Name: İnsülin ifade Koloni oluşturan atalarıdır için Kantitatif Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 39 s
Description: Öğrenin, pankreas benzeri öncü hücrelerin insülin ifade eden kolonilere farklılaşmasını sağlayan üç boyutlu klonojenik analiz yöntemini. Bu teknik, diyabet tedavisi araştırmaları için değerli bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Dr Klaus Kaestner Ngn3-EGFP fare embriyonik kök hücre hattı, Bayan Lucy Brown ve hücre sıralama yardım için Analitik Sitometri Core hediye için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, MW ve LS verilen eğitim hibeleri HTK için verilen NIH hibe R21DK069997 ve R01DK081587 ve Rejeneratif Tıp (CIRM) için California Institute of kısmen finanse edildi

<ol><li>Ku, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Committing+embryonic+stem+cells+to+early+endocrine+pancreas+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Committing embryonic stem cells to early endocrine pancreas in vitro.</a> Stem cells. 22, 1205-1217 (2004).</li>
<li>Ku, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-expressing+colonies+developed+from+murine+embryonic+stem+cell-derived+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Insulin-expressing colonies developed from murine embryonic stem cell-derived progenitors.</a> Diabetes. 56, 921-929 (2007).</li>
<li>Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+in+vitro+differentiation+assay+for+pancreatic-like+cell+development+from+murine+embryonic+stem+cells%3A+detailed+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Assay.+Drug.+Dev.+Technol%22%5BJournal%5D)">Characterization of an in vitro differentiation assay for pancreatic-like cell development from murine embryonic stem cells: detailed gene expression analysis.</a> Assay. Drug. Dev. Technol. 9, 403-419 (2011).</li>
<li>Lee, C. S., Perreault, N., Brestelli, J. E., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenin+3+is+essential+for+the+proper+specification+of+gastric+enteroendocrine+cells+and+the+maintenance+of+gastric+epithelial+cell+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Neurogenin 3 is essential for the proper specification of gastric enteroendocrine cells and the maintenance of gastric epithelial cell identity.</a> Genes. 16, 1488-1497 (2002).</li>
<li>Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+the+pancreatic+lineage%3A+NGN3%2B+cells+are+islet+progenitors+and+are+distinct+from+duct+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors.</a> Development. 129, 2447-2457 (2002).</li>
<li>Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+proliferation+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells.</a> Blood. 81, 2844-2853 (1993).</li>
<li>Gittes, G. K., Galante, P. E., Hanahan, D., Rutter, W. J., Debase, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage-specific+morphogenesis+in+the+developing+pancreas%3A+role+of+mesenchymal+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Lineage-specific morphogenesis in the developing pancreas: role of mesenchymal factors.</a> Development. 122, 439-447 (1996).</li>
<li>Miralles, F., Battelino, T., Czernichow, P., Scharfmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+plays+a+key+role+in+morphogenesis+of+the+pancreatic+islets+of+Langerhans+by+controlling+the+activity+of+the+matrix+metalloproteinase+MMP-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">TGF-beta plays a key role in morphogenesis of the pancreatic islets of Langerhans by controlling the activity of the matrix metalloproteinase MMP-2.</a> J. Cell. Biol. 143, 827-836 (1998).</li>
<li>Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cultivation+of+human+islets+from+expanded+ductal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">In vitro cultivation of human islets from expanded ductal tissue.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 7999-8004 (2000).</li>
<li>Gao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+endocrine+progenitor+cells+and+critical+factors+for+their+differentiation+in+human+adult+pancreatic+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Characterization of endocrine progenitor cells and critical factors for their differentiation in human adult pancreatic cell culture.</a> Diabetes. 52, 2007-2015 (2003).</li>
<li>Gao, R., Ustinov, J., Korsgren, O., Otonkoski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+neogenesis+of+human+islets+reflects+the+plasticity+of+differentiated+human+pancreatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">In vitro neogenesis of human islets reflects the plasticity of differentiated human pancreatic cells.</a> Diabetologia. 48, 2296-2304 (2005).</li>
<li>Suarez-Pinzon, W. L., Lakey, J. R., Brand, S. J., Rabinovitch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+therapy+with+epidermal+growth+factor+and+gastrin+induces+neogenesis+of+human+islet+beta-cells+from+pancreatic+duct+cells+and+an+increase+in+functional+beta-cell+mass%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Combination therapy with epidermal growth factor and gastrin induces neogenesis of human islet beta-cells from pancreatic duct cells and an increase in functional beta-cell mass.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 90, 3401-3409 (2005).</li>
<li>Hao, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-cell+differentiation+from+nonendocrine+epithelial+cells+of+the+adult+human+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Beta-cell differentiation from nonendocrine epithelial cells of the adult human pancreas.</a> Nature Medicine. 12, 310-316 (2006).</li>
<li>Ku, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minireview%3A+pancreatic+progenitor+cells--recent+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Minireview: pancreatic progenitor cells--recent studies.</a> Endocrinology. 149, 4312-4316 (2008).</li>
<li>Seaberg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+identification+of+multipotent+precursors+from+adult+mouse+pancreas+that+generate+neural+and+pancreatic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages.</a> Nature Biotechnology. 22, 1115-1124 (2004).</li>
<li>Rovira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+centroacinar%2Fterminal+ductal+progenitor+cells+in+adult+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of centroacinar/terminal ductal progenitor cells in adult mouse pancreas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 75-80 (2010).</li>
</ol>

