Name: CD4 + T-Lenfosit Yakalama HIV için Disposable mikroakışkan Chip (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T13:03:52.000+00:00
Duration: 12 min 44 s
Description: Keşfedin, PDMS tabanlı mikroakışkan cihaz kullanarak hasta kanından CD4 pozitif T yardımcı lenfositleri yakalama ve nicelendirme yöntemini. Bu teknik, kaynak sınırlı ortamlarda HIV tanısı için yüksek hassasiyet sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li> Mikroakışkan kanal anti-CD4 + biotinlayted yüzey hazırlayın. </li><li> 5 ml / dk 10 ml numune kan şırınga pompası ile mikroakışkan kanal içine enjekte edilir. </li><li> PBS ile 20 dakika için 20 ml / dak kan yıkayın. </li><li> 15 dakika için 5ul/min seyreltilmiş FACS parçalama solüsyonu (PBS ile stok solüsyonu% 10 sulandırılmış) enjekte edilir. </li><li> 15 dakika boyunca inkübe. </li><li> 5 ml / dk 20 dk birincil CD3 + antikor solüsyonu (PBS ile stok solüsyonu% 10 sulandırılmış) enjekte edilir. </li><li> 2 saat süreyle inkübe edin. </li><li> 5 ml / dk 15 dk PBS ile kanal yıkayın. </li><li> 5 ml / dk, aynı zamanda 20 dakika boyunca% 20 AF488 CD4 + antikor,% 0.2 DAPI stok solüsyonu,% 10 ikincil CD3 + antikor enjekte edilir. </li><li> 20 dakika boyunca inkübe. </li><li> 5 ml / dk 15 dk kanalı PBS ile yıkayın. </li><li> Floresan mikroskop altında hücrelerin sayısı: <ol><li> Beyaz (optik) - Siyah ve beyaz: hücre ve toz </li><li> Yalnızca UV (DAPI) - Mavi: hücre </li><li> Blue (CD4 +) - Yeşil: T-lenfosit ve monosit </li><li> Sadece Yeşil (CD3 +) - Kırmızı: T-lenfosit </li></ol></li></ol>

<table><tbody><tr><td>PDMS mikrokanal</td><td></td><td></td><td></td><td>SU-8 kalıbı ile üretilmiştir</td></tr><tr><td>Kan</td><td></td><td></td><td></td><td>Normal insan denekten bağışlanmış kan. Mass General Hospital, 10 X yüksek yoğunluklu WBC veya Brigham and Women&amp;rsquo;s Hospital.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Tampon</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td>1x Dulbecco&amp;rsquo;s Fosfat Tamponlu Tuzlu Su.</td></tr><tr><td>FACS lizleme çözeltisi</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>349202</td><td>Stok çözeltiden PBS ile %10'a seyreltilmiştir.</td></tr><tr><td>Anti-CD4+ biyotinlenmiş Ab</td><td></td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>IM0704</td><td>Yüzey, 0.2mg stok ve 1ml deiyonize su ile karıştırıldıktan sonra stok çözeltiden PBS/BSA ile %10'a seyreltilen Anti-CD4+ biyotinlenmiş Ab ile hazırlanmıştır.</td></tr><tr><td>keçi anti-hCD3delta</td><td>pAB</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-1128</td><td>Stok çözeltiden PBS ile %10'a seyreltilmiştir</td></tr><tr><td>tavşan anti-keçi IgG PE</td><td></td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-3755</td><td>Anti-CD3 Ab için sekonder Ab, stok çözeltiden PBS ile %10'a seyreltilmiştir</td></tr><tr><td>anti-insan CD4+</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>557695</td><td>Alexa Fluor 488 işaretli, stok çözeltiden PBS ile %20'ye seyreltilmiştir.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>4&amp;rsquo;,6-dianidino-2-fenilindol, dihidroklorür çözeltisi, stok çözeltiden PBS ile %0.2'ye seyreltilmiştir.</td></tr></tbody></table>

cd4 + t-lenfosit yakalama hiv için disposable mikroakışkan chip

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + T-Lenfosit Yakalama HIV için Disposable mikroakışkan Chip

