Allelotyping belirlenmesi için bir PCR Salmonella enterica Serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg ve Typhimurium

Aşağıdaki deneyin genel amacı, spesifik salmonella antijen allellerini tanımlamaktır. Bu, söz konusu allellerle ilişkili spesifik sekans farklılıklarını belirlemek için PCR hedeflenerek gerçekleştirilir. Örnek kalıbı; allele özgü primerler ile OH bir ve H iki allel tipleme içeriğini kapsayan bir PCR reaksiyon karışımına eklenir.

PCR'ler termosiklet cihazında çalıştırılır. Ardından, her bir örnek için amplikonun varlığını belirlemek veya onu izole etmek amacıyla PCR örnekleri jel elektroforezi kullanılarak boyutlarına göre ayrılır. Daha sonra amplikon boyutu, kullanılan primer setlerinin her biri için beklenen boyutla ilişkilendirilir ve spesifik salmonella antijeninin tanımlandığını gösteren PCR sonuçları elde edilir.

PCR ile aleller belirlendikten sonra, OH bir ve H iki multiplex PCR analizlerinin sonuçlarına dayanarak SEROVAR tanımlaması yapılır. Bu videoda açıklanan protokolün SYP'ye göre temel avantajı, hızlı, yorumlanması daha kolay ve daha az maliyetli olmasıdır. Bu yöntem, kanatlı veya süt çiftlikleri içindeki veya arasındaki salmonella VAR'larının dağılımını ve kalıcılığını belirlemek gibi epidemiyoloji alanındaki bazı temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin uygulama alanı, salmonella, serovarlar, arius veya urian kaynaklı salmonozisin hızlı teşhisine kadar uzanmaktadır. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi, salmonella türlerini serovar düzeyine kadar tanımlamak için bu PCR tabanlı yöntemin nasıl kullanılacağını anlamak açısından kritiktir. Bu prosedür, sonraki PCR reaksiyonu için tüm hücre DNA şablonunu hazırlamak amacıyla University of Georgia'daki Lee Mauer Laboratuvarları'ndan araştırma bilimcileri Adriana Pedroso ve Yin Chang tarafından gösterilecektir.

Öncelikle, bir mililitre LB besiyerine tek bir koloniden izole edilmiş salmonella inoküle edin. Kültürü, dakikada 200 ila 250 devirde çalkalayarak 37 °C inkübasyon sıcaklığında inkübe edin.

Ertesi gün, bir mililitre kültürü 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve hücreleri çöktürmek için süspansiyonu yaklaşık iki dakika boyunca 4.500 ×g hızında santrifüjleyin; ardından süpernatantı aspire edin ve bakteriyel peleti bir mililitre %100 Ethanol içinde yeniden süspande edin. Etanol süspansiyonundaki hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin ve ardından hücreleri daha önce olduğu gibi santrifüjleyin. Peleti bir mililitre PBS içinde yeniden süspande edin. Santrifüjleme sonrası süpernatantı aspire edin ve peleti bir mililitre steril distile su içinde yeniden süspande edin. Son olarak hücre süspansiyonunu dilüe edin.

Distile su ile 20 kat seyreltin ve PCR hazırlığına hazır olana kadar bir ay boyunca -20 °C'de saklayın. PCR reaksiyon karışımının hazırlanması ve dağıtımı, fiziksel olarak ayrı bir odada ve tercihen UV ışığıyla donatılmış özel bir PCR iş istasyonunda gerçekleştirilmelidir. İlk olarak, çalışma yüzeyini UV ışığıyla ve %10'luk çamaşır suyu ile silerek dekontamine edin. Ardından, yalnızca PCR çalışmaları için ayrılmış ve bariyerli pipet ucu takılmış bir pipet kullanın.

Önce primerleri distile su ile 5x10⁻⁴ M konsantrasyona seyrelterek bir ana primer stok hazırlayın. Ardından, 25 µM çalışma konsantrasyonuna ulaşmak için stoğu distile su ile 1/20 oranında seyreltin. PCR reaktiflerini ve tüm hücre kalıbını dondurucudan çıkarıp buz üzerinde çözdürün.

tac DNA polimerazı gerekene kadar dondurucuda tutun. PCR reaktiflerini yazılı protokolün birinci tablosuna göre birleştirin. Ardından, PCR reaksiyonundan dokuz µL pipetleyin.

Steril 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı polistiren mikrotitrasyon plakasının kuyucuklarına karıştırın. İlk sütunun üstünden başlayarak sütun boyunca aşağıya, ardından bir sonraki sütunun üstüne doğru ilerleyin; negatif kontrol olarak hizmet etmesi için ilk kuyucuğa bir mikrolitre distile su ekleyin. Ardından, ikinci kuyucuktaki PCR karışımına 0.5 mikrolitre pozitif kontrol kalıplarını ve üçüncü kuyucuğa bir mikrolitre e coli K 12 DH five alpha ekleyin.

Üçüncü örnek kalıbından bir µL'yi geri kalan kuyucuklara ekleyeceğiz; H1 ve Gyp PCR için Salmonella enterica, CVaR ve Enteritidis, sırasıyla i ve GM alelleri için pozitif kontroller olarak hizmet edecektir. Salmonella CVaR, Heidelberg ve Haar, sırasıyla r ve z10 alellerini tespit etmek için ikinci H1 alel tipleme PCR'ında kullanılacak pozitif kontrollerdir. Ardından, 10 µL kapasiteli cam kapillerleri Idaho teknolojisi için belirlenmiş tutuculara yerleştirin.