Biz ifşa etmek başka bir şey var.

Bireysel pankreas atalarıdır kantitatif ve fonksiyonel değerlendirmeler izin Colony deneyleri pankreas kök ve progenitör hücre biyolojisi çalışmalarında ilerleme büyük ölçüde engellendiği, şimdiye kadar sınırlı kalmıştır. Bir koloni testinin özünü progenitör hücrelerin işlevselliğini ve soy potansiyelleri uyulması gereken izin, progenitör hücrelerin içsel yeteneği değil, sadece kendi fenotip ölçen. Aynı zamanda, belirli bir nüfus progenitörlerin sayısını belirlemek nicel bir araçtır. Hematopoetik kök hücre alanında, koloni deneyleri tanımlanmasında önemli rol oynadı, hem de bu hücrelerin köken taahhüt düzenleyen büyüme faktörü gereksinimleri, etkileşimleri, ve mekanizmaları deşifre var. 6 pankreas progenitör hücre biyolojisi, pankreas organı 7 alanında 8 veya toplu kültürleri 9-13 icat edilmiştir, ancak, bu tür testlerin biyolojik soru adresi yoktek hücre düzeyinde eklentileri. Tek hücre analizi olmadan, çok potansiyel pankreas kök / progenitörlerin varlığı su götürmez bir şekilde kanıtlanmıştır. 14 Burada olduğunu göstermektedir insülin ifade koloni oluşturan atalarıdır üç boyutlu Matrigel içeren, yarı katı kültür sistemi kullanılarak test edilmelidir. Bir süspansiyon kültürü sistemi 15,16 çoğalmalı ve &quot;pancreatospheres&quot; içine ayırt etmek için tek yetişkin pankreas atalarıdır izin geliştirilmiş olmasına rağmen, koloni tahlil ek avantajlar sağlar. İlk olarak, yarı-katı kültür medya sistemi, 24-de başına 500 mcL kültür ortamı başına 25.000 sıralanmış hücreler kadar kaplama lineer aralıkta meydana gelen koloni oluşumu korurken, 2 aksine, süspansiyon pancreatosphere testi tek kullanımını gerektirir sağlar hücre sıralayıcı hücre birikimi yöntemi tek bir hücre analizleri, izin ve böylece kültür ortamı ve inkübatör alanı daha büyük bir hacimgereklidir. Bu nedenle, bizim koloni tahlil progenitör faaliyetleri için aynı anda çok sayıda farklı hücreler karşılaştırıldığında gerekir yapmak için nispeten kolay ve uygun maliyetli. İkincisi, bizim yarı-katı medya ekstraselüler matriks bileşenleri ve büyüme faktörleri, hem proliferasyonu ve farklılaşması, aynı kuyuda meydana sağlar tekdüze dağılım sağlar. Aksine, hücre süspansiyon kültürü böyle bir ortamda, özellikle de matris sağlamak için daha zordur. Biz iki atalarıdır rastgele birbirlerine ve bir koloni yakın konumlandırılmış olabilir yöntemi ile kesin olarak, her koloninin tek bir hücrenin türetilmiş olduğunu ispat edilemez olduğunu farkındayız. Ancak bu sorun, tek bir hücre manipülasyonu kullanarak ikincil analizi ile üstesinden gelinebilir. Kesin sıralaması tek hücreleri doğrudan el toplama Her koloninin tek bir hücre kökenli göstermelidir. Özet olarak, koloni oluşturan yanlısı aktivite insülin ifadeyarı-katı medya genitors burada açıklanan tek hücre düzeyinde pankreas atalarıdır mekanik çalışmalar için eşsiz fırsatlar sağlar. Örneğin, bir önceki raporda, medya kültürü içine insülin ifade ekstraselüler matriks düşündüren Ngn3-EGFP + hücreler, 2 koloniler oluşumu için gerekli olan Matrigel bu ek, ekstrasellüler matriks proteinleri ham karışımı bulundu . bu atalarıdır için önemlidir. Bu koloni testi kullanılarak, şimdi daha da inceleyecek ve bu tür faaliyet için özel matriks gereksinimleri tanımlamak mümkün olacaktır. Fare embriyonik kök hücrelerinden elde edilen atalarıdır eğitimi için ek olarak, şu anda bu in vitro test sisteminde ayrıca diğer ayırt edici perinatal ve yetişkin farelerin pankreas ve karaciğer türetilmiş koloniler yanı sıra yoksun insan kadavra pankreas dokusundan oluşumu desteği olup olmadığını araştırıyoruz adacık.

