Zebra Balığı Retina Rejenerasyonu Sırasında Müller Glial Nükleer Migrasyonunun Canlı Hücre Görüntülemesi

Transgenik bir zebra balığından elde edilen agaroza gömülü bir dorsal retinal eksplant ile başlayın, besiyeri olan bir florodish içine monte edin.

Retina, ışığa bağlı fotoreseptör hasarı sergiler ve GFP'yi eksprese eden çekirdeklere sahip Muller glial hücreleri veya MGC'ler içerir.

Çanağı çok fotonlu bir mikroskop odasına yerleştirin.

Parlak alan aydınlatmasını kullanarak retinaya odaklanın.

MGC'leri bulmak için floresan moduna geçin.

Ganglion hücre katmanından veya GCL'den dış nükleer katmana veya ONL'ye bir z-yığını yapılandırın.

Canlı görüntülemeye başlayın.

Hasarlı fotoreseptörler, MGC'leri aktive ederek TNF-α serbest bırakır.

MGC çekirdekleri, DNA'larını çoğaltmak için temel olarak iç nükleer tabaka veya INL içinde göç eder.

Daha sonra, çekirdekler mitoz geçirmek için apikal olarak ONL'ye göç eder ve nöronal progenitörler üretir.

Mitozdan sonra, MGC çekirdekleri ve progenitörleri temel olarak INL'ye geri göç eder.

Atalar çoğalır, yaralanma bölgesine göç eder ve fotoreseptörlere farklılaşarak retina rejenerasyonunu sağlar.

Nükleer göçü görselleştirmek için yakalanan görüntüleri analiz edin.

Görüntü alma yazılımında A1 MP GUI, TiPad, A1 Compact GUI ve ND Acquisition pencerelerini açın. Çoklu foton görüntüleme için, A1 Kompakt GUI penceresinde IR NDD Seçeneğinin seçildiğinden emin olun. Ardından, ayar alanında, ilk dikroik ayna için IR-DM'yi seçin ve GFP floresansı elde etmek için bant geçiren filtrenin 525 ila 50 olarak ayarlandığını kontrol edin.

Ardından, A1 MP GUI penceresindeki IR lazeri açın. Lazerin hazır olması birkaç dakika sürecektir. Bundan sonra, GFP floresansını uyarmak için dalga boyunu 910 nanometreye ayarlayın ve Otomatik Hizalama düğmesine tıklayarak lazeri hizalayın.

Retina kültürünü çoklu foton mikroskobu aşamasına yerleştirdikten sonra, fotoçoğaltıcı tüpün aşırı maruz kalmasını önlemek için deklanşörü açmadan önce oda ve ekipman ışıklarının kapalı olduğundan emin olun. Gürültü seviyelerini azaltmak için mikroskobu karanlık bir ortamda saklayın.

Tarama Alanı penceresinde ayarlanan 2 yakınlaştırmada 300 x 300 piksellik bir görüş alanının ve A1 Kompakt GUI penceresinde seçilen piksel başına 4,8 mikrosaniyelik bir piksel kalma süresinin görüntülerini elde edin. A1 MP GUI penceresindeki alım alanını ve A1 Compact GUI penceresindeki kazancı değiştirerek lazer gücünü kabaca ayarlayın.

Şimdi, ganglion hücre katmanına odaklanın ve ND Edinme penceresindeki Z alt penceresindeki z yığınının üst odak düzlemini ayarlayın. Odak düzlemini, iç nükleer katmandaki muadillerine göre yuvarlak ve genişlemiş loş etiketli GFAP ve GFP pozitif hücrelerin varlığı ile karakterize edilen dış nükleer katmanın seviyesi boyunca hareket ettirin.

Bu düzlemi z yığınının en alt kısmı olarak ayarlayın. Ardından, z adım boyutunu 0,7 ila 1 mikrometre arasında ayarlayın. Z yoğunluğu düzeltmesini ayarlamak için Z Yoğunluğu Düzeltme penceresini açın ve z yığını aralığını ayarlamak için ND'den'i seçin. Ardından, Z Yoğunluk Düzeltme penceresindeki alt odak düzlemine tıklayın ve lazer yoğunluğunu ve kazancını ayarlayın.

Daha sonra, seçilen odak düzlemi için Z Yoğunluk Düzeltme penceresindeki Cihaz Ayarları altında daha sonra gösterilen ayarları onaylamak için Z Yoğunluk Düzeltme penceresindeki z değerlerinin yanındaki oka tıklayın. İşlemi orta ve üst düzlemler için tekrarlayın, lazer gücünü ve kazancını artırın.

A1 MP GUI penceresinde çekim alanını ayarlayın ve foto ağartmayı ve artan gürültü seviyelerini atlatmak için görüntülemenin başlangıcında 15'ten büyük bir çekim alanı ve 126'dan yüksek bir kazanç seçmekten kaçının. Ardından, Z Yoğunluk Düzeltme penceresinde bağıl yoğunluk düzeltmesini seçin. ND Alma penceresinin zaman serisi alt penceresinde, süreyi sekiz saate ve aralığı gecikme yok olarak ayarlayın. Ardından, 3B zaman serilerini almak için ND Alma penceresinin Z-Stack alt penceresindeki Z Düzeltmesini Çalıştır'a tıklayın.