> Idaho Teknoloji </td><td></td><td> (Tampon BSA, Ficoll ve Tartrazin gelir) </td></tr><tr><td></td><td> 30 mM MgCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 40 mM MgCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PCR primerleri </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> dNTP </td><td></td><td> Roche </td><td></td><td> (Ya da herhangi bir karşılaştırılabilir tek bir kaynak) </td></tr><tr><td> Taq DNA Polimeraz </td><td></td><td> Denville </td><td></td><td> (Ya da herhangi bir karşılaştırılabilir tek bir kaynak) </td></tr><tr><td> Kılcal pipetler </td><td> 10 ul hacmi </td><td> Idaho Teknoloji </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hızlı Cycler </td><td></td><td> Idaho Teknoloji </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agaroz </td><td> Düşük EEO, Moleküler Biyoloji </td><td> BioRad </td><td></td><td> (Ya da herhangi bir karşılaştırılabilir tek bir kaynak) </td></tr><tr><td> 50 X TAE Tampon veya 5X TBE Tampon </td><td></td><td> Balıkçı </td><td></td><td> (Ya da herhangi bir karşılaştırılabilir tek bir kaynak) </td></tr><tr><td> Etidyum bromür </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Ya da herhangi bir karşılaştırılabilir tek bir kaynak) </td></tr><tr><td> Yatay, dalgıç jel elektroforez jel kalıp odasına </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Ya da herhangi bir karşılaştırılabilir tek bir kaynak) </td></tr><tr><td> Güç kaynağı </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Ya da herhangi bir karşılaştırılabilir tek bir kaynak) </td></tr><tr><td> Moleküler Imager Gel Doc Sistemi </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Ya da herhangi bir karşılaştırılabilir tek bir kaynak) </td></tr></tbody></table> Tablo 4. Malzemeler

allelotyping belirlenmesi için bir pcr salmonella enterica serovars enteritidis, hadar, heidelberg ve typhimurium

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

Bu cinse özgü Salmonella hedef genlerin belirlenmesi için mevcut ticari PCR testleri. Ancak, iki tür, altı alttür ve 2.500 &#39;in üzerinde farklı Salmonella serovars, ve tüm halk sağlığı için önemi eşit. Örneğin, S. bulma enterica alttür IIIa Arizona bir tablo yumurta katman çiftlikte S. izolasyonu ile karşılaştırıldığında önemsiz enterica alttür serovar Enteritidis, salmonelloz tablo yumurta tüketimi ile bağlantılı önde gelen nedenidir. Serovars antijenik lipopolisakkarid farklılıklar (LPS) (O antijen) ve flagellin (H1 ve H2 antijenleri) göre tespit edilir. Bu antijenik farklılıklar bu fenotip ile ilişkili genler ve gen allel çeşitliliğini dış görünüş. Multipleks PCR allelotyping geliştirilen dört ana S. arasında genetik farklılıkların tuşları enterica alttür I serovars kümes hayvanlarında bulunan ve ABD&#39;de önemli bir insan hastalığı ile ilişkili . PCR primer çiftleri, anahtar gen ya da belirli bir Salmonella serovar benzersiz ve bu gen ya da alleli için belirli bir büyüklüğe sahip bir Amplikon üretmek için tasarlanmış dizileri hedef alındı. Salmonella serovar özel LPS için PCR testi sonuçlarının kombinasyonu dayalı izole etmek için atanır ve flagellin allel gen. Bu makalede açıklanan multipleks PCR S. tespiti için özeldir enterica alttür I serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, ve Typhimurium. Burada Salmonella izole serovar belirlemek için multipleks PCR nasıl kullanılacağını göstermektedir.

Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, ve Typhimurium hızlı tespiti için bir multipleks PCR açıklar. Belirli Salmonella serovars, belirli bir serovar O-antijen biyosentezi küme ve flagellin benzersiz genler ve dizileri bir multipleks PCR hedef tespit edilebilir. Serovar hedef allel ilgili özel, boyut amplikonlarının (PCR ürünü) görünümünü dayalı izole Salmonella sonra atanır.

