Name: Ambalaj HIV veya FIV tabanlı Lentivector İfade Yapıları and VSV-G Pseudotyped Viral Parçacıklarının İletimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Öğrenin, lentiviral paketleme protokolünü kullanarak yüksek titreli viral parçacıklar üretin ve memeli hücrelerine etkili gen aktarımı sağlayın. Bu yöntem bölünen ve bölünmeyen hücrelerde stabil gen ifadesi için güvenilir bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz bu protokollerin geliştirme ve test verdikleri destek için SBI az personel ve bilim adamları kabul etmek istiyorum.

1. Ambalaj Plazmidler ile 293TN Hücreleri transfeksiyonu ve Expression Construct <ol><li> Tohum 7,0-8,0 x 10 4 mM L-glutamin, 4,5 g / l glukoz ve antibiyotikler olmadan fetal sığır serumu (% 10) ile desteklenmiş DMEM ortamı içeren kültür aracı maddesi 20 ml 15 cm 2 kültürü plakası başına 6 293TN hücreleri. Hücre yoğunluğu transfeksiyon sırasında konfluent% 60-80 ulaştığında, böylece 2 CO% 5 ile 37 ° C'de 18-24 saat boyunca büyür. Bazı durumlarda, hedef hücrelerin transdüksiyonu için yeterince yüksek bir titresi elde etmek için hücre tohumu birkaç plakaları için gerekli olabilir. </li><li> Her bir hücre plakası, bir otoklav 2 ml Eppendorff tüpüne 1.6 ml serum içermeyen DMEM ekleyebilir. Lütfen lentivector 45 ul pPACKH1 veya pPACKF1 ve 4.5 mikrogram aşağı pipetleme tarafından DMEM ve karıştırın inşa ekleyin. </li><li> Aynı tüpe PureFection 55 ul ekleyin. 10 saniye vorteksleyin. Oda sıcaklığında f DMEM-Plazmid-PureFection karışımı inkübeya da 15 dak. </li><li> Doku kültürü plakası eşit plaka boyunca dağıtmak için hafifçe açılır bilge ve girdap DMEM-Plazmid-PureFection karışımı ekleyin. Inkübatöre çanak dönün ve% 5 CO 2 ile 37 ° C'de büyür. </li><li> Transfeksiyondan sonra ortamı değiştirmek için gerek yoktur. Lütfen lentivector yapı GFP gibi bir floresan proteini kodlayan bir gen ifade varsa, 12-24 saat transfeksiyondan sonra mikroskop altında hücrelerin kontrol edin. Sen transfeksiyon başarılı olduğunu belirten,&gt;% 90 GFP pozitif hücreler görmek gerekir. </li><li> 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne steril bir hücre kültürü 48 sonrası supernatant toplamak ve 72 saat. Bu, hücre kültür yüzey artık bulaşıcı pseudoviral parçacıklar içerir. Pelet oda sıcaklığında 15 dakika hücresel enkaz 1.500 xg'de (BSL-2 emniyet sınıfı ile çalışmak için önerilen yönergeleri izleyin.) Santrifüj. Pelet bozmayacak sağlayacak yeni tüp için viral süpernatant aktarın. </li><li> Viral ambalaj için kullanılmış olan hücre, bir 293TN biohazard kap içinde elden ve viral ambalaj daha tur için kullanılmak üzere değildir edilmelidir. </li></ol> 2. Viral Süpernatant konsantrasyonu <ol><li> 1 soğuk hacmi (4 ° C) lentiviral parçacık içeren süpernatant her 4 cilt için PEG-it Virüs Yağış Çözüm. Ekle Büyük miktarlar lentiviral parçacıkların Çökelti Corning 250 ml polipropilen santrifüj tüpü ile elde edilebilir. Ters tüpler tarafından bir kaç kez çözeltisi karıştırın, fakat karışımı vorteks yoktur. </li><li> (4 güne kadar kabul edilebilir), en azından 12 saat boyunca 4 ° C sıcaklıkta çözelti soğutmak. Sallamayın veya soğutma adım sırasında tüpleri döndürmeyin. </li><li> 4 de 30 dakika boyunca 1500 x g'de süpernatan / PEG-it karışımı santrifüje ° C. Santrifüjünden sonra lentiviral parçacıklar tüp alt kısmında bir bej veya beyaz bir pelet şeklinde görünür. Supernata dökmeknt. </li><li> Pelet içinde çöken lentiviral parçacıklar rahatsız özen, aspirasyon sıvısı tüm izlerini silmek. Izleri kalıntı PEG-it virüsü seyreltik edecek (böylece titresi azaltarak) fakat PEG-etkisiz ve toksik olmayan yana hedef hücrelerin bütünlüğü etkilemez. </li><li> Yeniden süspanse ve (4 ° C) kullanılarak soğuk orijinal hacminin 1/100 içinde lentiviral parçacıklar birleştirmek, steril fosfat tamponlu salin ya da DMEM 25 mM HEPES tampon içeren. </li><li> Kullanıma hazır olana kadar steril kriyojenik flakon ve -70 ° C mağaza içine tablet. </li></ol> 3. Hedef Hücre Viral Titering ve İletimi <ol><li> Biz hedef hücrelerin-of-ilgi transducing ve deneyler arasında