Hızlı döngüleyici tutucuya sabitlendiğinde, kılcal tüplerin uçlarını kuyucukların tabanına değdirerek her bir cam kılcal tüpe PCR reaksiyon karışımını yükleyin. Sıvının tüp boyunca aşağı inmesini sağlamak ve uçlar ile PCR karışımı arasında boşluk oluşturmak için tutucuyu eğik konuma getirin. Kılcal tüplerin her iki ucunu bütan pürmüzü ile ısı mühürlemeden önce, kılcal tüpleri ve tutucuyu Idaho technology hızlı döngüleyicisine yerleştirin ve farklı all ELO tipi PCR'lar için yazılı protokolün birinci tablosunda açıklanan termodöngüleyici programlarını kullanın.

Termosiklatör programı tamamlandığında, standart prosedürlere uygun olarak etidyum bromür içeren, 15 by 10 santimetre boyutlarında, %1,5'lik moleküler biyoloji sınıfı agaroz jel ile jel elektroforezi adımına geçiniz. Jel katılaştıktan sonra, jeli 200 mikrolitre 0,25 miligram/mL önceden karıştırılmış 1x TAE elektroforez tamponu içeren daldırma tipi yatay elektroforez tankına aktarınız.

40 µL altı kat DNA yükleme boyası içeren DNA moleküler ağırlık markerlarından, ilk, orta ve son kuyucuklara 4,8 µL önceden karıştırılmış DNA moleküler ağırlık markerı yükleyin. Ardından, tutucudan içinde PCR örnek reaksiyonu bulunan bir cam kapiler kaldırın ve kapilerin her iki ucunu cam kesici ile çizin. Daha sonra, her iki elinizin baş ve işaret parmağını cam kesici ile işaretlenmiş kapiler uçlarının her iki yanına yerleştirin ve kapileri kırın; kapiler dağıtıcısını PCR reaksiyon karışımının karşı ucuna yerleştirin ve sıvı tüpün en altına gelene kadar pistonu yavaşça saat yönünde çevirin.

Kılcal boruyu doldurulacak kuyucuğun içine yerleştirin ve ağırlıklandırılmış örneği kuyucuğa aktarmak için pistonu yavaşça saat yönünde çevirin. Kılcal boruyla kuyucuğu delmemeye veya sıvının tamamı kılcal borudan çıktıktan sonra pistonu çevirmeye devam ederek kuyucuğa bir hava kabarcığı sokmamaya dikkat edin. Tüm örnekler ve standartlar yüklendikten sonra, güç kaynağının sabit voltajını 90 volt olarak ayarlayın.

Elektroforez tamamlandığında, DNA fragmanlarını ve moleküler ağırlık standartlarını görüntülemek için jeli bir UV transilüminatöre aktarın ve bir gel dock XR sisteminde görüntüleri yakalayın. Son olarak, kapiler tutucuları 15 ila 30 dakika boyunca %10'luk çamaşır suyunda bekletin. Distile su ile üç kez durulayın ve havada kuruması için tekrar PCR hazırlık odasına yerleştirin.

Bu ilk etidyum bromür boyamalı jel, salmonella entera var, enteritis, hadda Heidelberg.Antifa ile ilişkili O aleli için yapılan multipleks PCR sonuçlarını göstermektedir. Birinci ve 13. şeritler 100 baz çiftlik DNA merdiveni içermektedir.

İkinci şerit; B, C bir, C iki, D bir ve E O alelleri için multiplex PCR kontrollerini içerir. Geriye kalan üç ila 12 arasındaki şeritler salmonella izolatlarını içerir. Bir salmonella izolatına, PCR kontrolünün boyutuyla eşleşen amplikon boyutuna ve soldan sağa kullanılan alel prima setleri için öngörülen değere göre bir alel tanımı verilir. Bu amplikon boyutları şöyledir: D 1 620 baz çifti, C iki 400 baz çifti, E 1 280 baz çifti, C 1 340 baz çifti ve B 560 baz çifti.

Bu iridyum bromür boyalı jel, eye ve gm alellerindeki FLA jeli tanımlamak için yapılan H1 aleli multipleks PCR sonuçlarını göstermektedir. Jel, daha önce gösterilen sırayla yüklenmiştir. Tekrar etmek gerekirse, PCR kontrolüyle boyutu eşleşen bir amplikonun varlığına ve soldan sağa kullanılan dört H1 aleli primer seti için öngörüldüğü şekilde, her izolate bir H1 aleli atanmıştır.

Amplikon boyutları GM için 310 baz çifti ve I için 510 baz çiftidir. Bu etidyum bromür boyalı jel, gellin r ve z 10 alellerini tanımlamak için yapılan H bir aleli multiplex PCR sonuçlarını göstermektedir. Jel, daha önce gösterildiği şekilde doldurulmuş olup, PCR kontrolüyle boyutu eşleşen bir amplikonun varlığına ve kullanılan dört H bir aleli primer seti için öngörüldüğü üzere, her bir izolata bir H bir aleli atanmıştır; amplikon boyutları R için 170 baz çifti ve Z on için üç yüz altmış baz çiftidir.

Bu teknik, uygun şekilde uygulandığında dört saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, PCR taşıma kontaminasyonu riskini en aza indirmek için kalıp hazırlama, PCR kurulumu ve jel elektroforez işlemlerini fiziksel olarak birbirinden ayırmayı unutmayın.