Allelotyping belirlenmesi için bir PCR Salmonella enterica Serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg ve Typhimurium

Salmonella'yı tanımlamak için kullanılan mevcut ticari PCR testleri, bu cinsle özgü genleri hedeflemektedir. Ancak, iki tür, altı alt tür ve ... üzerinde

Aşağıdaki deneyin genel amacı, spesifik salmonella antijen allellerini tanımlamaktır. Bu, söz konusu allellerle ilişkili spesifik sekans farklılıklarını belirlemek için PCR hedeflenerek gerçekleştirilir. Örnek kalıbı; allele özgü primerler ile OH bir ve H iki allel tipleme içeriğini kapsayan bir PCR reaksiyon karışımına eklenir.PCR'ler termosiklet cihazında çalıştırılır. Ardından, her bir örnek için amplikonun varlığını belirlemek veya onu izole etmek amacıyla PCR örnekleri jel elektroforezi kullanılarak boyutlarına göre ayrılır. Daha sonra amplikon boyutu, kullanılan primer setlerinin her biri için beklenen boyutla ilişkilendirilir ve spesifik salmonella antijeninin tanımlandığını gösteren PCR sonuçları elde edilir.PCR ile aleller belirlendikten sonra, OH bir ve H iki multiplex PCR analizlerinin sonuçlarına dayanarak SEROVAR tanımlaması yapılır. Bu videoda açıklanan protokolün SYP'ye göre temel avantajı, hızlı, yorumlanması daha kolay ve daha az maliyetli olmasıdır. Bu yöntem, kanatlı veya süt çiftlikleri içindeki veya arasındaki salmonella VAR'larının dağılımını ve kalıcılığını belirlemek gibi epidemiyoloji alanındaki bazı temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu tekniğin uygulama alanı, salmonella, serovarlar, arius veya urian kaynaklı salmonozisin hızlı teşhisine kadar uzanmaktadır. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi, salmonella türlerini serovar düzeyine kadar tanımlamak için bu PCR tabanlı yöntemin nasıl kullanılacağını anlamak açısından kritiktir. Bu prosedür, sonraki PCR reaksiyonu için tüm hücre DNA şablonunu hazırlamak amacıyla University of Georgia'daki Lee Mauer Laboratuvarları'ndan araştırma bilimcileri Adriana Pedroso ve Yin Chang tarafından gösterilecektir.Öncelikle, bir mililitre LB besiyerine tek bir koloniden izole edilmiş salmonella inoküle edin. Kültürü, dakikada 200 ila 250 devirde çalkalayarak 37 °C inkübasyon sıcaklığında inkübe edin.Ertesi gün, bir mililitre kültürü 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve hücreleri çöktürmek için süspansiyonu yaklaşık iki dakika boyunca 4.500 ×g hızında santrifüjleyin; ardından süpernatantı aspire edin ve bakteriyel peleti bir mililitre %100 Ethanol içinde yeniden süspande edin. Etanol süspansiyonundaki hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin ve ardından hücreleri daha önce olduğu gibi santrifüjleyin. Peleti bir mililitre PBS içinde yeniden süspande edin. Santrifüjleme sonrası süpernatantı aspire edin ve peleti bir mililitre steril distile su içinde yeniden süspande edin. Son olarak hücre süspansiyonunu dilüe edin.Distile su ile 20 kat seyreltin ve PCR hazırlığına hazır olana kadar bir ay boyunca -20 °C'de saklayın. PCR reaksiyon karışımının hazırlanması ve dağıtımı, fiziksel olarak ayrı bir odada ve tercihen UV ışığıyla donatılmış özel bir PCR iş istasyonunda gerçekleştirilmelidir. İlk olarak, çalışma yüzeyini UV ışığıyla ve %10'luk çamaşır suyu ile silerek dekontamine edin. Ardından, yalnızca PCR çalışmaları için ayrılmış ve bariyerli pipet ucu takılmış bir pipet kullanın.Önce primerleri distile su ile 5x10⁻⁴ M konsantrasyona seyrelterek bir ana primer stok hazırlayın. Ardından, 25 µM çalışma konsantrasyonuna ulaşmak için stoğu distile su ile 1/20 oranında seyreltin. PCR reaktiflerini ve tüm hücre kalıbını dondurucudan çıkarıp buz üzerinde çözdürün.tac DNA polimerazı gerekene kadar dondurucuda tutun. PCR reaktiflerini yazılı protokolün birinci tablosuna göre birleştirin. Ardından, PCR reaksiyonundan dokuz µL pipetleyin.Steril 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı polistiren mikrotitrasyon plakasının kuyucuklarına karıştırın. İlk sütunun üstünden başlayarak sütun boyunca aşağıya, ardından bir sonraki sütunun üstüne doğru ilerleyin; negatif kontrol olarak hizmet etmesi için ilk kuyucuğa bir mikrolitre distile su ekleyin. Ardından, ikinci kuyucuktaki PCR karışımına 0.5 mikrolitre pozitif kontrol kalıplarını ve üçüncü kuyucuğa bir mikrolitre e coli K 12 DH five alpha ekleyin.