tutarlılık için hedef hücreler için enfeksiyon uygun çokluğu (İçişleri Bakanlığı) hesaplamadan önce lentiviral parçacıklar titering öneririz. Viral titering için, bir kolay enfekte pozitif kontrol hattı olarak HT1080 hücreleri kullanmanızı öneririz. Pltitering protokolü paketledim lentiviral parçacıkların küçük bir kısım ile HT1080 hücreleri transducing içerdiğini unutmayın kolaylığı. Titresi bilinmektedir sonra, hedef hücreler-of-ilgi de üretilen lentiviral partikülleri ile transdük edilebilir. : Bir tavsiye titering protokol bulunabilir <a href="http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf" target="_blank">http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf</a> 7. </li><li> Hücre kültür ortamına bir 24-iyi plaka iyi başına Plaka 50.000 hedef hücrelerin-of-faiz. Hücreler normalde belirtilen kültür koşullarında in kültüre hücrelerin gecede büyümek olduğunu ortamları kullanın. Hücreler transdüksiyon gününde konfluent% 50 ile 70 arasında olmalıdır. </li><li> Transdüksiyon gününde, hücrelerden medya aspire. Bir 1 x nihai konsantrasyon (örneğin, 2.5 ul TransDux üzere 500 ul kültür ortamı) ile TransDux ile kültür ortamı birleştirir. Sonra TransDux-ce aktarmakher oyuğa ll kültür ortamı karışımı. </li><li> Her oyuğuna hedef hücreler için MOI optimum tekabül virüsünün uygun hacimde Pipeti. Optimum MOI bilinmiyorsa, farklı Mois bir dizi (örneğin, bir MOI 1, 2 ve 5 doku kültür hücre kolay-enfekte için, ve bir MOI daha zor-etmek için 1, 10 ve 20 olarak çalışan önermektedir ) birincil hücreleri enfekte. Lentiviral parçacıkların konsantrasyonu (gibi bir virüs titering protokolü ile belirlenir) bilinmiyorsa, virüsün farklı birimleri gibi virüs 1, 2 ve 5 ul olarak, denenebilir. Virüs 72 saate kadar için hedef hücreler ile temas halinde kalabilmektedir. </li><li> Ile daha da deneyler hedef hücreler-of-ilgi transdük viral yapı konak hücrenin genomu içine entegre sonra, transdüksiyon 72 saat sonra başlatılabilir. Kendi özel ihtiyaçlarına göre hücre-of-ilgi orta ve geçit hedef değiştirin. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar <p293tn h class='"jove_step"&gt;' transfeksiyon> 293TN hücrelerin başlangıç ​​yoğunluğu başarılı viral ambalaj için önemlidir. 293TN hücrelerinin transfeksiyonu gün (Şekil 2)% 60 -80 arasındaki konfluent olmalıdır. 293TN hücrelerin% 60 konfluent daha az varsa, onları transfeksiyon başlamadan önce bir kaç saat daha büyümeye olanak sağlar. 293TN hücreleri&gt;% 80 konfluent olduklarında, transfeksiyondan önce kaplandı edilmelidir. Bir lentivector ifade GFP kullanılıyorsa, 293TN hücrelerin en az% 90, başarılı bir transfeksiyon (Şekil 3) gösteren, transfeksiyondan 24 saat sonra, yeşil floresan gerekir. Hücrelerin% 90'ından daha az GFP-olumlu ise, bu transfeksiyon olabilecek şekilde başarılı olmadığı gösterir, ve viral titreleri düşük olacaktır, çünkü, sonraki adıma değildir. Bunun yerine, plaka yeni 293TN hücreleri ve transfekte önce 293TN hücrelerin uygun hücre yoğunluğu az olduğundan emin olarak, baştan başlamak. 293TN hücreleri 48-72 saat transfeksiyondan sonra doku kültürü plakaları çekip olabilir. Bu olumsuz lentiviral partiküllerin üretimi etkilemez. HT1080 Hücreleri ile Titering Viral titreleri üreticinin talimatlarına göre SBI Küresel ultrahızlı bireylerde Titering kiti kullanılarak hesaplanabilir. Bu sistem, hücreleri içine HT1080 lentiviral vektöründen WPRE sekansının viral entegrasyonu ölçmek için qPCR kullanmaktadır ve doğru bir ml için enfeksiyöz birimi (Şekil 4) ölçmek için bir genomik dizisi referans dayanan, bir standart eğri ile kıyaslar. Hedef Hücre İletimi Bir yapısal olarak aktif GFP işaretleyici ifade lentiviral parçacıklar kullanıyorsanız transdüksiyon reaksiyon çalışıyorsa, GFP pozitif hücrelerin, iletimi 12-24 saat içinde görünmeye başlayacaktır. Lentiviral yapı stabil t entegre sonra GFP devam etmeliO hücre genomu ev sahipliği yapacak. Farklı Mois ile transducing ise, GFP floresans yaklaşık İçişleri Bakanlığı, düşük Mois GFP floresans (Şekil 5) artış gösterirler az GFP floresans ve yüksek Mois gösterin eşleşmesi gerekir. <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Viral üretim protokol bakış. Lentivector ve pPACK ambalaj plazmidler karıştırılır ve 293TN hücrelerine birlikte transfekte edilir. 