İnsülin ifade Koloni oluşturan atalarıdır için Kantitatif Testi

Bu video, pankreas benzeri progenitörlerin insülin eksprese eden kolonilere farklılaşmasını sağlayan üç boyutlu kültürler oluşturma prosedürünü göstermektedir. İlk olarak, neurogen in three EGFP Knockin fare embriyonik kök hücre hattından türetilen farklılaşmış hücreler disosiye edilir ve endokrin benzeri progenitörleri zenginleştirmek amacıyla EGFP ekspresyonuna göre sıralanır. EGFP pozitif sıralanmış tek hücreler, matrigel ve büyüme faktörleri içeren yarı katı bir ortama ekilir.

Bu durum, tekil progenitör hücrelerin hareketini kısıtlarken in vitro ortamda hayatta kalmalarına, proliferasyonlarına ve farklılaşmalarına olanak tanır. Ardından, belirli bir ayrıştırılmış popülasyondaki koloni oluşturucu progenitörlerin frekansını hesaplamak amacıyla, karakteristik morfolojiye sahip oluşan kolonilerin sayısı bir mikroskop altında belirlenir ve skorlanır. Tekil kolonilerin gerçek zamanlı PCR ve immünofloresan mikroskopi ile analizi, ngn three pozitif hücrelerden türeyen kolonilerde insülin ekspresyonu olduğunu, ancak NGN three negatif hücrelerden türeyenlerde olmadığını ortaya koymaktadır.

Süspansiyon kültüründeki pankreatik küreler gibi mevcut tekniklere kıyasla bu tekniği kullanmanın temel avantajı, daha fazla sayıda hücrenin içsel progenitor koloni oluşturma yeteneği açısından aynı anda incelenmesine olanak tanımasıdır. Bu yöntem, progenitor hücrelerin hangi belirteçleri eksprese ettiği ve bu hücrelerin idamesi, kendi kendini yenilemesi ve farklılaşması için hangi içsel veya dışsal faktörlerin önemli olduğu gibi pankreatik kök ve progenitor hücrelerin biyolojisine ilişkin soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin etkileri tip 1 diyabet tedavisine kadar uzanabilir; çünkü pankreatik progenitor hücreler tanımlanabilir ve beta benzeri hücrelere doğru farklılaştırılabilirse, bu hücreler son evre tip 1 diyabetli hastalarda hasarlı beta hücrelerini değiştirmek için kullanılabilir.

Bu yöntem ayrıca koloni çalışmalarına; postnatal ve yetişkin pankreasın, kemik iliğinin, karaciğerin ve dalağın progenitor hücre oluşumlarını incelemek gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Genel olarak, bu tekniği yeni öğrenen kişiler, hücreleri tek hücre süspansiyonuna ayrıştırma ve dağıtım hazırlığı aşamasında matrigel ile metilselülozu yönetme süreçlerinin zorluğu nedeniyle güçlük çekebilirler. Bu yöntem fikri ilk olarak, pankreastaki progenitor hücreler ile onların farklılaşmış soyundan gelen hücreleri arasındaki soy hattı ilişkisini ele alan herhangi bir klonojenik analiz yönteminin olmadığını fark ettiğimde ortaya çıktı.

Bu tür bir koloni deneyi, geçmişte hematopoetik kök hücrelerin ve progenitör hücrelerin incelenmesinde etkili olmuştur. Pankreatik kök hücre biyolojisini incelemek için de böyle bir deneye ihtiyaç olduğunu fark ettim. Yarı katı ortam bileşeni doğası gereği viskoz olduğu, hazırlama ve dağıtma basamaklarını öğrenmek zor olduğu için bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşımaktadır.

Prosedürler; yüksek lisans öğrencisi Bay Michael Winkler, teknisyen Bayan Nancy ve daha sonra gerçekleştirilecek koloni deneyi için kondisyonlu ortam üretimi yapacak bir laboratuvardan doktora sonrası araştırmacı Dr. Lang Jing tarafından gösterilecektir. Nöron ES hücreleri in vitro ortamda pankreas benzeri hücrelere farklılaştırılır. Bu prosedüre, altı günlük embriyo gövdelerini bir ışık mikroskobu altında inceleyerek başlayın.

Bunların en az %30 ila %40'ının çapları en az 150 mikron olmalıdır. Daha büyük embriyo gövdesi, gelişmiş farklılaşmaya işaret eden koyu lekeler içermelidir. Altı kuyucuklu bir yapışma plakasının her bir kuyucuğuna 80 ila 100 embriyo gövdesi aktarın, ardından hücreden hücreye temasları artırmak için embriyo gövdelerini kuyucukların merkezlerinde toplamak amacıyla plakayı nazikçe sallayın.

Bu temaslar, embriyo gövdelerinden pankreas benzeri hücrelerin daha iyi gelişmesini sağlar. Plakaları nazikçe 37 °C ve %5 karbondioksit içeren kültür inkübatörüne geri yerleştirin. A 13.