<table border="1"><tbody><tr><td> Malzeme / reaktif </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numara </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> 1X DMEM / F-12 (1:1) </td><td> Mediatech </td><td> 15-090-CV </td><td></td></tr><tr><td> Fetal buzağı serumu </td><td> Doku Kültürü Biyolojik </td><td> 201 </td><td> Bölümüne bakın 1,1 </td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Gibco </td><td> 25030-081 </td><td></td></tr><tr><td> 1X Dulbecco&#39;nun Kullanıcı PBS </td><td> Mediatech </td><td> 21-031-CV </td><td></td></tr><tr><td> Sığır Serum Albümin </td><td> Sigma </td><td> A8412 </td><td> % 7.5 </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> Becton Dickinson </td><td> 356231 </td><td> Azaltılmış Büyüme Faktör </td></tr><tr><td> Metilselüloz </td><td> Sinetsu Kimya, Tokyo, Japonya </td><td></td><td> 1.500 Santipuaz (Yüksek-viscosity) </td></tr><tr><td> Nikotinamid </td><td> Sigma </td><td> N0636 </td><td></td></tr><tr><td> Insan Rekombinant Aktivin βB </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 659-AB-025 </td><td></td></tr><tr><td> Eksendin-4 </td><td> Sigma </td><td> E7144 </td><td></td></tr><tr><td> Insan Rekombinant VEGF-A </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 293-VE-010 </td><td></td></tr><tr><td> 24 kuyucuğu </td><td> Costar </td><td> 3473 </td><td> Ultra-düşük Eklenti </td></tr><tr><td> 60mm Petri Dish Izgara ile </td><td> Nunc </td><td> 169558 </td><td></td></tr></tbody></table>

İnsülin ifade koloni oluşturan atalarıdır için kantitatif testi

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

Pankreas kök ve progenitör hücre biyolojisi alanında eksikliği, tek bir hücrenin analizi için izin in vitro fonksiyonel ve kantitatif tayinlerde bir engel olmuştur . Su götürmez bir şekilde bireysel progenitörlerin soy potansiyelini göstermek için kesin yollar sağlar, çünkü tek atalarıdır analizi, kritik öneme sahip. Yöntemleri, tek hücre süspansiyon kültüründe &quot;pancreatospheres&quot; oluşturmak için icat edilmiş olmasına rağmen, bazı sınırlamalar mevcuttur. İlk olarak, tek bir hücrenin çok sayıda hücre birikimi, kültür ortamı ve uzay geniş hacimli, dönüş komutları. Gerçekleştirmek için zaman alıcıdır İkincisi, ortaya çıkan pancreatospheres sayılandırma pancreatosphere başlatan atalarıdır sıklığının düşük olduğunu, özellikle emek-yoğun. Üçüncü olarak, pancreatosphere tahlil yeniden, aynı kültürün yayılması ve pankreas atalarıdır farklılaşma hem de izin için etkili bir yöntem değildirtestin yararlılığı stricting. Bu sınırlamaları aşmak için, pankreas atalarıdır için yarı-katı medya tabanlı koloni tahlil geliştirilmiştir ve bu raporda sunulmuştur. Bu yöntem, farklılaşma yaygınlaşması ve ayrıca tabi olarak progenitör hücreleri üç boyutlu uzayda kalmak için izin metilselüloz medya viskozite sağlamak için kullanıldığı hematopoetik koloni tahlil, mevcut bir kavram yararlanır. Zenginleştirmek için insülin ifade eden heterojen bir nüfus atalarıdır koloni oluşturan hücreleri kullanılan ifade neurogenin (NGN) 3, pankreatik endokrin progenitör hücre belirteci. Murin embriyonik kök (ES), gelişmiş yeşil flüoresan protein muhabiri ile etiketlenmiş Ngn3 ifade hücreleri sıralanır ve başına kadar çok 25.000 hücreleri düşük eki, 24-kuyu kültür kaplarına içine kaplama hücre kökenli. Aşağıdaki ana bileşenleri ile yarı-katı medya her yer 500 mcL: tanıştımhylcellulose, Matrigel, nikotinamid, eksendin-4, aktivin βB ve klimalı medya fare ES hücre kökenli pankreas gibi hücreler toplanır. 8 ila 12 gün sonra kültür, insülin ifade özgü morfolojisi kolonileri kuruldu ve her koloninin soy kompozisyonunu belirlemek için kantitatif RT-PCR ve immunoflourescent boyama kullanarak pankreas gen ekspresyonu için daha fazla analiz edilebilirdi. Özetle, koloni test kolay algılama ve hücrelerin heterojen bir nüfus içinde fonksiyonel atalarıdır ölçümü sağlar. Buna ek olarak, yarı-katı medya formatı in vitro proliferasyon ve ayırt atalarıdır sağlayan hücrelere ekstraselüler matriks bileşenleri ve büyüme faktörleri tek tip bir sunum sağlar . Bu koloni tahlil tek hücre düzeyinde pankreas progenitör hücrelerin mekanik çalışmalar için eşsiz fırsatlar sağlar.