48 -72 saat sonra, süpernatan viral toplanır, ve viral partiküllerin PEG-it ile çökeltilir. Lentiviral parçacıklar titering sonra, hücre-of-faiz hedef transdüksiyonu için kullanılabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3171/3171fig1large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> 293TN hücrelerinin Şekil 2. Faz kontrastlı görüntü. Hücre Density% 60-80 konfluent transfeksiyon gününde arasında olmalıdır. <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. 24 saat Purefection, pPACKH1, ve bir kodlama GFP lentivector yapı ile transfeksiyondan sonra GFP-pozitif hücrelerinin 293TN Fluorescent görüntüsü. <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4. WPRE qPCR sonuçlar ve İçişleri Bakanlığı ve ambalajlı viral parçacıkların ilgili titresi hesaplamak için SBI Küresel ultrahızlı bireylerde Titering kiti kullanılarak elde edilen standart eğri. <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5,"> HT1080 hücre Şekil 5. Floresan görüntüleri lentivirüs artan miktarlarda ile transdük. Görüntüler 72 saat sonrası transdüksiyon gelmektedir. </p293tn>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22RNA+Viruses.+A+Practical+Approach%22">RNA Viruses. A Practical Approach</a>. Cann, A. J. , Oxford Univ. Press. (2000).</li>
<li>Gould, D. J., Favorov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vectors+for+the+treatment+of+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Vectors for the treatment of autoimmune diseases.</a> Gene Therapy. 10, 912-927 (2003).</li>
<li>Naldini, L., Blomer, U., Gage, F. H., Trono, D., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transfer%2C+integration%2C+and+sustained+long-term+expression+of+the+transgene+in+adult+rat+brains+injected+with+a+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Efficient transfer, integration, and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 11382-11388 (1996).</li>
<li>Naldini, L., Blomer, U., Gallay, P., Ory, D., Mulligan, R., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272, 263-267 (1996).</li>
<li>Dull, T., Zufferey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).</li>
<li>Federico, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFederico%2C+M+%22Lentivirus+Gene+Engineering+Protocols%22">Lentivirus Gene Engineering Protocols</a>. , Humana Press. New Jersey. (2003).</li>
<li>Curran, M. A., Kaiser, S. M., Achacoso, P. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transduction+of+nondividing+cells+by+optimized+feline+immunodeficiency+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficient transduction of nondividing cells by optimized feline immunodeficiency virus vectors.</a> Mol. Ther. 1, 31-38 (2000).</li>
<li> Manual Titer Kit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf">http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf</a> (2011).</li>
<li>Kahlig, K. M., Saridey, S. K., Kaja, A., Daniels, M. A., George, A. L. Jr, Wilson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+transposon-mediated+stable+gene+transfer+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343-1348 (2010).</li>
<li>Kim, A., Pyykko, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+matters%3A+versatile+use+of+PiggyBac+transposons+as+a+genetic+manipulation+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Size matters: versatile use of PiggyBac transposons as a genetic manipulation tool.</a> Mol. Cell Biochem. , (2011).</li>
<li>NIH Office of Biotechnology Activities. Guidance on Biosafety Considerations for Research with Lentiviral Vectors. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidance/LentiVirus_Containment/pdf/Lenti_Containment_Guidance.pdf">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidance/LentiVirus_Containment/pdf/Lenti_Containment_Guidance.pdf</a> (2011).</li>
</ol>