Endokrin hücre farklılaşmasını indüklemek için, ortamı nikotinamid ve insan rekombinant aktif β-cellulin içeren taze tutunma kültür ortamı ile değiştirin. Ardından kültürleri inkübatöre geri yerleştirin. 16. günde, ortamı toplayın ve hücre kalıntılarından arındırmak için 0,2 mikronluk bir polietersülfon membran üzerinden filtreleyin.

Bu noktadan itibaren, toplanan besiyerine kondisyonlu besiyeri denilecektir. Kondisyonlu besiyerini 15 mililitrelik konik polipropilen tüplere paylaştırın ve kullanımdan hemen öncesine kadar -80 °C'de saklayın. Neurogenin 3, gelişim sırasında pankreatik endokrin progenitörleri tarafından eksprese edilen bir transkripsiyon faktörüdür. Neurogenin 3 eksprese eden endokrin öncüller nihayetinde pankreatik alfa, beta, delta, epsilon ve pankreatik polipeptid eksprese eden hücrelere farklılaşır. NGN3 eksprese eden hücrelerin tanımlanmasını kolaylaştırmak için, bir knock-in fare ES hücre hattındaki NGN3 lokusunun bir alleli EGFP reporter geni ile değiştirilmiştir. Elde edilen hücre hattı NGN3 EGFP olarak adlandırılmıştır. Farklılaşmış NGN3 EGFP pozitif ve NGN3 EGFP negatif hücreler elde etmek için.

Hücreler, tek hücre süspansiyonu elde etmek için 16. günde kültür plaklarından önce tripsin ile ayrılır. Hücre kümeleri kollajenaz B ve DNase ile inkübe edilir ve 40 veya 70 mikronluk bir süzgeçten geçirilir. Ardından DPI eklenir ve sırasıyla hücre boyutu ve granülerliğin göstergesi olan ileri saçılma ve yan saçılmaya göre hücreleri ayırmak için bir hücre ayırıcı ile sıralama yapılır.

Ardından, hücresel olmayan debrisleri elemek için bir kapı (gate) çizilir. Ölü hücreleri ayırt etmek için, pozitif boyanacak olan DPI kullanılır. 405 ila 413 nanometrede uyarılıp emisyon 454 40 filtresi ile tespit edildiğinde, puls genişliği kapılaması (gating of pulse width), elektronik ileri saçılım (forward scatter) pulsunun genişliği doubletleri ortaya çıkarır; bunlar, floresanla aktive edilmiş hücre ayıklayıcıdan (fluorescence activated cell sorter) geçirilmeden önce elenmelidir; EGFP kanalı FL 1'e karşı otofloresan kapılaması yapılır.

Sol panelde gösterilen TL gibi kontrol bir ebeveyn hücre hattından alınan 16. gün hücrelerinin kullanılması gerçek floresan ışımayı belirginleştirir ve böylece sağ panelde görüldüğü gibi NGN three EEG FP pozitif hücre popülasyonu görselleştirilebilir. NGN three EGFP pozitif hücrelerin ayırma kapısı, ayıklama sırasında NGN three EEG FP negatif hücrelerin kontaminasyonunu sınırlamak amacıyla, burada ok ile belirtildiği gibi bilinçli olarak sağa kaydırılır. Kapılar belirlendikten sonra, NGN three EEG, FP pozitif ve NGN three EGFP negatif hücreler ayıklanır ve ekime hazırlık aşamasında kullanılana kadar buz üzerinde saklanır.

Matrigel'i deneyden önceki gece dört derece santigrat sıcaklıkta buz üzerinde bekletin. Deney günü ise şu reaktifleri veya çözeltileri buz üzerinde hazırlayın: D-M-E-M-F 12, metil selüloz, kondisyonlu ortam, FCS, nikotinamid XTEND 4, VEGF A ve rekombinant insan aktif TGF-beta 1. Kullanımdan en az yarım saat önce, 200 mikrolitrelik pipet uçlarının bulunduğu steril bir kutuyu eksi 20 derece santigrat sıcaklığa yerleştirin. Sort edilmiş hücreleri ekime hazırlamak için, önce yarı katı ortam bileşenleri beş mililitrelik polistiren bir tüpe eklenmelidir. İlk olarak, bir şırıngaya az miktarda %3,3'lük metil selüloz çözeltisi çekmek için 16,5 gauge iğne kullanın.

Ardından, havayı tahliye etmek için çözeltiyi hemen dışarı itin. Bu işlem, şırıngadaki ölü boşluğu çözeltiyle dolduracak ve yarı katı çözeltinin hacminin doğru şekilde ölçülmesini kolaylaştıracaktır. Sonrasında, hava kabarcığı oluşumundan kaçınarak, hedeflenen miktardaki metil selüloz çözeltisini çekin ve beş mililitrelik bir tüpe aktarın.

Kondisyonlu medyum, FCS, nikotinamid, aktif beta-FGF, VEGF A ve D-M-E-M-F 12 ekleyin. Ardından, matrijeli eklemek için soğuk pipet uçlarını kullanın. Son olarak, sıralanmış hücrelerin istenen miktarını beş mililitrelik tüpe ekleyin.