Pankreas gibi atalarıdır insülin ifade koloniler içine ayırt etmek için izin veren üç boyutlu clonogenic tahlil açıklanmıştır. Bu yöntem, metilselüloz, Matrigel ve büyüme faktörleri içeren yarı-katı medya yararlanır, tek atalarıdır çoğalırlar ve ayırt<em&gt; In vitro</em&gt; Sayıda bir nüfus fonksiyonel atalarıdır kantifikasyon izin.

İnsülin ifade Koloni oluşturan atalarıdır için Kantitatif Testi

Pankreas kök ve progenitör hücre biyolojisi alanı, ... olan in vitro fonksiyonel ve kantitatif analizlerin eksikliği nedeniyle sekteye uğramıştır.

Bu video, pankreas benzeri progenitörlerin insülin eksprese eden kolonilere farklılaşmasını sağlayan üç boyutlu kültürler oluşturma prosedürünü göstermektedir. İlk olarak, neurogen in three EGFP Knockin fare embriyonik kök hücre hattından türetilen farklılaşmış hücreler disosiye edilir ve endokrin benzeri progenitörleri zenginleştirmek amacıyla EGFP ekspresyonuna göre sıralanır. EGFP pozitif sıralanmış tek hücreler, matrigel ve büyüme faktörleri içeren yarı katı bir ortama ekilir.Bu durum, tekil progenitör hücrelerin hareketini kısıtlarken in vitro ortamda hayatta kalmalarına, proliferasyonlarına ve farklılaşmalarına olanak tanır. Ardından, belirli bir ayrıştırılmış popülasyondaki koloni oluşturucu progenitörlerin frekansını hesaplamak amacıyla, karakteristik morfolojiye sahip oluşan kolonilerin sayısı bir mikroskop altında belirlenir ve skorlanır. Tekil kolonilerin gerçek zamanlı PCR ve immünofloresan mikroskopi ile analizi, ngn three pozitif hücrelerden türeyen kolonilerde insülin ekspresyonu olduğunu, ancak NGN three negatif hücrelerden türeyenlerde olmadığını ortaya koymaktadır.Süspansiyon kültüründeki pankreatik küreler gibi mevcut tekniklere kıyasla bu tekniği kullanmanın temel avantajı, daha fazla sayıda hücrenin içsel progenitor koloni oluşturma yeteneği açısından aynı anda incelenmesine olanak tanımasıdır. Bu yöntem, progenitor hücrelerin hangi belirteçleri eksprese ettiği ve bu hücrelerin idamesi, kendi kendini yenilemesi ve farklılaşması için hangi içsel veya dışsal faktörlerin önemli olduğu gibi pankreatik kök ve progenitor hücrelerin biyolojisine ilişkin soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin etkileri tip 1 diyabet tedavisine kadar uzanabilir; çünkü pankreatik progenitor hücreler tanımlanabilir ve beta benzeri hücrelere doğru farklılaştırılabilirse, bu hücreler son evre tip 1 diyabetli hastalarda hasarlı beta hücrelerini değiştirmek için kullanılabilir.Bu yöntem ayrıca koloni çalışmalarına; postnatal ve yetişkin pankreasın, kemik iliğinin, karaciğerin ve dalağın progenitor hücre oluşumlarını incelemek gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Genel olarak, bu tekniği yeni öğrenen kişiler, hücreleri tek hücre süspansiyonuna ayrıştırma ve dağıtım hazırlığı aşamasında matrigel ile metilselülozu yönetme süreçlerinin zorluğu nedeniyle güçlük çekebilirler. Bu yöntem fikri ilk olarak, pankreastaki progenitor hücreler ile onların farklılaşmış soyundan gelen hücreleri arasındaki soy hattı ilişkisini ele alan herhangi bir klonojenik analiz yönteminin olmadığını fark ettiğimde ortaya çıktı.Bu tür bir koloni deneyi, geçmişte hematopoetik kök hücrelerin ve progenitör hücrelerin incelenmesinde etkili olmuştur. Pankreatik kök hücre biyolojisini incelemek için de böyle bir deneye ihtiyaç olduğunu fark ettim. Yarı katı ortam bileşeni doğası gereği viskoz olduğu, hazırlama ve dağıtma basamaklarını öğrenmek zor olduğu için bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşımaktadır.Prosedürler; yüksek lisans öğrencisi Bay Michael Winkler, teknisyen Bayan Nancy ve daha sonra gerçekleştirilecek koloni deneyi için kondisyonlu ortam üretimi yapacak bir laboratuvardan doktora sonrası araştırmacı Dr. Lang Jing tarafından gösterilecektir. Nöron ES hücreleri in vitro ortamda pankreas benzeri hücrelere farklılaştırılır. Bu prosedüre, altı günlük embriyo gövdelerini bir ışık mikroskobu altında inceleyerek başlayın.Bunların en az %30 ila %40'ının çapları en az 150 mikron olmalıdır. Daha büyük embriyo gövdesi, gelişmiş farklılaşmaya işaret eden koyu lekeler içermelidir. Altı kuyucuklu bir yapışma plakasının her bir kuyucuğuna 80 ila 100 embriyo gövdesi aktarın, ardından hücreden hücreye temasları artırmak için embriyo gövdelerini kuyucukların merkezlerinde toplamak amacıyla plakayı nazikçe sallayın.Bu temaslar, embriyo gövdelerinden pankreas benzeri hücrelerin daha iyi gelişmesini sağlar. Plakaları nazikçe 37 °C ve %5 karbondioksit içeren kültür inkübatörüne geri yerleştirin. A 13.Endokrin hücre farklılaşmasını indüklemek için, ortamı nikotinamid ve insan rekombinant aktif β-cellulin içeren taze tutunma kültür ortamı ile değiştirin. Ardından kültürleri inkübatöre geri yerleştirin. 