Bu video makaleye Üretim ve Serbest Erişim Sistemi Biosciences tarafından desteklenmektedir.

Bu viral ambalaj ve hedef hücreleri protokol iletimi SBI viral ambalaj reaktifleri ile kullanım için optimize edilmiştir. Diğer ajanların ikamesi protokol sonucu etkileyebilir. Bu protokol, sadece lentiviral üretimi için optimize edilmiş ve virüsler veya pseudoviruses diğer tip üretilmesi için uygun olmayabilir. Başarılı viral ambalaj birkaç önemli adım bağlıdır. 293TN hücrelerin hücre kültür yüzey içine lentiviral parçacıkların salgılanması için mutlaka gerekli olan SV40 büyük T antijeni eksprese eder. 293TN hücreler transfeksiyondan sırasında hangi az yoğunlukta yeterince hücrelerine lentivector ve ambalaj plazmidler aktarmak için PureFection reaktifin için özellikle önem taşımaktadır. Iyice plakası girdapladıktan takiben bir damla-akıllı şekilde doku kültür levhasına PureFection karışımı ekleme ambalaj plasmidlerin dağıtılması için önemlidirve lentivector hücrelerin tümü boyunca inşa. Uygun vektörler dağıtmak için yetmezliği üretilen yetersiz lentiviral partikülleri ile sonuçlanabilir. Viral ambalaj reaksiyon doku kültür plakaları yüzey alanı üzerine dayanan, yüksek titresi virüsünün üretimi için büyütülebilir. Bir paketlenmiş gereken yapı başına 293TN hücre plakası çeşitli doku kültürü yemekleri seçebilirsiniz. Viral süpernatantları konsantrasyonu yüksek titrede virus oluşturmada özellikle yararlıdır. Hücrelerinin birden plakalardan viral süpernatan bir araya getirilmiş ve in vivo deneyler içinde kullanım için konsantre edilebilir, veya transdüksiyonu için zordur hücreleri için. Üretilen lentiviral parçacıklar Titering hedef hücrelerin transdüksiyonu için kullanılacak MOI doğru bir hesaplanması için de önemlidir. Belirli bir iletim kullanılabilir olduğunu bilmek MOI transdüksiyon başarılı olmadığı durumlarda giderme sağlar. Örneğin, bir MOI olduğu kullanılarakçok düşük bir yapı-of-ilgi eksprese eden çok az Hedef hücrelerin sebep olabilir. Bir MOI çok yüksek olduğu kullanarak, ancak, stres belirtilerini gösteren hedef hücreler ile sonuçlanabilir. Hedefi, bir MOI hücrelerinin sağlığı korurken yapı-of-ilgi ifadesi maksimize olduğu kullanmaktır. Bu HT1080 hücrelerinde lentiviral yapı ile entegre bir kopya ölçen bir qPCR bazlı titering protokolü önermektedir iken, diğer titering yaklaşımlar, aynı zamanda örneğin p24 ELISA veya GFP-pozitif hücrelerin yüzdesi tahmin edilmesi gibi, kullanılabilirler. Hedef hücrelerin Başarılı iletimi de birkaç önemli faktöre bağlıdır. TransDux yüksek iletim verimliliği sağlayan benzersiz bir enfeksiyon reaktif olduğunu, ancak hücreleri için toksik değildir. TransDux genellikle hedef hücreler için toksik olup polybrene, yerine kullanılabilir. Hedef hücrelerin transdüksiyonu TransDux dahil edilmesi, viral partiküllerin üzerindeki yükleri nötralize etmek için yardımcı olur ve hücre içine virüsü olanaks. TransDux hücrelere toksik değildir, çünkü bu nedenle tek bir olasılığını arttırır lentiviral partiküller 72 saate kadar (viral yapıları konak hücre genomunun içine bütünleşik olan süreyi) etmek için hücre ile temas içinde kalmalarının izin verebilir viral parçacıkların hücreye girerek. Bazı zor olan iletiminde hücreleri için transductions transdüksiyon etkinliğini artırmak için izleyen günlerde tekrar edilebilir. Örneğin, 1. günde hücreleri transdüksiyonu, hücrelerin gün 2 dayanmasına izin ve sonra 3. günde tekrar hücreleri transdüksiyonu. Bu, hedef hücrelerin seçimini başlangıcında, başka deneyler ya karakterizasyonu önce son transdüksiyon sonra 72 saat beklemek için önemlidir. Verimli viral ambalaj 5 &#39;ve 3&#39;LTR bölgeler arasında, aynı zamanda lentiviral yapı boyutuna bağlıdır. Lentiviral yapının Bu bölüm, yerli HIV genomunun boyutu karşılık yaklaşık 9 kb veya daha az, olmalıdır. 9 kb mayıs de aşılmasıüretilen pseudoviral parçacıkların kırışıklık titresi. Yeni teknoloji, böyle piggyBac transpozon vektörler gibi, kadar tek bir transfeksiyon ile 100 kb transgenlerin güvenilir, istikrarlı bir entegrasyon için izin verir. Bu yaklaşım, hedef hücre transferinde mümkündür durumlarda lentiviral vektörler için boyut sınırı, aşan yapılar için kullanılan ve viral bir ambalaj adım 9,10 gerek kalmadan ek bir avantaj sağlar olabilir. Bu protokol kullanılarak üretilen pseudoviral parçacıklar çoğu memeli hücre tipleri bulaşabileceğini de bulaşıcıdır. Bu protokolde kullanılan ürünler, ancak bunlar non-kopyelenebilir ve kendinden inaktive pseudoviruses üreten üçüncü nesil biosafe vardır. Bu nedenle, bir hedef hücre ya da hayvanlarda enfeksiyöz veya bulaşıcı olmayan hedef hücre ya da hayvanlarda, içine transdük. Bir biyogüvenlik tavsiye edilen olmamakla birlikte, üçüncü nesil biosafe olmayan başka lentivector plasmidlerin ikamesi mümkündürbakış açısı. Viral üretim protokolü ve hedef hücrelerin sonraki transdüksiyon NIH yönergelere 11 göre, Biyogüvenlik Seviyesi 2 altında yapılmalıdır ve viral parçacıkların tutarken araştırmacıların her zaman bir laboratuvar önlüğü ve eldiven giymelidir. İkinci 293TN üreticisi hücreler, viral parçacıkların, ve tek kullanımlık pipetler tüpleri uygun bir biyolojik tehlikeli kaba atılmalıdır. Yeniden pipetler ve cam suyu ile dekontamine ve personelin maruz azaltmak için otoklav edilmelidir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> DMEM Yüksek Glukoz Orta </td><td> Gibco </td><td> 11995-073 </td><td></td></tr><tr><td> 293TN Hücreleri </td><td> SBI </td><td> LV900A-1 </td><td></td></tr><tr><td> pPACKH1 </td><td> SBI </td><td> LV500A-1 </td><td> HIV-bazlı lentivectors için </td></tr><tr><td> pPACKF1 </td><td> SBI </td><td> LV100A-1 </td><td> FIV bazlı lentivectors için </td></tr><tr><td> Herhangi lentiviral vektör </td><td> SBI </td><td> Çeşitli </td><td> cDNA, shRNA, mikroRNA, transkripsiyon gazetecilere </td></tr><tr><td> PureFection </td><td> SBI </td><td> LV750A-1 LV750A-5 </td><td></td></tr><tr><td> PEG-it </td><td> SBI </td><td> LV810A-1 LV825A-1 </td><td></td></tr><tr><td> Küresel ultrahızlı bireylerde Titering kiti </td><td> SBI </td><td> LV961A-1 </td><td> Bu protokolde tarif fakat viral partiküllerin titresi için gerekli değildir </td></tr><tr><td> TransDux </td><td> SBI </td><td> LV850A-1 </td><td></td></tr></tbody></table>

ambalaj hiv veya fiv tabanlı lentivector İfade yapıları &amp; vsv-g pseudotyped viral parçacıklarının İletimi