Üçüncü örnek kalıbından bir µL'yi geri kalan kuyucuklara ekleyeceğiz; H1 ve Gyp PCR için Salmonella enterica, CVaR ve Enteritidis, sırasıyla i ve GM alelleri için pozitif kontroller olarak hizmet edecektir. Salmonella CVaR, Heidelberg ve Haar, sırasıyla r ve z10 alellerini tespit etmek için ikinci H1 alel tipleme PCR'ında kullanılacak pozitif kontrollerdir. Ardından, 10 µL kapasiteli cam kapillerleri Idaho teknolojisi için belirlenmiş tutuculara yerleştirin.Hızlı döngüleyici tutucuya sabitlendiğinde, kılcal tüplerin uçlarını kuyucukların tabanına değdirerek her bir cam kılcal tüpe PCR reaksiyon karışımını yükleyin. Sıvının tüp boyunca aşağı inmesini sağlamak ve uçlar ile PCR karışımı arasında boşluk oluşturmak için tutucuyu eğik konuma getirin. Kılcal tüplerin her iki ucunu bütan pürmüzü ile ısı mühürlemeden önce, kılcal tüpleri ve tutucuyu Idaho technology hızlı döngüleyicisine yerleştirin ve farklı all ELO tipi PCR'lar için yazılı protokolün birinci tablosunda açıklanan termodöngüleyici programlarını kullanın.Termosiklatör programı tamamlandığında, standart prosedürlere uygun olarak etidyum bromür içeren, 15 by 10 santimetre boyutlarında, %1,5'lik moleküler biyoloji sınıfı agaroz jel ile jel elektroforezi adımına geçiniz. Jel katılaştıktan sonra, jeli 200 mikrolitre 0,25 miligram/mL önceden karıştırılmış 1x TAE elektroforez tamponu içeren daldırma tipi yatay elektroforez tankına aktarınız.40 µL altı kat DNA yükleme boyası içeren DNA moleküler ağırlık markerlarından, ilk, orta ve son kuyucuklara 4,8 µL önceden karıştırılmış DNA moleküler ağırlık markerı yükleyin. Ardından, tutucudan içinde PCR örnek reaksiyonu bulunan bir cam kapiler kaldırın ve kapilerin her iki ucunu cam kesici ile çizin. Daha sonra, her iki elinizin baş ve işaret parmağını cam kesici ile işaretlenmiş kapiler uçlarının her iki yanına yerleştirin ve kapileri kırın; kapiler dağıtıcısını PCR reaksiyon karışımının karşı ucuna yerleştirin ve sıvı tüpün en altına gelene kadar pistonu yavaşça saat yönünde çevirin.Kılcal boruyu doldurulacak kuyucuğun içine yerleştirin ve ağırlıklandırılmış örneği kuyucuğa aktarmak için pistonu yavaşça saat yönünde çevirin. Kılcal boruyla kuyucuğu delmemeye veya sıvının tamamı kılcal borudan çıktıktan sonra pistonu çevirmeye devam ederek kuyucuğa bir hava kabarcığı sokmamaya dikkat edin. Tüm örnekler ve standartlar yüklendikten sonra, güç kaynağının sabit voltajını 90 volt olarak ayarlayın.Elektroforez tamamlandığında, DNA fragmanlarını ve moleküler ağırlık standartlarını görüntülemek için jeli bir UV transilüminatöre aktarın ve bir gel dock XR sisteminde görüntüleri yakalayın. Son olarak, kapiler tutucuları 15 ila 30 dakika boyunca %10'luk çamaşır suyunda bekletin. Distile su ile üç kez durulayın ve havada kuruması için tekrar PCR hazırlık odasına yerleştirin.Bu ilk etidyum bromür boyamalı jel, salmonella entera var, enteritis, hadda Heidelberg.Antifa ile ilişkili O aleli için yapılan multipleks PCR sonuçlarını göstermektedir. Birinci ve 13. şeritler 100 baz çiftlik DNA merdiveni içermektedir.İkinci şerit; B, C bir, C iki, D bir ve E O alelleri için multiplex PCR kontrollerini içerir. Geriye kalan üç ila 12 arasındaki şeritler salmonella izolatlarını içerir. Bir salmonella izolatına, PCR kontrolünün boyutuyla eşleşen amplikon boyutuna ve soldan sağa kullanılan alel prima setleri için öngörülen değere göre bir alel tanımı verilir. Bu amplikon boyutları şöyledir: D 1 620 baz çifti, C iki 400 baz çifti, E 1 280 baz çifti, C 1 340 baz çifti ve B 560 baz çifti.Bu iridyum bromür boyalı jel, eye ve gm alellerindeki FLA jeli tanımlamak için yapılan H1 aleli multipleks PCR sonuçlarını göstermektedir. Jel, daha önce gösterilen sırayla yüklenmiştir. Tekrar etmek gerekirse, PCR kontrolüyle boyutu eşleşen bir amplikonun varlığına ve soldan sağa kullanılan dört H1 aleli primer seti için öngörüldüğü şekilde, her izolate bir H1 aleli atanmıştır.Amplikon boyutları GM için 310 baz çifti ve I için 510 baz çiftidir. Bu etidyum bromür boyalı jel, gellin r ve z 10 alellerini tanımlamak için yapılan H bir aleli multiplex PCR sonuçlarını göstermektedir. Jel, daha önce gösterildiği şekilde doldurulmuş olup, PCR kontrolüyle boyutu eşleşen bir amplikonun varlığına ve kullanılan dört H bir aleli primer seti için öngörüldüğü üzere, her bir izolata bir H bir aleli atanmıştır; amplikon boyutları R için 170 baz çifti ve Z on için üç yüz altmış baz çiftidir.Bu teknik, uygun şekilde uygulandığında dört saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, PCR taşıma kontaminasyonu riskini en aza indirmek için kalıp hazırlama, PCR kurulumu ve jel elektroforez işlemlerini fiziksel olarak birbirinden ayırmayı unutmayın.