Hücrelerin erken stimülasyonunu önlemek için hücreleri her zaman en son ekleyin. Ardından tüpün kapağını sıkıca kapatın ve tüpleri elinizle kuvvetli ve kapsamlı bir şekilde çalkalayın. Çalkalama işlemi hava kabarcıkları oluşturduğundan, tüpleri beş dakika boyunca veya küçük hava kabarcıkları yüzeye çıkana kadar buz üzerinde bekletin.

18,5 gauge iğneye sahip bir mililitrelik bir şırınga kullanarak yarı katı besiyeri hücre karışımından küçük bir miktar çekin ve şırıngadaki havayı hemen tahliye edin. Ardından, yarı katı hücre karışımının 500 µL'sini 24 kuyucuklu düşük tutunumlu bir plakanın her bir kuyucuğunun merkezine yavaşça dağıtın. Her örnek dörtlü tekrarlar şeklinde ekilmeli; yatay yönlendirilmiş 24 kuyucuklu plakanın yalnızca en içteki dört sütunu kültür için kullanılmalıdır.

Hücre içeren kültürün nemlendirilmesine yardımcı olmak için kalan kuyucukları steril su ile doldurun. Ekimden hemen sonra hücreleri ışık mikroskobu altında inceleyin.

Tek hücreler kuyucuklara rastgele ve eşit şekilde dağıtılır. Hücreleri 37 °C sıcaklıkta ve %5 karbondioksit içeren havada sekiz ila 12 gün boyunca inkübe edin. Sekiz ila 12 günlük inkübasyonun ardından hücreleri mikroskop altında tekrar gözlemleyin.

Bu, kültürde eşit şekilde dağıtılmış matrigel için iyi bir örnektir. Burada, Apache çerçevesine yol açan düzensiz dağılmış matrigel örneği verilmiştir. Matrigelin bulunmadığı yerlerde koloniler büyümez.

Bu, yarı katı besiyeri karışımına matri gel eklenmemiş bir kuyucuğun arka plan örneğidir. Oluşan kolonileri saymak için plakanın altına bir ızgara yerleştirin. Ardından, 10x objektif lens kullanarak kolonileri gözlemleyin ve sayın; besiyerinin üç boyutlu yapısı nedeniyle koloniler farklı odak noktalarında görünecektir.

Bu nedenle, ışık mikroskopu ile gözlem sırasında her koloni için odak ayarının yapılması gerekebilir; yarı katı kültürdeki insülin eksprese eden kolonilerin sekiz ila 12 gün sonraki temsili fotomikrografları burada gösterilmiştir, oklarla belirtilen koloniler rastgele dağılmıştır ve yaklaşık 60 ila 100 mikron çapında, küçük, koyu renkli, ışığı yansıtmayan kümeler şeklinde görünmektedir. Tek tek elle seçilen kolonilerin ardından yapılan mikroakışkan R-T-P-C-R analizi, önceki raporumuzla tutarlı olarak insülin iki ve glukagon ekspresyonunu ortaya çıkarmıştır. Bu sonuçlar, tekil NGN three EGFP pozitif hücrelerin, primitif birinci dalga benzeri endokrin hücreleri andıran ve aynı anda iki adacık hormonu içeren kolonilere farklılaşma yeteneğini göstermektedir; de novo insülin üretimi için bir belirteç olan eptide protein ekspresyonu, tüm tutam floresan boyama kullanılarak doğrulanmıştır.

Özetle, insülin eksprese eden koloni oluşturan birimler deneyi bu raporda gösterildiği şekilde gerçekleştirildiğinde, koloni oluşturma kapasitesine sahip bireysel progenitörlerin sayısı kolayca belirlenebilir; burada ve önceki raporumuzda gösterildiği üzere, insülin eksprese eden koloni oluşturan birimler, in vitro olarak fare ES hücrelerinden türetilen NGN EGFP pozitif ancak ngn three EEG FP negatif hücrelerin ayıklanmasıyla zenginleştirilebilir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik bir ila üç saat içinde tamamlanabilir. Ayıklama sonrası, bu prosedür uygulanırken hücrelerin tamamen tek hücre süspansiyonuna ayrıştırıldığından emin olmak, matrigel'in katılaşmasını önlemek için tüm kültür bileşenlerini buz üzerinde tutmak ve hücrelerin erken stimülasyonunu önlemek için hücreleri tüplere en son eklemek önemlidir. Bu prosedürün ardından, tek bir hücrenin koloni oluşumunu başlatmak için yeterli olup olmadığı gibi ek soruları yanıtlamak için tek hücre manipülasyonu gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Bu teknik, pankreatik kök hücre ve projenik hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların önünü açacaktır. Araştırmacıların, self-renewal (kendi kendini yenileme) kapasitesini ve beta benzeri hücrelere farklılaşma yeteneğini incelemelerine olanak tanır. Bu videoyu izledikten sonra, insülin eksprese eden koloni oluşturucu progenitörler için kantitatif koloni analizinin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.