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Standart plazmid vektörler de olduğu gibi, bu efektörlerinin geçici ifade elde etmek için düşük-orta verimlilik ile hücrelere plazmid formunda lentivectors transfekte etmek mümkündür. Pseudoviral partiküller halinde ambalaj lentiviral ifade yapıları, buna karşın, primer, gövde ve farklılaşmış hücreler olarak zor olan transfekte hücreleri ile,% 100 transdüksiyon kadar sağlar. Dahası, tipik olarak bu tür dağıtım lentiviral transfeksiyon reaktifi 1, 2 toksisitesi kaynaklanan hücre ölümü gibi kimyasal Transfeksiyonlar, ile ilişkili özel hücresel yanıtları üretmemektedir. Hedef hücrelere transdük zaman, lentiviral yapı genomik DNA entegre ve küçük bir firkete RNA (shRNA), cDNA, mikroRNA ya da reporter gene 3, 4 ve stabil ifadesi sağlar. Stably efektör molekülü ifade hedef hücreler gibi ekspresyon vektörü puromycin veya GFP olarak inşa içinde bulunan bir seçilebilir işaretleyici kullanılarak izole edilebilir. Sonra psViral yapısal genler bulunmadığı ve uzun terminali tekrarlar (LTR) transdüksiyonu 5, 6 halinde kendi kendine inaktive olacak şekilde tasarlanmıştır, çünkü eudoviral parçacıkların hücreleri enfekte hedefi, bunlar hedef hücreler içindeki çoğaltmak olamaz. Verimli lentiviral ambalaj 1, 5, 6, 7 için gerekli olan üç ana bileşen vardır. <ol><li> Ambalaj için gerekli olan genetik öğeleri içeren bazı lentiviral ifade vektörü, viral ifade stabil entegrasyon genomik DNA oluşturmak ve efektör ya da reporter ifadesi. </li><li> Ifade RNA kopyası transkripsiyonu ve paketleme için gerekli proteinleri sağlamak lentiviral ambalaj rekombinant plazmid pseudoviral parçacıklar halinde inşa. Bu protokol viral kat protein için HIV veya FIV genomu ve veziküler stomatit Virüs gr protein (VSV-G) pPACK gag şifreleyen plazmit (SBI), pol, ve devir kullanır. </li><li> 293TN üretmek<html> Yüksek titresi lentiviral üretimi ve bakım için hücreler yeniden oluşturulması için kullanışlı bir neomisin direnç geni, gereklidir SV40 büyük T antijen, hücre ifade r (HEK293 hücrelerden türetilmiş). </li></ol> Viral üretimi protokolünün bir genel görünüşü Şekil 1&#39;de görülebilir. Viral üretimi lentiviral ekspresyon vektörü ve ambalaj plazmit ile ko-transfekte 293TN yapımcı hücreleri tarafından başlatılır. Viral partiküllerin ortam içine salgılanan. 48-72 saat sonra, hücre kültür ortamı hasat edilir. Hücre döküntüleri hücre kültür ortamından kaldırılır ve viral partiküllerin konsantrasyonu için PEG-onunla santrifüj yoluyla çökeltilir. Üretilen lentiviral parçacıklar daha sonra titre edilmiştir ve hedef hücreler transdüksiyonu için kullanılabilir. Viral titering detayları bu protokol dahil değildir, fakat bulunabilir: ank &quot;&gt; http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf 8. Bu protokol, gösterilen özel ürünleri kullanılarak optimize edilmiştir. Diğer reaktifler ikame edilebilir, fakat aynı sonuçlar garanti edilemez.

Lentiviral ifade vektörlerinin stably memeli hücreleri ve tüm organizma bölünmesi ve non-bölünmesi farklı efektör moleküller ya da reporter yapıları ifade etmek için en etkili araçlardır. Burada pseudoviral parçacıklar lentivector ifade yapıları paketlemek için ve pseudoviral parçacıkları kullanarak hedef hücreleri transdüksiyonu için nasıl bir protokol sağlar.

Ambalaj HIV veya FIV tabanlı Lentivector İfade Yapıları &amp; VSV-G Pseudotyped Viral Parçacıklarının İletimi

Standart plazmit vektörlerinde olduğu gibi, geçici... elde etmek için lentivektörlerin plazmit formunda hücrelere düşük ila orta verimlilikle transfekte edilmesi mümkündür.

