Ambalaj HIV veya FIV tabanlı Lentivector İfade Yapıları & VSV-G Pseudotyped Viral Parçacıklarının İletimi

Bu prosedürün genel amacı, lentiviral paketleme hakkında bilgi edinmektir. Beş günlük bir protokol. İlk gün, 2 9 3, TN üretici hücreleri hesaplanan bir yoğunlukta kaplanır.

İkinci gün, hücreler, ilgilenilen geni ve viral paketleme plazmid karışımını içeren tercih edilen lenti vektör yapısı ile transfekte edilir. Dördüncü günde, viral sat hasat edilir ve PEG virüsü çökeltme çözeltisi eklenerek konsantre edilir. Prosedürün son adımları, PEG konsantre virüsünü hasat etmek, virüsü alikot etmek ve viral titreme için hücreleri konsantre virüsle enfekte etmektir.

Sonuç olarak, kararlı entegre genlerin kantitatif PCR'si, kararlı entegre yapıların sayısını hesaplamak için kullanılır. Bu tekniğin plazma transfeksiyonu veya retroviral transdüksiyon gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, FBI'nin optimize edilmiş lentivirüs paketleme protokolünün, kök hücreler ve bölünmeyen birincil hücreler gibi transfekte edilmesi zor hücreler de dahil olmak üzere hemen hemen her memeli hücresine verimli bir şekilde verilmesini sağlayan yüksek titreli işlevsel olarak aktif virüs üretmesidir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, yüksek titre virüsünün başarılı bir şekilde üretilmesi için gerekli olan küçük protokol detaylarına aşina olmadıkları için mücadele edeceklerdir.

Transfeksiyon sırasında mikroskopla görselleştirilen hücre yoğunluğu, nihai viral titreyi belirleyen viral paketlemenin verimliliğini belirlediğinden, bu yöntemin görsel gösterimi yararlıdır. Uygulanabilir floresan raportör ekspresyonunun, nihai viral titre üzerinde önemli bir etkiye sahip olan transfeksiyonun etkinliğini belirlediği durumlarda. Ek olarak, bu yöntemin görsel gösterimi, araştırmacıların, tüm süreç boyunca steriliteyi korumak için en iyi uygulamalar ve hasat edilen virüse hücre kalıntılarının dahil edilmesinden nasıl kaçınılacağı gibi protokolün ince ama önemli kısımlarına aşina olmalarına yardımcı olur.

Verimli lentiviral paketleme üç bileşene dayanır. İlk olarak, lentiviral ekspresyon vektörü, virüs paketleme ve kararlı entegrasyon için gerekli elementlerin yanı sıra ilgilenilen genin ekspresyonu için elementleri içermelidir. Kısa saç tokası, RNA, mikro RNA veya bir muhabir kaseti.

İkincisi, lentiviral paketleme plazmitleri, ekspresyon yapısının bir RNA kopyasını rekombinant psödoviral partiküllere paketlemek ve ardından enfeksiyon üzerine ters transkripsiyon ve virüs entegrasyonu için gerekli proteinleri sağlamalıdır. Üçüncü olarak, 2 9 3 TN üretici hücreleri, ekspresyon ve paketleme vektörleri ile geçici olarak kesilmelidir. Bu hücreler, kültür ortamından hasat edilecek yüksek titreler olan yalancı viral partiküller üretir.

Sonuç olarak, hedef hücrelerin başarılı bir şekilde transdüksiyonu çoğunlukla belirli bir hücre tipi için hücre başına düşen viral partikül sayısına bağlıdır. Başka bir deyişle, enfeksiyonun çokluğu 2 9 3 TN hücresinin büyümesiyle başlar. % 60 ila 80 co akıcılığı elde etmek için 18 ila 24 saat boyunca 15 santimetre hücre kültürü plakalarında.

Transfeksiyon sırasında, her plaka virüs verimini artırmak için yaklaşık 14 milyon hücre verecektir. Ertesi gün 2 9 3 TN hücreleri %60 ila 80 oranında birleştiğinde birden fazla plaka kullanılabilir, transfeksiyon için hazırdırlar. Her hücre plakası için, 15 mililitrelik bir şahin tüpüne 1.6 mililitre, serumsuz DMEM ekleyin.

Daha sonra DMEM'e 22.5 mikrogram ppac H one veya Ppac F1 ve 4.5 mikrogram lenti vektör Yapınızı ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Daha sonra, aynı tüpe 55 mikrolitre saf sevgi ekleyin ve 10 saniye boyunca girdap yapın, ardından 15 dakikalık bir oda sıcaklığında inkübasyon yapın. 15 dakika sonra, her kültür plakasına bir tüp ekleyin.

Damla damla daha sonra plakayı hafifçe döndürün, ardından hücreleri 48 saat sonra %5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede 48 saat inkübe edin. Lenti vektör yapısı GFP gibi bir floresan geni ifade ediyorsa, hücreleri mikroskop altında kontrol edin, başarılı bir transfeksiyon %50 ila %90'dan fazla yeşil floresan hücre verecektir, şimdi hücre kültürü süpernatanını 50 mililitrelik konik bir tüpe toplar. Süpernatant, bulaşıcı yalancı viral parçacıkları içerir.

Plakadan çekilen herhangi bir hücre, virüs üretimini olumsuz yönde etkilemeyecektir. Enkaz santrifüjünü çıkarmak için, viral süpernatan oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 1500 G'de. Daha sonra, peleti rahatsız etmeden, yaklaşık 500 mikrolitre süpernatan oluşan bir tampon bıraktığınızdan emin olarak viral süpernatanı toplayın ve viral partikülleri transfeksiyondan 72 saat sonra konsantre etmek olan bir sonraki adıma geçin.