an-allelotyping-pcr-for-identifying-salmonella-enterica-serovars

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu protokol, ardından hızlı bir şekilde tüm hücre algılama, domates ve diğer taze ürün yüzeyler örnekleme için basit bir yapışkan bant tabanlı yaklaşım,...

Yapışkan bant tabanlı Örnekleme ve Floresans kombinasyonu In situ</emHızlı Algılama> Hibridizasyon Salmonella Taze üretin

H7 benzersiz bir genetik işaretleyici, Z3276 hedefleme: A QPCR tahlil Escherichia coli O157 tespiti için geliştirilmiştir. QPCR canlı hücre algılaması için propidyum monoazide (PMA), tedavi ile kombine edilmiştir. Bu protokol, çok sayıda numune, kolay ve uygun kullanım için bir 96 oyuklu plaka formatı değiştirilmiş ve uyarlanmıştır...

Live Algılama<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: PMA-qPCR H7 Hücreler

Bu yazıda, aynı anda Enterococcus spp ölçmek için kullanılabilecek bir çift yönlü dijital PCR deneyi. Ve eğlence sularda genel olarak insan ilişkili dışkı kirlenme göstergeleri olarak HF183 genetik işaretleyiciler açıklanmaktadır.

Eşzamanlı Niceleme için Dubleks Dijital PCR Testi<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Ve Waters İnsan Fekal ilişkili HF183 Marker

Salmonella spp. /Shigella spp. ortak patojenler için ishal atfedilen. Burada, biz yüksek üretilen iş platformu Salmonella spp. testi ile taranması için tarif / gerçek zamanlı PCR kullanarakShigella spp. rehberli kültürü ile kombine.