Bu prosedürün genel amacı lentiviral paketleme hakkında bilgi edinmektir. Beş günlük bir protokol. İlk günde, 2 9 3, TN üretici hücreler hesaplanmış bir yoğunlukta ekilir.İkinci günde, hücreler ilgilenilen geni içeren seçilen lenti vektör konstrüktü ve viral paketleme plazmid karışımı ile transfekte edilir. Dördüncü günde, viral supernatant toplanır ve PEG virüs çöktürme solüsyonu eklenerek konsantre edilir. Prosedürün son adımları, PEG ile konsantre edilmiş virüsün toplanması, virüsün alikotlara ayrılması ve viral titrasyon için hücrelerin konsantre virüs ile enfekte edilmesidir.Nihayetinde, stabil olarak entegre edilmiş genlerin kantitatif PCR'ı, stabil entegre konstrükt sayısını hesaplamak için kullanılır. Bu tekniğin plazma transfeksiyonu veya retroviral transdüksiyon gibi mevcut yöntemlara göre temel avantajı, FBI'ın optimize edilmiş lentivirüs paketleme protokolünün, kök hücreler ve bölünmeyen primer hücreler gibi transfeksiyonu zor hücreler de dahil olmak üzere hemen hemen her memeli hücreye etkili iletim sağlayan, yüksek titreli ve fonksiyonel olarak aktif virüs üretmesidir. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, yüksek titreli virüsün başarılı üretimi için temel teşkil eden küçük protokol detaylarına aşina olmadıkları için zorluk yaşarlar.Transfeksiyon sırasında mikroskop altında gözlemlenen hücre yoğunluğu, final viral titreyi belirleyen viral paketleme verimliliğini etkilediği için bu yöntemin görsel gösterimi faydalıdır. Uygulanabilir olduğu durumlarda, floresan raporlayıcı ekspresyonu, final viral titre üzerinde önemli bir etkisi olan transfeksiyon verimliliğini belirler. Ayrıca, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi, araştırmacıların tüm süreç boyunca steriliteyi korumaya yönelik en iyi uygulamalar ve hasat edilen virüse hücre kalıntısı karışmasını önleme yolları gibi protokolün küçük ancak önemli ayrıntılarıyla aşina olmalarına yardımcı olur.Etkin lentiviral paketleme üç bileşene dayanır. İlk olarak, lentiviral ekspresyon vektörü, ilgilenilen genin ekspresyonu için gerekli elementlerin yanı sıra, virüs paketleme ve stabil entegrasyon için gerekli olan bazı elementleri içermelidir. Kısa saç tokası (short hairpin), RNA, mikro RNA veya bir raporlayıcı kaset.İkinci olarak, lentiviral paketleme plazmidleri, ekspresyon konstrüktünün bir RNA kopyasının rekombinant psödoviral partiküllere paketlenmesi ve ardından enfeksiyon sonrası ters transkripsiyon ve virüs entegrasyonu için gerekli proteinleri sağlamalıdır. Üçüncü olarak, 2 9 3 TN üretici hücreleri, ekspresyon ve paketleme vektörleri ile geçici olarak birlikte transfekte edilmelidir. Bu hücreler, kültür ortamından toplanacak yüksek titreli psödoviral partiküller üretir.Nihayetinde, hedef hücrelerin başarılı bir şekilde transduksiyonu, büyük ölçüde belirli bir hücre tipi için hücre başına düşen viral partikül sayısına bağlıdır. Diğer bir ifadeyle, enfeksiyon multiplisitesi; %60 ila %80 konfluens elde etmek için 2 9 3 TN hücrelerini 15 santimetrelik hücre kültürü plaklarında 18 ila 24 saat boyunca büyüterek başlatılır.Transfeksiyon sırasında, virüs verimini artırmak amacıyla her plak yaklaşık 14 milyon hücre verecektir. 2 9 3 TN hücreleri %60 ile %80 oranında konfluente ulaştıklarında transfeksiyona hazır hale gelirler ve ertesi gün birden fazla plak kullanılabilir. Her bir hücre plağı için, 15 mililitrelik bir falcon tüpüne 1,6 mililitre serumsuz DMEM ekleyin.Ardından, DMEM'e 22,5 µg ppac H one veya Ppac F1 ve 4,5 µg lenti vektör konstrüktünüzü ekleyin ve pipetleme yaparak karıştırın. Daha sonra, aynı tüpe 55 µL saf affection ekleyin ve 10 saniye boyunca vortekslenmiş ardından 15 dakika oda sıcaklığında inkübasyona bırakın. 15 dakika sonra, her bir kültür plağına birer tüp ekleyin.Damla damla ekleyin ve ardından plakayı nazikçe çalkalayın, sonrasında hücreleri 37 °C'de %5 karbon dioksit içeren ortamda 48 saat boyunca inkübe edin. Eğer lenti vektör yapısı GFP gibi floresan bir gen eksprese ediyorsa, hücreleri mikroskop altında inceleyin; başarılı bir transfeksiyon %50 ile %90'ın üzerinde yeşil floresan hücre oluşumunu sağlar; şimdi hücre kültürü süpernatantını 50 mL'lik konik bir tüpe toplayın. Süpernatant, enfeksiyöz psödoviral partikülleri içerir.Plaktan ayrılan herhangi bir hücre, virüs üretimini olumsuz etkilemeyecektir. Kalıntıları uzaklaştırmak için viral süpernatantı oda sıcaklığında 1500 G'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, pellete dokunmadan, süpernatanttan yaklaşık 500 microliters tutacak şekilde bir tampon payı bıraktığınızdan emin olarak viral süpernatantı toplayın ve transfeksiyondan 72 saat sonra viral partikülleri konsantre etme aşaması olan bir sonraki adıma geçin.Viral durum toplandıktan sonra, aynı teknik kullanılarak viral süpernatantın isteğe bağlı ikinci bir toplaması yapılabilir. 