16. günde, ortamı toplayın ve hücre kalıntılarından arındırmak için 0,2 mikronluk bir polietersülfon membran üzerinden filtreleyin.Bu noktadan itibaren, toplanan besiyerine kondisyonlu besiyeri denilecektir. Kondisyonlu besiyerini 15 mililitrelik konik polipropilen tüplere paylaştırın ve kullanımdan hemen öncesine kadar -80 °C'de saklayın. Neurogenin 3, gelişim sırasında pankreatik endokrin progenitörleri tarafından eksprese edilen bir transkripsiyon faktörüdür. Neurogenin 3 eksprese eden endokrin öncüller nihayetinde pankreatik alfa, beta, delta, epsilon ve pankreatik polipeptid eksprese eden hücrelere farklılaşır. NGN3 eksprese eden hücrelerin tanımlanmasını kolaylaştırmak için, bir knock-in fare ES hücre hattındaki NGN3 lokusunun bir alleli EGFP reporter geni ile değiştirilmiştir. Elde edilen hücre hattı NGN3 EGFP olarak adlandırılmıştır. Farklılaşmış NGN3 EGFP pozitif ve NGN3 EGFP negatif hücreler elde etmek için.Hücreler, tek hücre süspansiyonu elde etmek için 16. günde kültür plaklarından önce tripsin ile ayrılır. Hücre kümeleri kollajenaz B ve DNase ile inkübe edilir ve 40 veya 70 mikronluk bir süzgeçten geçirilir. Ardından DPI eklenir ve sırasıyla hücre boyutu ve granülerliğin göstergesi olan ileri saçılma ve yan saçılmaya göre hücreleri ayırmak için bir hücre ayırıcı ile sıralama yapılır.Ardından, hücresel olmayan debrisleri elemek için bir kapı (gate) çizilir. Ölü hücreleri ayırt etmek için, pozitif boyanacak olan DPI kullanılır. 405 ila 413 nanometrede uyarılıp emisyon 454 40 filtresi ile tespit edildiğinde, puls genişliği kapılaması (gating of pulse width), elektronik ileri saçılım (forward scatter) pulsunun genişliği doubletleri ortaya çıkarır; bunlar, floresanla aktive edilmiş hücre ayıklayıcıdan (fluorescence activated cell sorter) geçirilmeden önce elenmelidir; EGFP kanalı FL 1'e karşı otofloresan kapılaması yapılır.Sol panelde gösterilen TL gibi kontrol bir ebeveyn hücre hattından alınan 16. gün hücrelerinin kullanılması gerçek floresan ışımayı belirginleştirir ve böylece sağ panelde görüldüğü gibi NGN three EEG FP pozitif hücre popülasyonu görselleştirilebilir. NGN three EGFP pozitif hücrelerin ayırma kapısı, ayıklama sırasında NGN three EEG FP negatif hücrelerin kontaminasyonunu sınırlamak amacıyla, burada ok ile belirtildiği gibi bilinçli olarak sağa kaydırılır. Kapılar belirlendikten sonra, NGN three EEG, FP pozitif ve NGN three EGFP negatif hücreler ayıklanır ve ekime hazırlık aşamasında kullanılana kadar buz üzerinde saklanır.Matrigel'i deneyden önceki gece dört derece santigrat sıcaklıkta buz üzerinde bekletin. Deney günü ise şu reaktifleri veya çözeltileri buz üzerinde hazırlayın: D-M-E-M-F 12, metil selüloz, kondisyonlu ortam, FCS, nikotinamid XTEND 4, VEGF A ve rekombinant insan aktif TGF-beta 1. Kullanımdan en az yarım saat önce, 200 mikrolitrelik pipet uçlarının bulunduğu steril bir kutuyu eksi 20 derece santigrat sıcaklığa yerleştirin. Sort edilmiş hücreleri ekime hazırlamak için, önce yarı katı ortam bileşenleri beş mililitrelik polistiren bir tüpe eklenmelidir. İlk olarak, bir şırıngaya az miktarda %3,3'lük metil selüloz çözeltisi çekmek için 16,5 gauge iğne kullanın.Ardından, havayı tahliye etmek için çözeltiyi hemen dışarı itin. Bu işlem, şırıngadaki ölü boşluğu çözeltiyle dolduracak ve yarı katı çözeltinin hacminin doğru şekilde ölçülmesini kolaylaştıracaktır. Sonrasında, hava kabarcığı oluşumundan kaçınarak, hedeflenen miktardaki metil selüloz çözeltisini çekin ve beş mililitrelik bir tüpe aktarın.Kondisyonlu medyum, FCS, nikotinamid, aktif beta-FGF, VEGF A ve D-M-E-M-F 12 ekleyin. Ardından, matrijeli eklemek için soğuk pipet uçlarını