FM Boyalar Kültür Serebellar Granül Nöronlar Synaptic veziküllü Havuzu Yenileme Kantitatif Analiz

Aşağıdaki deneyin genel amacı, canlı floresan görüntüleme tekniklerini kullanarak merkezi sinir terminallerindeki spesifik sinaptik vezikül havuzlarının yenilenmesini ve mobilizasyonunu nicel olarak belirlemektir. Bu işlem, geçerli dahili kontroller sağlamak amacıyla aynı sinir terminallerinde FM boyaları kullanılarak, iki tur sinaptik vezikül geri dönüşümünün izlenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, göreceli havuz boyutlarının belirlenmesine olanak tanıyan spesifik boşaltma protokolleri kullanılarak, hızla salınabilir havuz ve rezerv havuz sırasıyla tüketilir.

Ardından, seçilen varyasyonun sinaptik vezikül, havuz yenilenmesi veya mobilizasyon üzerindeki etkisini incelemek için yükleme veya boşaltma koşullarını değiştirin. Sonuçlar, uyarılmış boya boşaltımının kantifikasyonu ve analizine dayanarak, farklı sinaptik fiziksel havuzların FM d yüklemesinin tekrarlanabilir olduğunu göstermektedir. Bu tekniğin, fluent ailesi gibi genetik raporlayıcılar gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, havuzların özellikle endositoza uğramış sinaptik veziküller tarafından yenilenmesini izleyebilmesidir.

Ayrıca doğru kantifikasyona olanak tanır. Bu protokol aynı sinir terminallerinde iki kez uygulandığından bir iç kontrol sağlar. Bu yöntem; belirli endositoz modlarındaki manipülasyonların, hem toplam geri dönüşüm havuzunun hem de bunun içindeki hazır kullanılabilir havuz ve rezerv havuz gibi sinaptik CLE havuzlarının yenilenmesini nasıl etkileyebileceği gibi, sinaptik, CLE, endositoz ve ekzositoz alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Temel deneysel düzenek; ters epi floresan mikroskobu, soğutmalı bir CCD kamera, floresan ışık kaynağı, bir yerçekimi perfüzyon düzeneği, paralel platin elektrotlara ve elektriksel stimülatöre sahip bir görüntüleme odası ve bir bilgisayardan oluşmalıdır. FM boyasının ağarmasını önlemek için deneyleri karanlıkta veya numunenin minimum floresan aydınlatmaya maruz kaldığı kırmızı ışık koşulları altında gerçekleştirin. Serebellar granüler nöronların primer kültürlerini hazırlamak için yedi günlük Sprague Dawley sıçan yavrularını kullanarak bu prosedüre başlayın.

Kültürler hazırlandıktan sonra, nöronları poly D lysine kaplı 25 mm'lik bir lamelin merkezine, bir saat sonra çapı yedi mm'yi geçmeyecek bir damlacık halinde ekleyin; yedi gün sonra nöronlara iki mL kültür medyumu ekleyin. Yeni medyuma stabilizasyonu sağlamak için tek bir lameli oda sıcaklığındaki salin çözeltisinde 10 dakika bekletin. Ardından, lameli çıkarıp alt kısmını ve yapışık hücrelerin etrafındaki bölgeyi küçük bir kağıt havlu veya emici kağıt parçasıyla kurulayın.

Ardından, lamelin görüntüleme odasının altına yapıştırılması için silikon gres kullanın. Hücreler iki paralel tel arasında olmalıdır. Banyo odasının merkezine taşmadan, odayı tamamen sızdırmaz hale getirmek için yeterli miktarda silikon gres kullanın.

Ardından, banyo haznesini yaklaşık 260 µL salin çözeltisi ile nazikçe doldurun. Daha sonra giriş ve çıkış tüplerini aynı çözelti ile doldurun. Temiz bir lamel camı silikon gresi ile üst kısma yapıştırarak hazneyi mühürleyin.

Bundan sonra, giriş ve çıkış tüpleri yardımıyla hazne içinde hapsolmuş tüm hava kabarcıklarını giderin. Ardından, görüntüleme haznesini paslanmaz çelik bir platforma sabitleyin. Giriş tüpünden nazikçe salin solüsyonu akıtarak sızıntı olup olmadığını kontrol edin.

Bir sonraki adım, monte edilen hazneyi ters mikroskobun tablasına yerleştirmektir. Yerçekimiyle perfüzyon sisteminin girişini salin çözeltisi ile doldurun ve hazneyi girişe bağlayın. Ardından, haznenin bağlantı tellerini elektrik stimülatörüne bağlayın.