50 mililitrelik polipropilen santrifüj tüpünde, her dört birim süpernatanta bir birim buz gibi soğuk peg virüs çöktürme çözeltisi ekleyerek konsantre edin. Çözeltiyi karıştırmak için ters çevirin.Asla vorteks kullanmayın, ardından çözeltiyi çalkalamadan dört derece Celsius'ta 96 saate kadar saklayın. En az 12 saatlik soğutmanın ardından, karışımı dört derece Celsius'ta 1500 G'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, peggo ile çöktürülmüş lentiviral partiküller tüpün dibinde bej veya beyaz bir pelet şeklinde görünecektir.Şimdi, pellet halindeki çökmüş lentiviral partiküllerile bozmadan, dikkatli bir aspirasyonla tüm sıvı kalıntılarını uzaklaştırın. Alternatif olarak, süpernatantın çoğunu uzaklaştırın ve pelletini kalan süpernatant içerisinde yeniden süspanse edin. Ardından süspansiyonu steril iki mililitrelik bir Eppendorf tüpüne aktarın ve tüpü soğuk bir mikrofüjde iki dakika boyunca santrifüjleyin.14.000 RPM'de, kalan süpernatantı pipetle uzaklaştırın ve lentiviral partikül peletini, orijinal hacmin onda birine veya yüzde birine denk gelecek miktarda buz gibi soğuk, steril tampon çözelti içerisinde yeniden süspanse edin. Kabarcık oluşturmadan peleti dikkatlice çözeltiye pipetleyin ve işlem boyunca soğuk tutun. Peletin tamamen yeniden süspanse edildiğinden emin olun.Son olarak, buz üzerinde steril kriyojenik tüplere 15 ile 25 µL'lik mürekkep alikotları hazırlayın ve tüpleri -70 °C'de saklayın. Başarılı bir paketleme işlemi, 24 kuyucuklu kültür plakasında, kuyucuk başına 50.000 hücre olacak şekilde virüs transdüksiyonu için mililitre başına 10 milyon ile 1000 milyon IFU sağlayacaktır; bunları belirlenen kültür koşullarında gece boyunca büyütün. Titrasyon amaçlı transdüksiyon için hücreler %50 ile %70 arasında konfluen olmalıdır.HT 10 80 hücreleri, transdüksiyonu kolay bir kontrol hücre hattı olarak kullanılabilir; ertesi gün hücrelerdeki medyumu aspire edin. Ardından, transdüksiyonların nihai konsantrasyonu 1x olacak şekilde, kültür medyumunu konsantre ördek çözeltisi ile birleştirin. Hedef hücrelerin %50 ila %70 konfluensle doğru yoğunlukta bulunduğu her bir kuyucuğa yarım mililitre transdükt ekleyin. Virüsü her bir kuyucuğa şu dilüsyonlarda ekleyin: 1/100, 1/10 ve doğrudan 1/1 dilüsyonu.Virüs, besiyeri değiştirilmeden 72 saate kadar hedef hücrelerle temas halinde kalabilir. 72 saat sonra provirüs, konak genomuna stabil bir şekilde entegre olmuş olacak ve ilgili geni eksprese edecektir. Eğer mevcut floresan marker ekspresyonu farklı virüs dilüsyonlarıyla transdüksiyon verimliliğini tahmin etmek için kullanılabiliyorsa, enfeksiyöz ünite sayısı QPCR ilele belirlenebilir.Virüs titresi belirlendikten sonra, diğer hedef hücreler için istenen enfeksiyon çokluğuna ulaşmak için uygun virüs hacmini hesaplayın. Titrenin ölçülmesi ve MOI'nin kontrol edilmesi, deneyler ve farklı viral hazırlıklar arasında tutarlılık sağlar. Virüs artık ek deneylerde kullanılmaya hazırdır.Transfeksiyon gününde başarılı viral paketleme için 2 9 3 TN hücrelerinin başlangıç yoğunluğu kritikti. Bu 2 9 3 TN hücreleri %60 ile %80 arasında konfluendi. GFP eksprese eden bir lenti vektör ile yapılan başarılı bir transfeksiyondan 24 saat sonra, 2 9 3 TN hücrelerinin en az %90'ının yeşil floresans gösterdiği tespit edildi.Transduksiyondan 72 saat sonra, HT 10 80 konak hücrelerinde GFP ekspresyonu devam etmiştir. Bu durum, lentiviral konstrüktün konak genomuna stabil bir şekilde entegre olduğunu göstermektedir; aynı konak hücrelerin on kat seyreltme ile transdukse edilmesi, GFP ekspresyonunu orantılı olarak azaltmıştır. Bunun nedeni, viral titer ile lentiviral aracılı gen ekspresyonu arasındaki ilişkinin doğrudan orantılı olmasıdır.Bu teknikten yeterince hakim olunduğunda, uygun şekilde uygulandığı takdirde günde yaklaşık bir ila iki saat ayırılarak beş günlük bir süreçte tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, fonksiyonel olarak enfektif viral partiküllerin verimli ve güvenli bir şekilde nasıl paketleneceği ve hücrelerin virüsle nasıl başarılı bir şekilde transduksiyon edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Lentivirüsle çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve BSL 2 doku kültürü hodi gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.Bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman laboratuvar önlüğü ve eldiven giyilmelidir.

