Ambalaj HIV veya FIV tabanlı Lentivector İfade Yapıları & VSV-G Pseudotyped Viral Parçacıklarının İletimi

Bu prosedürün genel amacı lentiviral paketleme hakkında bilgi edinmektir. Beş günlük bir protokol. İlk günde, 2 9 3, TN üretici hücreler hesaplanmış bir yoğunlukta ekilir.

İkinci günde, hücreler ilgilenilen geni içeren seçilen lenti vektör konstrüktü ve viral paketleme plazmid karışımı ile transfekte edilir. Dördüncü günde, viral supernatant toplanır ve PEG virüs çöktürme solüsyonu eklenerek konsantre edilir. Prosedürün son adımları, PEG ile konsantre edilmiş virüsün toplanması, virüsün alikotlara ayrılması ve viral titrasyon için hücrelerin konsantre virüs ile enfekte edilmesidir.

Nihayetinde, stabil olarak entegre edilmiş genlerin kantitatif PCR'ı, stabil entegre konstrükt sayısını hesaplamak için kullanılır. Bu tekniğin plazma transfeksiyonu veya retroviral transdüksiyon gibi mevcut yöntemlara göre temel avantajı, FBI'ın optimize edilmiş lentivirüs paketleme protokolünün, kök hücreler ve bölünmeyen primer hücreler gibi transfeksiyonu zor hücreler de dahil olmak üzere hemen hemen her memeli hücreye etkili iletim sağlayan, yüksek titreli ve fonksiyonel olarak aktif virüs üretmesidir. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, yüksek titreli virüsün başarılı üretimi için temel teşkil eden küçük protokol detaylarına aşina olmadıkları için zorluk yaşarlar.

Transfeksiyon sırasında mikroskop altında gözlemlenen hücre yoğunluğu, final viral titreyi belirleyen viral paketleme verimliliğini etkilediği için bu yöntemin görsel gösterimi faydalıdır. Uygulanabilir olduğu durumlarda, floresan raporlayıcı ekspresyonu, final viral titre üzerinde önemli bir etkisi olan transfeksiyon verimliliğini belirler. Ayrıca, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi, araştırmacıların tüm süreç boyunca steriliteyi korumaya yönelik en iyi uygulamalar ve hasat edilen virüse hücre kalıntısı karışmasını önleme yolları gibi protokolün küçük ancak önemli ayrıntılarıyla aşina olmalarına yardımcı olur.

Etkin lentiviral paketleme üç bileşene dayanır. İlk olarak, lentiviral ekspresyon vektörü, ilgilenilen genin ekspresyonu için gerekli elementlerin yanı sıra, virüs paketleme ve stabil entegrasyon için gerekli olan bazı elementleri içermelidir. Kısa saç tokası (short hairpin), RNA, mikro RNA veya bir raporlayıcı kaset.

İkinci olarak, lentiviral paketleme plazmidleri, ekspresyon konstrüktünün bir RNA kopyasının rekombinant psödoviral partiküllere paketlenmesi ve ardından enfeksiyon sonrası ters transkripsiyon ve virüs entegrasyonu için gerekli proteinleri sağlamalıdır. Üçüncü olarak, 2 9 3 TN üretici hücreleri, ekspresyon ve paketleme vektörleri ile geçici olarak birlikte transfekte edilmelidir. Bu hücreler, kültür ortamından toplanacak yüksek titreli psödoviral partiküller üretir.

Nihayetinde, hedef hücrelerin başarılı bir şekilde transduksiyonu, büyük ölçüde belirli bir hücre tipi için hücre başına düşen viral partikül sayısına bağlıdır. Diğer bir ifadeyle, enfeksiyon multiplisitesi; %60 ila %80 konfluens elde etmek için 2 9 3 TN hücrelerini 15 santimetrelik hücre kültürü plaklarında 18 ila 24 saat boyunca büyüterek başlatılır.

Transfeksiyon sırasında, virüs verimini artırmak amacıyla her plak yaklaşık 14 milyon hücre verecektir. 2 9 3 TN hücreleri %60 ile %80 oranında konfluente ulaştıklarında transfeksiyona hazır hale gelirler ve ertesi gün birden fazla plak kullanılabilir. Her bir hücre plağı için, 15 mililitrelik bir falcon tüpüne 1,6 mililitre serumsuz DMEM ekleyin.

Ardından, DMEM'e 22,5 µg ppac H one veya Ppac F1 ve 4,5 µg lenti vektör konstrüktünüzü ekleyin ve pipetleme yaparak karıştırın. Daha sonra, aynı tüpe 55 µL saf affection ekleyin ve 10 saniye boyunca vortekslenmiş ardından 15 dakika oda sıcaklığında inkübasyona bırakın. 15 dakika sonra, her bir kültür plağına birer tüp ekleyin.

Damla damla ekleyin ve ardından plakayı nazikçe çalkalayın, sonrasında hücreleri 37 °C'de %5 karbon dioksit içeren ortamda 48 saat boyunca inkübe edin. Eğer lenti vektör yapısı GFP gibi floresan bir gen eksprese ediyorsa, hücreleri mikroskop altında inceleyin; başarılı bir transfeksiyon %50 ile %90'ın üzerinde yeşil floresan hücre oluşumunu sağlar; şimdi hücre kültürü süpernatantını 50 mL'lik konik bir tüpe toplayın. Süpernatant, enfeksiyöz psödoviral partikülleri içerir.

Plaktan ayrılan herhangi bir hücre, virüs üretimini olumsuz etkilemeyecektir. Kalıntıları uzaklaştırmak için viral süpernatantı oda sıcaklığında 1500 G'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, pellete dokunmadan, süpernatanttan yaklaşık 500 microliters tutacak şekilde bir tampon payı bıraktığınızdan emin olarak viral süpernatantı toplayın ve transfeksiyondan 72 saat sonra viral partikülleri konsantre etme aşaması olan bir sonraki adıma geçin.