Merhaba, benim adım Richard Lin; Harvard MIT Sağlık Bilimleri ve Teknolojileri Bölümü'nde Profesör TI Mercy'nin grubunda araştırmacıyım. Üzerinde çalıştığım proje, kaynakların sınırlı olduğu ortamlarda kullanılmak üzere, hasta kanındaki CD4 pozitif ve C3 pozitif T lenfositlerinin miktarını belirlemek ve bunları yakalamaktır.Şu an önümde, PDMS'den (Polidimetilsiloksan) yapılmış bir mikroakışkan cihaz bulunuyor. Cihazın kanal yüksekliği 50 µm olup cihazdaki toplam hacim 10 µL'dir. Bu, T yardımcı lenfositlerini yakalamak için kullanacağımız son derece hassas bir cihazdır.Temel olarak, HIV hastaları için tanısal referans noktasıdır. Mikro akışkan cihazın yüzeyi proteinle hazırlanmış ve şırıngada CD4 pozitif antikorlar bulunmaktadır. Şu an elimizde pH 7.4'te PBS biyolojik tamponu var ve fazla CD4 pozitif antikoru temizlemek için bunu kanala akıtacağız.Bu aşamada, sadece fazla maddeleri temizlemeye çalıştığımız ve akış hızının pek bir önem taşımadığı için hızı kontrol etmeye gerek yoktur. Cihazın girişleri burada olacaktır ve çıkışlar ise benim solumda, sizin sağınızda yer alacaktır. Şimdi fazla antikor çözeltisini temizleyeceğim; çıkıştan sıvı geldiğini fark edebiliyorsanız, bunun çok küçük bir miktar olduğunu ancak yakından baktığınızda tüpler aracılığıyla kanaldan sıvı çıktığını görebileceğinizi belirtmek isterim.Fazla antikor çözeltisini temizlediğimize göre, artık kan enjeksiyonu aşamasına geçebiliriz. Bu nedenle, tüpleri giriş kısmından çıkaracağım. Şimdi, insan tam kanı içeren yeni bir şırınga açacağız.Bu bir hasta örneği değil, mikroakışkan cihaza kanı enjekte etmeye hazırlanırken kullandığımız sağlıklı bir deneğe ait sağlıklı bir örnektir. Şimdi şırıngayı şırınga pompasına takacağız. Ardından cihazı açacağız ve şırınganın akış hızlarını görebileceksiniz; bunu dakikada 5 µL olacak şekilde ayarladık.Şimdi temel olarak kan enjeksiyonu için hazırlık yapacağız. Şırınga pompasını dikey olarak yerleştireceğiz çünkü bildiğimiz üzere kan hücreleri çökelme yapar ve biz hücrelerin kanala akmasını isteyeceğiz. Bu nedenle hücrelerin, tüpümüzün hemen yanında bulunan tabana çökelmesini tercih ederiz.Böylece artık her şey hazır hale geldi. Cihazımın hacmi 10 µL başına 10 µL'dir. Kanal duvarına akıtmak istediğimiz hacim de yine 10 µL'dir.Kanalın rengine bakarak yeterince kan akıtıp akıtmadığımı anlayabiliyorum; eğer kanal tamamen kırmızıyla dolmuşsa, 10 µL akıttığımı anlarım ve şırınga tamponunu durdurmam gerekir. Şimdi başlatma düğmesine basacağım ve işlem başlayacak; bazen kanın kanala gerçekten girmesi biraz zaman alabiliyor. Bu durum büyük oranda basınca bağlıdır.Örneğin, şırıngayı yerleştirdiğimizde, tüpteki kanı ayarlamak için bazen sıvıyı geri çekebilir veya enjekte edebiliriz. Bu nedenle işlem biraz zaman alabilir ancak kan bir kanala pompalanmaya başladığında, akış hızı istediğimiz değer olan ly/dakika seviyesine ayarlanmış olur. Bu noktada biraz sabırlı olmamız ve beklememiz gerekebilir; kanın kanala ulaşmaya başlaması bazen iki üç dakika sürebilir.Şu an kanın kanala girmeye başladığını görebilirsiniz. Dolayısıyla cihazın neredeyse tamamen dolduğunu söyleyebiliriz. Tamam, şimdi kanaldaki kanı temizlemek için boru hattını tekrar PBS'ye çevireceğiz.Bunu yapmak için, boruları çıkarmak için daha önce yaptığımız işlemleri tekrarlayacağız. PBS akış hızını kontrol etmeye hâlâ ihtiyaç duyduğumuz için şırınga pompasına hâlâ ihtiyacımız var. Ancak, artık kan akışı sağlamadığımız ve PBS içinde hücre bulunmadığı için, şırınga pompasını dikey konumda tutmamıza gerek yoktur.Şimdi her şey hazır ve cihazdaki kanı dışarı atacağız; bunun için buradaki keskin butonuna tekrar basacağım. Gördüğünüz gibi, cihaz temizlenmeye başlıyor. Kenarlarda hâlâ biraz kan var ancak yavaş yavaş yok oluyor.Tüm kan tükendiğinde, akış hızını dakikada 5 µL'den dakikada 20 µL'ye çıkaracağız. Bu değişikliğin nedeni, kanda aslında C4 pozitif antijenlere sahip iki hücre tipi bulunmasıdır. Bunlardan biri, aradığımız hücreler olan T yardımcı lenfositlerdir.Diğerleri ise monositler olarak adlandırdıklarımızdır. Cihazımızın, hem T yardımcı lenfositleri hem de monositleri yakalamak yerine, özellikle sadece T yardımcı lenfositlerini yakaladığından emin olmak istiyoruz. Bunu gerçekleştirmek için kullandığımız yöntem, akış hızını artırmaktır; çünkü monositlerin T yardımcı