kullanın. Son olarak, sıralanmış hücrelerin istenen miktarını beş mililitrelik tüpe ekleyin.Hücrelerin erken stimülasyonunu önlemek için hücreleri her zaman en son ekleyin. Ardından tüpün kapağını sıkıca kapatın ve tüpleri elinizle kuvvetli ve kapsamlı bir şekilde çalkalayın. Çalkalama işlemi hava kabarcıkları oluşturduğundan, tüpleri beş dakika boyunca veya küçük hava kabarcıkları yüzeye çıkana kadar buz üzerinde bekletin.18,5 gauge iğneye sahip bir mililitrelik bir şırınga kullanarak yarı katı besiyeri hücre karışımından küçük bir miktar çekin ve şırıngadaki havayı hemen tahliye edin. Ardından, yarı katı hücre karışımının 500 µL'sini 24 kuyucuklu düşük tutunumlu bir plakanın her bir kuyucuğunun merkezine yavaşça dağıtın. Her örnek dörtlü tekrarlar şeklinde ekilmeli; yatay yönlendirilmiş 24 kuyucuklu plakanın yalnızca en içteki dört sütunu kültür için kullanılmalıdır.Hücre içeren kültürün nemlendirilmesine yardımcı olmak için kalan kuyucukları steril su ile doldurun. Ekimden hemen sonra hücreleri ışık mikroskobu altında inceleyin.Tek hücreler kuyucuklara rastgele ve eşit şekilde dağıtılır. Hücreleri 37 °C sıcaklıkta ve %5 karbondioksit içeren havada sekiz ila 12 gün boyunca inkübe edin. Sekiz ila 12 günlük inkübasyonun ardından hücreleri mikroskop altında tekrar gözlemleyin.Bu, kültürde eşit şekilde dağıtılmış matrigel için iyi bir örnektir. Burada, Apache çerçevesine yol açan düzensiz dağılmış matrigel örneği verilmiştir. Matrigelin bulunmadığı yerlerde koloniler büyümez.Bu, yarı katı besiyeri karışımına matri gel eklenmemiş bir kuyucuğun arka plan örneğidir. Oluşan kolonileri saymak için plakanın altına bir ızgara yerleştirin. Ardından, 10x objektif lens kullanarak kolonileri gözlemleyin ve sayın; besiyerinin üç boyutlu yapısı nedeniyle koloniler farklı odak noktalarında görünecektir.Bu nedenle, ışık mikroskopu ile gözlem sırasında her koloni için odak ayarının yapılması gerekebilir; yarı katı kültürdeki insülin eksprese eden kolonilerin sekiz ila 12 gün sonraki temsili fotomikrografları burada gösterilmiştir, oklarla belirtilen koloniler rastgele dağılmıştır ve yaklaşık 60 ila 100 mikron çapında, küçük, koyu renkli, ışığı yansıtmayan kümeler şeklinde görünmektedir. Tek tek elle seçilen kolonilerin ardından yapılan mikroakışkan R-T-P-C-R analizi, önceki raporumuzla tutarlı olarak insülin iki ve glukagon ekspresyonunu ortaya çıkarmıştır. Bu sonuçlar, tekil NGN three EGFP pozitif hücrelerin, primitif birinci dalga benzeri endokrin hücreleri andıran ve aynı anda iki adacık hormonu içeren kolonilere farklılaşma yeteneğini göstermektedir; de novo insülin üretimi için bir belirteç olan eptide protein ekspresyonu, tüm tutam floresan boyama kullanılarak doğrulanmıştır.Özetle, insülin eksprese eden koloni oluşturan birimler deneyi bu raporda gösterildiği şekilde gerçekleştirildiğinde, koloni oluşturma kapasitesine sahip bireysel progenitörlerin sayısı kolayca belirlenebilir; burada ve önceki raporumuzda gösterildiği üzere, insülin eksprese eden koloni oluşturan birimler, in vitro olarak fare ES hücrelerinden türetilen NGN EGFP pozitif ancak ngn three EEG FP negatif hücrelerin ayıklanmasıyla zenginleştirilebilir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik bir ila üç saat içinde tamamlanabilir. Ayıklama sonrası, bu prosedür uygulanırken hücrelerin tamamen tek hücre süspansiyonuna ayrıştırıldığından emin olmak, matrigel'in katılaşmasını önlemek için tüm kültür bileşenlerini buz üzerinde tutmak ve hücrelerin erken stimülasyonunu önlemek için hücreleri tüplere en son eklemek önemlidir. Bu prosedürün ardından, tek bir hücrenin koloni oluşumunu başlatmak için yeterli olup olmadığı gibi ek soruları yanıtlamak için tek hücre manipülasyonu gibi diğer yöntemler uygulanabilir.Bu teknik, pankreatik kök hücre ve projenik hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların önünü açacaktır. Araştırmacıların, self-renewal (kendi kendini yenileme) kapasitesini ve beta benzeri hücrelere farklılaşma yeteneğini incelemelerine olanak tanır. Bu videoyu izledikten sonra, insülin eksprese eden koloni oluşturucu progenitörler için kantitatif koloni analizinin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