Nöronları 1,5 mililitre seyreltilmiş fm boyası ile perfüze edin. Ardından, boya alımını uyarmak için ekli stimülatörü kullanarak nöronları stimüle edin. Stimülasyondan sonra, fazla FM boyasını uzaklaştırmak için nöronları iki dakika boyunca taze salin çözeltisi ile perfüze edin. Sonrasında nöronları sekiz dakika boyunca salin çözeltisi içinde bekletin.

Bu sırada, tekil FM D yüklü sinir terminallerinin görünür olduğu aksonal ağları belirleyin. Floresein dalga boylarını kullanın. Hücre kümelerinin bulunduğu alanlardan kaçının.

Dinlenme süresi boyunca hafif bir kayma meydana gelmiş olabileceğinden, görüntü alımı hemen öncesinde görüntüyü yeniden odaklayın. Her dört saniyede bir kare olacak şekilde zaman ayarlı (time-lapse) görüntü alımına başlayın. Beş ila 10 bazal görüntü elde ettikten sonra, iki saniye boyunca 30 hertz uyarım uygulayarak hızla salınabilir havuzun ekzositozunu tetikleyin.

10 görüntü daha elde ettikten sonra, stimülasyonlar arasında 40 saniyelik aralıklarla, 10 saniye boyunca 40 hertz frekansında üç stimülasyon uygulayarak rezerv havuzunun sinaptik vezikül eksositozunu tetikleyin ve beş ila 10 görüntü daha alın. Ardından görüntü alımını durdurun. Nöronların en az 20 dakika boyunca toparlanmasına izin verin ve kontrol deneyi için bu S bir evre protokolünü S iki evrede tekrar uygulayın.

Veri analizi için görüntüleri bir yığına (stack) dönüştürün. Ardından, ImageJ yerleşik fonksiyonunu kullanarak, eğer belirgin bir yatay kayma meydana gelmişse dinamik aralığı maksimize etmek için yığının parlaklığını ve kontrastını ayarlayın. Deney sırasında, görüntü yığınını hizalamak için ImageJ üzerinde stack reg ve turbo reg eklentilerini çalıştırın.

Ardından runtime serisi analizör eklentisini çalıştırın. Sonra, en az 90 sinir terminali üzerinde ilgi bölgelerini tanımlayın. Aktif sinir terminallerini ortaya çıkarmak için boya boşaltımı öncesi ve sonrası görüntüler arasında geçiş yapmak faydalıdır.

İdeal bir ilgi alanı boyutu, tipik bir sinir terminalinden biraz daha büyük olan boyuttur. Ardından, her bir ilgi alanının zaman içindeki toplam floresan yoğunluğunu elde edin. Sonrasında, verileri Microsoft Excel'e aktarın.

Burada, serebellar granül nöronların 80 hertz 10 saniye stimülasyonu kullanılarak 10 micromolar FM 1 43 ile yüklendiği bir kontrol deneyinin akış şeması gösterilmektedir. Burada, FM 1 43 ile yüklenmiş sinir terminallerini gösteren bir görüntü yer almaktadır. Burada, aktif sinir terminallerinin belirlenmesinin ardından analiz için seçilen 90 numaralı ilgi bölgesini gösteren aynı görüntü ve seçilen zaman noktalarındaki sinir terminallerinin görüntüleri bulunmaktadır.

Bu görüntüler, farklı sinaptik vezikül havuzları tükendikçe floresan düzeyindeki değişimleri göstermek için psödo renklerle sunulmuştur. Son olarak, burada bu 90 sinir terminalinin normalize edilmiş floresan birimleri gösterilmiştir. S bir ve S iki fazlarında, her ardışık stimülasyondaki floresan düşüşü ölçülebilir ve S bir ile S iki fazları arasında karşılaştırılabilir.

Bu kontrol deneyinde, hem S one hem de S two, kolayca salınabilen ve rezerv havuzlarında aynı boyutlarla sonuçlanmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, canlı floresan görüntüleme tekniklerini kullanarak merkezi sinir terminallerindeki spesifik sinaptik vezikül havuzlarının yenilenmesini ve mobilizasyonunu nasıl nicelleştireceğiniz konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürü uygularken, S two deneysel koşullarını değiştirmeden önce S one kontrol deneylerini gerçekleştirerek hücre canlılığını ve yanıt verme kapasitesini doğrulamayı hatırlamak önemlidir.