packaging-hiv-or-fiv-based-lentivector-expression-constructs

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Lentiviruses yapmak için, DNA vektörleri insan 293 hücrelerine transfekte. Hasattan sonra ve supernatant yoğunlaşarak, virüs titresi bir akış sitometresi ile floresan ifade tarafından belirlenir.

Lentivirüs Üretim

Biz Tat duyarlı LTR ek olarak, bu tür bir lentiviral vektör geliştirdik, HIV-1 Tat ve Rev-bağımlı bir moda muhabiri gen ekspresyonu düzenleyen Rev-yanıt elemanı (RRE). Vektör GFP ifadesi üzerinden canlı hücreler kopyalayan HIV özel algılama izin verir.

Yeşil Floresan Protein ifade Rev-bağımlı lentiviral Vector kullanarak HIV-1 Olumlu Hücreler Özgül İşareti

Lentiviruses genin fonksiyonu keşfetmek için çok değerli bir araştırma aracı; Ancak, araştırmacılar bilinen pantropic lentivirüs kodlama ya da şüphesi onkogenler üretimi önlemek için isteyebilirsiniz. Alternatif olarak, biz ecotropic reseptör mSlc7a1 ifade etmek için modifiye insan hücreleri üzerinde ecotropic lentivirüs kullanmak için daha güvenli bir protokol mevcut.

Biyogüvenlik Geliştirilmiş Polimer complexed Ecotropic lentivirüs İnsan Hücreleri, İletimi

Bu protokolü biz üretim, saflaştırma ve lentiviral vektörlerin titrasyonu açıklar. Biz primer kültürlerinde nöronlar ve astrositlerde lentiviral vektör aracılıklı gen aktarımının bir örnek oluşturmaktadır. Bizim yöntemleri diğer hücre türleri için de geçerli...

Merkezi sinir sisteminin transducing Hücreleri için lentiviral Vektörler Üretimi

Synaptically bağlı nöronların izleme için bir yöntem tarif edilmektedir. Biz bir ilgi hücre popülasyonu tanımlı genetik hücre tiplerinden sinaptik girdi alıp almadığını soruşturma yönündeki bir hücrenin TVA özgüllüğü kullanın.

Genetiği Tanımlı Nöral Devre arasında Tracing Viral

Source: Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the procedure for generating recombinant viral particles by transfecting embryonic kidney cells with plasmids encoding viral proteins and a gene of interest.

Generation of Recombinant Viral Particles Using Embryonic Kidney Cells

Burada, retroviral transdüksiyon ve tetrasiklin yokluğunda bir lentiviral vektör (IV) bileşenleri ifade edebilen bir hücre çizgisi oluşturmak için concatemeric transfeksiyon kullanın. Bu AG GFP kodlar ve dendritik hücreler üzerinde reseptörü için spesifik olan bir glikoprotein, SVGmu ile pseudotyped edilir.

Bir Tetrasiklin düzenlenmiş Hücre Hattı Özellikle dendritik hücreler Hedef Yüksek titre Lentiviral vektörler üretir

Burada, bakulovirüs ya da memeli sentezleme sistemleri ve ultrasantrifügasyon arıtma kullanarak virüs benzeri partiküller sentezlenmesi için bir protokol mevcut. Bu son derece özelleştirilebilir yaklaşım, güvenli ve esnek bir şekilde aşı hedefleri olarak viral antijenleri tanımlamak için kullanılır.

İfade ve Aşılama için Virüs benzeri Parçacıkların saflaştırılması

Bu iletişim kuralı tarafından transcriptionally düzenlenmiş Uyuyan güzel sistem istikrarlı bir gen ilgi entegrasyonu insan genomu ulaşmak için bir yöntem açıklanır. Arızalı lentiviral Vektörler, vitro iletim insan hücre ve moleküler tahlil transduced hücrelerde entegrasyonu hazırlanması rapor edilmektedir.

Transcriptionally düzenlenmiş uyku güzellik sistem entegrasyon arızalı Lentiviral vektör paketlenmiş bir verimli Vitro transpozisyonu yöntemle

DNA epigenome temsil düzenleme güçlü bir tedavi yaklaşımı hedef. Bu iletişim kuralı üretim, arıtma ve toplama tüm-içinde-bir lentiviral vektörlerin İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücre (hiPSC)'epigenome düzenleme uygulamaları için CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene yataklık açıklar-nöronlar türetilmiş.

Pluripotent kök hücre kaynaklı hastalık modelleri lentiviral vektör platformu için Epigenome düzenleme araçları verimli bir şekilde teslim insan içine indüklenen

Periton dokusunda yerleşik makrofajlarda gen fonksiyonunun araştırılması için in vivo, lentiviral vektörler kullanılarak adım adım bir protokol gösteriyoruz.

Farelerde İn Vivo Periton Boşluğu Dokusunda Yerleşik Makrofajların Verimli Gen ve MikroRNA Modülasyonu için Lentiviral Vektör Hazırlığı

Öğrenin, lentiviral paketleme protokolünü kullanarak yüksek titreli viral parçacıklar üretin ve memeli hücrelerine etkili gen aktarımı sağlayın. Bu yöntem bölünen ve bölünmeyen hücrelerde stabil gen ifadesi için güvenilir bir yaklaşım sunar.

Ambalaj HIV veya FIV tabanlı Lentivector İfade Yapıları & VSV-G Pseudotyped Viral Parçacıklarının İletimi

Daha fazla video keşfet