a-quantitative-assay-for-insulin-expressing-colony-forming-progenitors

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol, flow sitometri ile hücre plazma membranı, sitoplazma GLUT4 translokasyon ölçmek hızlı bir teknik anlatılmaktadır.

Akış Sitometri Plazma Membran GLUT4 Translokasyon Kantitatif Ölçüm

Kendini yenileme ve erişkin fare pankreas izole progenitör hücrelerin farklılaşmasını tespit etmek için in vitro koloni deneylerde icat edilir. Bu analizlerde, pankreas ataları metilselüloz içeren yan-katı bir ortam içinde 3-boyutlu bir uzayda hücre kolonileri yol açar. tek hücreler ve bireysel koloniler karakterizasyonu taşıma protokolleri açıklanmıştır.

In Vitro Colony Tahliller Tri-güçlü Progenitör Hücreleri karakterize Yetişkin Fare Pankreas İzole

diyabet araştırma alanı için kritik zorluklar adacık β-hücre çoğalmasını düzenleyen ve β-hücre yenilenmesini teşvik etmek için yöntemler geliştirmek moleküler mekanizmalarını anlamak için vardır. Burada yüksek içeriği tarama yöntemi belirlemek ve küçük moleküllerin β-hücresi replikasyon teşvik aktivitesi sunulmuştur değerlendirmek.