hücrelerinden daha büyük boyutta olduklarını biliyoruz.Böylece akış hızlarını artırarak, daha büyük olan monositlerin yüzeyden ayrılmak için CD4 pozitif T yardımcı hücrelerine göre daha fazla basınca maruz kalmaları sağlanacaktır. Şu an yaklaşık 20 dakikadır işlem sürmektedir. Şu an elimde bulunan bir çözeltidir.Buna faks lizleme çözeltisi denir. Bunun buradaki amacı kırmızı kan hücrelerini lizlemektedir. Kanalda kırmızı kan hücrelerinin kaldığı her yerde, bu çözelti onları lize edecektir.Bu, stok çözeltiden 10 kat seyreltilmiştir. Şimdi yapacağımız işlem, şırınga pompasını durdurmak, hortumu çıkarmak ve temel olarak çözeltiyi bu şırıngadaki ile değiştirmektir. Şimdi makineyi durduruyorum, hortumu çıkarıyorum, bunu ayırıyorum, bu şırıngayı alıyorum ve yenisiyle değiştiriyorum.Tamam, her şeyi kurduğuma göre, hızı tekrar dakika başına beş mikrolitreye düşüreceğiz. Hız kısmında 20 olan değeri tıklayıp beş olarak düşüreceğiz ve şimdi fax license çözeltisini 20 dakika boyunca akıtacağız. Ve şimdi başlat düğmesine basacağız.Şu anda önümüzde, cihazın 10x büyütme ile çekilmiş bir optik görüntüsü var. Buradaki tüm bu beyaz noktaları görebilirsiniz. Peki, bu hücrelerin aradıklarımız olduğundan nasıl emin olabiliriz?Bu nedenle, ilk kullandığımız boyanın DPI olduğunu belirtmek için birkaç farklı boyama yöntemi kullanıyoruz; DPI çekirdeği boyar. Temel olarak, beyaz kan hücreleri gibi çekirdeği olan tüm hücreler boyanırken, çekirdeği olmayan kırmızı kan hücrelerinin boyanmadığını söyleyebiliriz ve bunun görüntünün genelinde olduğunu görebilirsiniz. Tüm bu mavi noktalar vardır ve her biri mavidir.bir hücredir. Bu nedenle bir sonraki adım, hücrelerin C4 pozitif antijen dediğimiz yapıya sahip olup olmadığını kontrol etmektir. Bu son derece önemlidir çünkü cihazımızın tüm amacı C4 pozitif hücreleri yakalamaktır.Sıradaki, kullandığımız floresan antikor elbette C4'e özgüdür. Bir sonraki slayta geçelim. Bu resimde hücrelerin çok daha sönük çıkmasının nedeni, kullandığımız floresan antikorun genellikle dört faktörlü olmasıdır.Böylece dilüsyon çok daha yüksektir. Ancak yakından bakarsanız, bu görüş alanına yayılmış noktaların hâlâ olduğunu görebilirsiniz. Bunlar oldukça sönüktür.Ancak daha yakından incelediğimizde, bu hücrelerin CD4 pozitif olduğunu söyleyebiliriz; bu iyi bir durum çünkü tam olarak istediğimiz şey buydu. Bir sonraki aşama ise, daha önce belirttiğim gibi, iki farklı tipte CD4 pozitif hücre olmasıdır. Bunlardan biri, istediğimiz hücreler olan T yardımcı hücreler, diğeri ise monosit olarak adlandırdıklarımızdır.Bu nedenle, iki hücreyi birbirinden ayırt etmek için tekrar başka bir floresan antikore ihtiyaç duyuyoruz. T yardımcı lenfositlerin üzerinde CD3 pozitif antijenler olduğunu, monositlerde ise bunların bulunmadığını biliyoruz.Sırada kullandığımız antikor CD3 spesifik olanıdır ve bunu bu resimde görebiliriz. Yine, noktaların cihazın etrafına dağıldığını görebilirsiniz; bazı hücreler bazen daha parlak göründüğü, bazıları ise görünmediği için noktalar daha büyük görünmektedir. Yani, bu durumda pek çok şey şansa bağlıdır ancak çoğu durumda, bu parlak kırmızı noktaların tamamı hücrelerdir.Yani burada tekrar, hücrelerimizin CD4 pozitif ve CD3 pozitif olduğundan emin olmak istiyoruz. Bu durumda, hücrelerimizin çoğunun CD3 pozitif olduğunu görebilirsiniz ki bu iyi bir durumdur. Bu bize yakalamamızda özgünlük sağlar.Büyük noktalar atık olabilir, ancak çoğu zaman gerçekleşen durum şudur; bazen bir hücre tesadüfen kendi üzerine daha fazla CD3 kümesi, yani CD3 toplamış olabilir. Bu resimde, bu mikroakışkan cihaz için topladığımız verilerden biri görülmektedir ve bu temel olarak bir hücre yakalama düzeneğidir. Önceki slaytlarda, üzerinde hücrelerin olduğu birçok resim olduğunu fark etmişsinizdir.Peki, bunlar gerçekte neye dönüşüyor? Aslında bunlar bir hücre yakalama profiline dönüşüyor; bu durumda X eksenine girişten olan uzaklığı, Y eksenine ise yakalanan hücre diskini yerleştirebiliriz. Cihaz boyunca, yoğunluğunuzun başlangıçta son derece yüksek olduğunu ve ardından yavaşça azaldığını görebilirsiniz; kan dolaşımından C4 pozitif ve C3 pozitif hücreleri yakaladığımız için kan örneğindeki bu hücrelerin konsantrasyonunun azalmasını bekleriz, bu da beklediğimiz sonuçtur.Verilerimiz genellikle temel olarak bu şekilde sunulmaktadır.