Viral süpernatın isteğe bağlı ikinci bir koleksiyonu, viral sat toplandıktan sonra aynı teknik kullanılarak yapılabilir. 50 mililitrelik bir polipropilen santrifüj tüpünde her dört hacim süpernatanıma bir hacim buz gibi soğuk peg virüsü çökeltme çözeltisi eklenerek konsantre edilir. Karıştırmak için çözeltiyi ters çevirin.

Asla bir girdap kullanmayın, ardından çözeltiyi 96 saate kadar dört santigrat derecede çalkalamadan saklayın. En az 12 saatlik soğutmadan sonra, karışımı 1500 G'de dört santigrat derecede 30 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, peggo çökeltilmiş lentiviral parçacıklar, tüpün dibinde bej veya beyaz bir pelet olarak görünecektir.

Şimdi, peletteki çökelmiş lentiviral partikülleri rahatsız etmeden dikkatli bir aspirasyon ile tüm sıvı izlerini çıkarın. Alternatif olarak, supra natinin çoğunu çıkarın ve peleti kalan supinatta yeniden süspanse edin. Daha sonra süspansiyonu steril iki mililitrelik bir einor tüpüne aktarın ve tüpü iki dakika boyunca soğuk bir mikro füje santrifüjleyin.

14.000 RPM'de kalan süpernatanı pipetleyin ve lentiviral parçacık peletini buz, soğuk, steril tamponda 10'da bir ila 100'de bir oranında yeniden süspanse edin. Orijinal hacim, peleti herhangi bir kabarcık oluşturmadan dikkatlice çözeltiye pipetleyin ve her zaman soğuk tutun. Peletin tamamen yeniden askıya alındığından emin olun.

Son olarak, 15 ila 25 mikrolitre alikot mürekkebi, buz üzerinde steril kriyojenik şişeler yapın ve şişeleri eksi 70 santigrat derecede saklayın. Başarılı bir paketleme çalışması, 24 oyuklu bir kültür plakası plakasında, kuyu başına 50.000 hücrede virüs iletimi için mililitre başına 10 milyon ila 1000 milyon IFU verecek ve bunları belirtilen kültür koşullarında gece boyunca büyütecektir. Hücreler, titreme amacıyla transdüksiyon için% 50 ila% 70 arasında birleşmiş olmalıdır.

HT 10 80 hücreleri, ertesi gün hücrelerden ortamı aspire etmek için kolay bir transdüksiyon kontrol hücresi hattı olarak kullanılabilir. Daha sonra kültür ortamını konsantre ördek çözeltisi ile birleştirin. Bu nedenle, trans ördeklerin nihai konsantrasyonu bir x'tir, hedef hücrelerle% 50 ila 70 Co akıcılığı doğru yoğunlukta hedef hücrelerle her bir oyuğa yarım mililitre transdüksiyon ekleyin, sonraki seyreltmelerde, bir ila 100, bir ila 10 ve düz bire bir seyreltme.

Virüs, ortamı değiştirmeden 72 saate kadar hedef hücrelerle temas halinde kalabilir. 72 saat sonra, provirüs konakçı genomuna kararlı bir şekilde entegre olacak ve ilgilenilen geni ifade edecektir. Farklı virüs seyreltmeleri ile transdüksiyon verimliliğini tahmin etmek için mevcut floresan işaretleyici ekspresyonu kullanılabilirse, enfeksiyöz birimlerin sayısı QPCR ile ölçülebilir.

Virüs titresi bilindikten sonra, diğer hedef hücreler için istenen enfeksiyon miktarını elde etmek için uygun virüs hacmini hesaplayın. Titrenin ölçülmesi ve MOI'nin kontrol edilmesi, deneyler ve farklı viral hazırlıklar arasında tutarlılık sağlar. Virüs artık ek deneylerde kullanıma hazırdır.

2 9 3 TN hücrelerinin başlangıç yoğunluğu, transfeksiyon gününde başarılı viral paketleme için kritikti. Bu 2 9 3 TN hücreleri %60 ila %80 arasında birleşikti. GFP'yi eksprese eden bir lenti vektörü ile başarılı bir transfeksiyondan 24 saat sonra, 2 9 3 TN hücrelerinin en az% 90'ının yeşil floresan gösterdiği bulundu.

Transdüksiyondan 72 saat sonra GFP, HT 10 80 konak hücrelerinde eksprese olmaya devam etti. Bu, konakçı genomuna stabil bir şekilde entegre olan lentiviral yapının, aynı konakçı hücreleri on kat seyreltmede dönüştürerek, GFP'nin ekspresyonunu orantılı olarak azalttığını gösterir. Çünkü viral titre ile lentiviral aracılı gen ekspresyonu arasındaki ilişki doğru orantılıdır.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde yapılırsa, günde yaklaşık bir ila iki saat olmak üzere beş günlük bir süre boyunca yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, işlevsel olarak bulaşıcı viral partiküllerin verimli ve güvenli bir şekilde nasıl paketleneceğini ve virüsle başarılı bir şekilde transdüksiyon hücrelerinin nasıl işleneceğini iyi anlamış olmalısınız. Lentivirüs ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve BSL iki doku kültürü başlığında çalışmak gibi önlemlerin tehlikeli olabileceğini unutmayın.

Bu işlem yapılırken her zaman laboratuvar önlüğü ve eldiven giyilmelidir.