Viral durum toplandıktan sonra, aynı teknik kullanılarak viral süpernatantın isteğe bağlı ikinci bir toplaması yapılabilir. 50 mililitrelik polipropilen santrifüj tüpünde, her dört birim süpernatanta bir birim buz gibi soğuk peg virüs çöktürme çözeltisi ekleyerek konsantre edin. Çözeltiyi karıştırmak için ters çevirin.

Asla vorteks kullanmayın, ardından çözeltiyi çalkalamadan dört derece Celsius'ta 96 saate kadar saklayın. En az 12 saatlik soğutmanın ardından, karışımı dört derece Celsius'ta 1500 G'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, peggo ile çöktürülmüş lentiviral partiküller tüpün dibinde bej veya beyaz bir pelet şeklinde görünecektir.

Şimdi, pellet halindeki çökmüş lentiviral partiküllerile bozmadan, dikkatli bir aspirasyonla tüm sıvı kalıntılarını uzaklaştırın. Alternatif olarak, süpernatantın çoğunu uzaklaştırın ve pelletini kalan süpernatant içerisinde yeniden süspanse edin. Ardından süspansiyonu steril iki mililitrelik bir Eppendorf tüpüne aktarın ve tüpü soğuk bir mikrofüjde iki dakika boyunca santrifüjleyin.

14.000 RPM'de, kalan süpernatantı pipetle uzaklaştırın ve lentiviral partikül peletini, orijinal hacmin onda birine veya yüzde birine denk gelecek miktarda buz gibi soğuk, steril tampon çözelti içerisinde yeniden süspanse edin. Kabarcık oluşturmadan peleti dikkatlice çözeltiye pipetleyin ve işlem boyunca soğuk tutun. Peletin tamamen yeniden süspanse edildiğinden emin olun.

Son olarak, buz üzerinde steril kriyojenik tüplere 15 ile 25 µL'lik mürekkep alikotları hazırlayın ve tüpleri -70 °C'de saklayın. Başarılı bir paketleme işlemi, 24 kuyucuklu kültür plakasında, kuyucuk başına 50.000 hücre olacak şekilde virüs transdüksiyonu için mililitre başına 10 milyon ile 1000 milyon IFU sağlayacaktır; bunları belirlenen kültür koşullarında gece boyunca büyütün. Titrasyon amaçlı transdüksiyon için hücreler %50 ile %70 arasında konfluen olmalıdır.

HT 10 80 hücreleri, transdüksiyonu kolay bir kontrol hücre hattı olarak kullanılabilir; ertesi gün hücrelerdeki medyumu aspire edin. Ardından, transdüksiyonların nihai konsantrasyonu 1x olacak şekilde, kültür medyumunu konsantre ördek çözeltisi ile birleştirin. Hedef hücrelerin %50 ila %70 konfluensle doğru yoğunlukta bulunduğu her bir kuyucuğa yarım mililitre transdükt ekleyin. Virüsü her bir kuyucuğa şu dilüsyonlarda ekleyin: 1/100, 1/10 ve doğrudan 1/1 dilüsyonu.

Virüs, besiyeri değiştirilmeden 72 saate kadar hedef hücrelerle temas halinde kalabilir. 72 saat sonra provirüs, konak genomuna stabil bir şekilde entegre olmuş olacak ve ilgili geni eksprese edecektir. Eğer mevcut floresan marker ekspresyonu farklı virüs dilüsyonlarıyla transdüksiyon verimliliğini tahmin etmek için kullanılabiliyorsa, enfeksiyöz ünite sayısı QPCR ilele belirlenebilir.

Virüs titresi belirlendikten sonra, diğer hedef hücreler için istenen enfeksiyon çokluğuna ulaşmak için uygun virüs hacmini hesaplayın. Titrenin ölçülmesi ve MOI'nin kontrol edilmesi, deneyler ve farklı viral hazırlıklar arasında tutarlılık sağlar. Virüs artık ek deneylerde kullanılmaya hazırdır.

Transfeksiyon gününde başarılı viral paketleme için 2 9 3 TN hücrelerinin başlangıç yoğunluğu kritikti. Bu 2 9 3 TN hücreleri %60 ile %80 arasında konfluendi. GFP eksprese eden bir lenti vektör ile yapılan başarılı bir transfeksiyondan 24 saat sonra, 2 9 3 TN hücrelerinin en az %90'ının yeşil floresans gösterdiği tespit edildi.

Transduksiyondan 72 saat sonra, HT 10 80 konak hücrelerinde GFP ekspresyonu devam etmiştir. Bu durum, lentiviral konstrüktün konak genomuna stabil bir şekilde entegre olduğunu göstermektedir; aynı konak hücrelerin on kat seyreltme ile transdukse edilmesi, GFP ekspresyonunu orantılı olarak azaltmıştır. Bunun nedeni, viral titer ile lentiviral aracılı gen ekspresyonu arasındaki ilişkinin doğrudan orantılı olmasıdır.

Bu teknikten yeterince hakim olunduğunda, uygun şekilde uygulandığı takdirde günde yaklaşık bir ila iki saat ayırılarak beş günlük bir süreçte tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, fonksiyonel olarak enfektif viral partiküllerin verimli ve güvenli bir şekilde nasıl paketleneceği ve hücrelerin virüsle nasıl başarılı bir şekilde transduksiyon edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Lentivirüsle çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve BSL 2 doku kültürü hodi gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.

Bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman laboratuvar önlüğü ve eldiven giyilmelidir.