cd4-t-lymphocyte-capture-using-a-disposable-microfluidic-chip-for-hiv

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Hücre Yakalama mikroakışkan Cihaz Kullanımı

Bu prosedür, arıtma gösteriyor ve in vitro antijen spesifik CD4 + T hücreleri, tüm periferik kan ve MHC sınıf II tetramers kullanarak görselleştirme genişleme. Tetramers tek bir antijen özgüllüğü ve tanımlanan MHC sınıf II kısıtlama ile T hücrelerinin doğrudan görselleştirme izin verir.

Görselleştirme Antijen spesifik CD4 + T hücreleri MHC Sınıf II Tetramers kullanarak

Bu görüntülenmiştir deney canlı konfokal görüntüleme deneyleri için HIV floresan moleküler klon kullanan için bir rehber.

HIV ve Live Konfokal Mikroskop Floresan Klonlar kullanılarak HIV görselleştirme Hücre-hücre Transferi

Bu yazıda tek bir hücre analizi için bir mikroakışkan çip sunuyoruz. Bu sağlar: hücre içi proteinler, enzimler, kofaktörler, ve floresan deneyleri veya bağışıklık aracılığıyla ikinci haberciler miktar.

Tek Hücrelerinin yönlü Kimyasal Analiz için mikroakışkan Chip

In vivo ayrıntılı olarak T hücresi tepkilerini izlemek için yeteneği, bağışıklık tepkisinin anlamamıza geliştirilmesi için önemlidir. Burada akış sitometresi ile eş zamanlı olarak&gt; 250 parametrelerini değerlendiren bir in vivo T hücresi tahlilinde floresan hedef diziler (STA) kullanımını tarif eder.