Salmonella spp. testi ile taranması için yüksek üretilen iş platformu /Shigella spp.

Burada, gıda ve çevre microbiomes DNA örnekleri uyumlu algılama ve Salmonella quasimetagenomic sıralama yoluyla subtyping hazırlamak için bir iletişim kuralı mevcut. Kombine kullanım kültürü zenginleştirme, immunomagnetic ayrılık (IMS) ve birden çok deplasman amplifikasyon (MDA) Gıda ve çevre örnekleri Salmonella genomik DNA'ın etkili konsantrasyon sağlar.

Metagenomic yarı analiz Salmonella gıda ve çevre örnekleri

Multi-Locus değişken-sayı tandem-Repeat analiz (MLVA) tahlil burada sunulan ucuz, sağlam ve taşınabilir yüksek çözünürlüklü balık-patojen bakteri Yersinia ruckeriGenotipleme sağlar. Saf kültürlerden başlayarak, tahlil düşük uygulamalar için on-loci MLVA profilleri üretmek için Multiplex PCR ve kapiller Elektroforez istihdam.

Multiplex PCR ve kapiller Elektroforez tarafından çok-Locus değişken-sayı tandem-balık tekrar Analizi-patojen Bakterium Yersinia ruckeri

Bakteriyel Fitness belirlenmesi için bu moleküler tabanlı yaklaşım dijital PCR üzerinden nicelik benzersiz genomik DNA barkodları kullanarak mikroorganizmaların kesin ve doğru algılanmasını kolaylaştırır. Protokol, Salmonella suşları için rekabetçi dizinin hesaplanmasında açıklanmaktadır; Ancak, teknoloji, herhangi bir genetiği değiştirilmiş organizmanın mutlak ölçümlerini gerektiren protokollere kolayca adapte olmaktadır.

Salmonella Fitness yüksek verimlilik analizi için dijital PCR tabanlı rekabetçi endeksi

Döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP), patojen tespit alanında geniş ilgi gören bir izotermal nükleik asit amplifikasyon testidir (iNAAT). Burada, Salmonella'yı hayvansal gıdalarda taramak ve tahmin edilen Salmonella'yı kültür izolasyonundan doğrulamak için hızlı, güvenilir ve sağlam bir yöntem olarak çok laboratuvar onaylı bir Salmonella LAMP protokolü sunuyoruz.

Hayvansal Gıdalarda Salmonella Taramak ve Salmonella'yı Kültür İzolasyonundan Doğrulamak için Döngü Aracılı İzotermal Amplifikasyon

Bu makale, Salmonella tiphimurium triptofan sintazının ekspresyonu ve saflaştırılması için bir dizi ardışık yöntem sunar, bu protokol protein kompleksini bir günde arındırmak için hızlı bir sistemdir. Kapsanan yöntemler escherichia coliprotein ekspresyözü, benzeşim kromatografisi, jel filtrasyon kromatografisi ve kristalizasyondur.

PCR Mutagenezi, Klonlama, İfade, Hızlı Protein Saflaştırma Protokolleri ve Triptofan Synthase'in Vahşi Tipinin ve Mutant Formlarının Kristalizasyonu

Masaüstü cihazları kullanan tüm genom dizileme (WGS) stratejilerinin fizibilitesi, laboratuvar ortamında halk sağlığı ile ilgili her mikrobun genom sorgulamasını basitleştirmiştir. Bakteriyel WGS için iş akışının metodolojik bir uyarlaması tanımlanmıştır ve analiz için bir biyoinformatik boru hattı da sunulmuştur.

Oreochromis spp. Çiftliklerinden Türetilen Patojenik Bir Escherichia coli Suşunun Karakterizasyonu Tüm Genom Dizilimini Kullanarak

Öğrenin, Salmonella enterica serovarlarını hızlıca tanımlamak için çoklu PCR yöntemini. Bu teknik, epidemiyolojik çalışmalarda ve gıda güvenliği izlemede patojen tespitini kolaylaştırır.

Allelotyping belirlenmesi için bir PCR Salmonella enterica Serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg ve Typhimurium

Daha fazla video keşfet