Bir Yüksek içerik<em&gt; İn Vitro</em&gt; Pankreas Adacık β-hücre çoğaltma Keşif Platformu

Burada, β hücre proliferasyonunun müteakip immünofloresan analizi ile kültürdeki bozulmamış fare adacıklarına ilgi yüklü poli(laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) mikrokürelerinin bileşiğini oluşturmak ve uygulamak için metodoloji sunuyoruz. Bu yöntem, aday β hücreli mitojenlerin etkinliğini belirlemek için uygundur.

Bozulmamış Fare Adacık için β-hücre mitogenlerin Sürekli İdaresi<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Biyolojik olarak parçalanabilir poli (laktik-ko-glikolik asit) mikro kullanılması

Burada, homojen mevcut zaman hücrelerden salgılanan insülin hızlı algılama için etkili bir yöntem olarak FRET (HTRF) çözüldü.

Homojen zaman çözüldü Förster rezonans enerji transferi tabanlı tahlil insülin salgılanması algılanması için

Burada sunulan bir protokol Proliferasyona CD4+ T hücreleri antijenik proteinler veya peptidler boya seyreltme kullanarak yanıt olarak. Bu tahlil nadir antijen özgü T hücrelere özellikle duyarlıdır ve antijen özgü hücrelerin klonlama kolaylaştırmak için değiştirilebilir.

Proliferasyon ınsan antijeni spesifik CD4+ T hücrelerinin Karboksflorcein Succinimidyl Ester kullanarak ölçülmesini

Bu protokol, bir insülin bağlantılı gaussia Lusiferaz ile Beta hücrelerinden insülin salgılanması için bir vekil olarak orta verim ile hızlı düşük maliyetli Lusiferaz nasıl gerçekleştirileceğini açıklar. Tahlil en lüminesans plaka okuyucular ve çok kanallı pipetler ile gerçekleştirilebilir.

Bir Co-salgılanmış luciferase Surrogate kullanarak bağıl Insülin salgılanmasını ölçme

Kök hücrelerin adacık hücrelerine farklılaşması, geleneksel diyabet tedavisine ve hastalık modellemesine alternatif bir çözüm sunar. Bir tabakta insülin salgılayan, kök hücreden türetilen adacıkların üretilmesine yardımcı olmak için ticari bir farklılaşma kitini önceden onaylanmış bir yöntemle birleştiren ayrıntılı bir kök hücre kültürü protokolünü açıklıyoruz.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinin İnsülin Üreten Adacık Kümelerine Farklılaşması

Bu makale, β hücreli benzeri hücrelerin yönlendirilmiş farklılaşması ve fonksiyonel analizi için bir protokol sunmaktadır. İnsülin üreten pankreas hücreleri oluşturmadan önce insan pluripotent kök hücreleri için optimal kültür koşullarını ve pasajlarını tanımladık. Altı aşamalı farklılaşma, kesin endoderm oluşumundan, glikoza yanıt olarak insülin salgılayan fonksiyonel β hücreli hücrelere doğru ilerler.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Fonksiyonel Pankreas İnsülin Salgılayan Hücreler Üretmek için Optimize Edilmiş Protokol

Murin koroid pleksusunda insülin reseptör izoformları IR-A ve IR-B'yi haritalamak için bir Dubleks in situ hibridizasyon testi oluşturduk ve geleneksel yöntemlerin sınırlamalarının üstesinden geldik. Bu yüksek çözünürlüklü yaklaşım, beyin insülin sinyalizasyonu ve nörolojik bozukluklar için potansiyel izoform hedefli tedaviler hakkında yeni bilgiler sunan izoforma özgü ifadeyi ortaya çıkarır.

Murin Beyninde İnsülin Reseptörleri A ve B'nin RNA In Situ Hibridizasyon Testi ile Hassas Görselleştirilmesi

Bu çalışma, fare pankreasındaki fonksiyonel birincil adacıqları ve asinar hücreleri verimli bir şekilde çıkaran basitleştirilmiş bir yöntem geliştirdi ve Akut Pankreatit Kaynaklı Diyabetin patogenezinde hücrelerarası iletişimi incelemek için değerli bir araç sağladı.

Farelerden Birincil Adaçik Ve Birincil Pankreas Asinar Hücrelerinin Eşzamanlı İzolasyonu İçin Basit ve Hızlı Bir Yöntem

Öğrenin, pankreas benzeri öncü hücrelerin insülin ifade eden kolonilere farklılaşmasını sağlayan üç boyutlu klonojenik analiz yöntemini. Bu teknik, diyabet tedavisi araştırmaları için değerli bir araçtır.

İnsülin ifade Koloni oluşturan atalarıdır için Kantitatif Testi

Daha fazla video keşfet