T hücre yanıtlarının Değerlendirme Floresan hedef Dizilerin Kullanımı<em&gt; In vivo</em

Bu protokolün amacı, kapalı bir sitokin yakalama sistemi içeren ve özel personel veya bir GMP tesisinin kullanılmasını gerektirmeyen tezgah üstü, otomatik, ikinci nesil hücre zenginleştirme cihazı kullanarak patojene özgü klinik dereceli T hücreleri üretmektir. Üretilen sitomegalovirüs pp65'e özgü T hücreleri doğrudan hastalara uygulanabilir.

Sitokin yakalama Sistemi kullanılarak Klinik Uygulamalar için Sitomegalovirüs özgü otomatik Hücre Zenginleştirme T hücreleri

İmmünoterapi ve tek hücreli genomik profilleme çağında, kanser biyolojisi, tümör-bağışıklık arayüzünü uygun bir mekansal zamansal bağlamda araştırmak için yeni in vitro ve hesaplama araçları gerektirir. Hücresel fonksiyonların dinamik, multiparametrik izlenmesi ile uyumlu, 2D ve 3D ortamlarda tümör-immün mikroakışkan ko-kültürlerden yararlanmak için protokolleri açıklıyoruz.

İn vitro tümör mikroortamlarında immün yanıtı diseksiyon için mikroakışkan ko-kültür modelleri

Burada, nanoakışkan bir cihazda akut olaylar ve üretken HIV-1 enfeksiyonu için tek hücrelerin izlendiği bir protokol sunuyoruz. Görüntüleme verileri virüs konakçısı reseptör etkileşimlerini ve sinyal yolu dinamiklerini tanımlar. Bu, nanoakışkan yüksek verimli boyuna tek hücreli kültür ve görüntülemenin sinyal kinetik ve moleküler etkileşimleri incelemek için ilk yöntemidir.

Multiparametre Optofluidik Platform Kullanılarak Kalsiyum Akını ve HIV-1 Enfeksiyonunun Tek Hücreli Karakterizasyonu

Klinik mikroakışkan çip, klinik hasta kan numunesinin ön işlenmesini basitleştiren ve çip üzerinde yerinde dolaşan tümör hücrelerini (CTC'ler) yerinde boyayarak tek bir CTC'nin hızlı bir şekilde tespit edilmesini ve tanımlanmasını sağlayan önemli bir biyomedikal analiz tekniğidir.

Çok Yönlü Dolaşımdaki Tümör Hücrelerinin İzolasyonu için Klinik Mikroakışkan Çip Platformu

Burada, tek hücre düzeyinde hücre öldürmeyi incelemek için bir T hücresini ve bir kanser hedef hücresini kapsülleyen çift emülsiyon damlacıkları oluşturmak için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, büyük bir T hücresi popülasyonu içinde hem sitotoksik moleküllerin hem de hedef hücre apoptozunun ikili miktar tayinine izin verir.

Kimerik Antijen Reseptörü T hücrelerini Tek Hücre Düzeyinde Değerlendirmek için Damlacık Bazlı Sitotoksisite Testi

Dolaşımdaki tümör hücreleri (CTC'ler), kanserin ilerlemesi ve metastazının incelenmesi için kritik öneme sahiptir. Bu makale, CTC zenginleştirme ve tek CTC dizilimi için yüksek verimli, entegre bir protokol sunmakta, kontaminasyon ve dizileme maliyetlerini azaltırken yakalama verimliliğini ve CTC saflığını artırmakta, böylece hassas onkoloji araştırmalarını ve klinik uygulamaları ilerletmektedir.

Mikroakışkan Tabanlı Yüksek Verimli Dolaşımdaki Tümör Hücresi Sıralama ve Tek Hücre Dizileme Teknolojisi

Keşfedin, PDMS tabanlı mikroakışkan cihaz kullanarak hasta kanından CD4 pozitif T yardımcı lenfositleri yakalama ve nicelendirme yöntemini. Bu teknik, kaynak sınırlı ortamlarda HIV tanısı için yüksek hassasiyet sağlar.

CD4 + T-Lenfosit Yakalama HIV için Disposable mikroakışkan Chip

Daha fazla video keşfet