Zebra balığı Tek Hücre Kader Haritalama

Aşağıdaki deneyin genel amacı, zebra balığı embriyolarında seçilen tek hücrelerin kader haritasını ve soy izlemesini gerçekleştirmektir. Bu, kafesli floreseinin yüksek moleküler ağırlıklı dekstrana kimyasal olarak konjuge edilmesiyle elde edilir. Daha sonra, hazırlanan kafesli floresein dekstran, zebra balığı embriyolarına mikro enjekte edilir, bu daha sonra iki foton absorpsiyonu kullanılarak seçilen hücrelerde foto aktive edilir.

Embriyoların foto aktivasyonundan sonra, aktive olmuş hücrelerin kaderini haritalamak için kafessiz floresein dekstranı tespit etmek için immünohistokimyasal analiz yapılır. Sonuç olarak, bu yöntem, foto ile aktive edilen tek hücrelerin soy katkısını ve doku lokalizasyonunu belirlemek için kullanılabilir. Bu tekniğin standart floresan mikroskobu gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, inanç haritalaması için tek hücreleri farklı şekilde etiketlemek için kullanılabilmesidir.

Bu yöntem, gelişimsel biyolojide, farklılaşmamış öncü hücrelerin farklı doku tiplerine nasıl katkıda bulunabileceği gibi temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir, Embriyo montajı ve foto aktivasyon adımlarının yalnızca metin açıklamasına dayalı olarak öğrenilmesi zor olduğu için görsel gösterim kritik öneme sahiptir. Başlamadan önce, kafesli floresein dekstran sentezleyin ve metal folyo kaplı tüplerde saklayın. Daha sonra sentezlenen kafes floresein dekstran ile bir ila iki hücre aşamasında embriyoları mikro enjekte edin.

Embriyolar uygun gelişim aşamasına ulaştıktan sonra, onları kaplayın. Daha sonra kaplanmış embriyoları foto aktivasyon için düşük erime noktalı aerolara monte edin. Ortaya çıkan katılaştığında, LSM beş 10 yazılımını yükleyin.

Beyaz ışık huzmesi yoluna saydam bir sarı filtre yerleştirin ve ardından yeni görüntü tara'yı seçin ve uzman modunu başlat'a tıklayın. Lazer sekmesini seçin, argon demirini ve mi tai lazer kaynaklarını açın. Mi tai dalga boyunu yedi 40 nanometreye ayarlayın.

Ardından, yapılandırma sekmesini seçin. Argonne iyonu ve mi tai lazer için optik yol yapılandırmalarını ayarlayın. Ardından tarama sekmesini seçin.

Hedefi 20 çarpı 0,8 olarak değiştirin. Maksimum ayar moduna, yönteme ve sayıya satır ortalamasına ve sırasıyla bire tıklayarak maksimum tarama hızını ayarlayın, kanallar sekmesi altında, mi tai dışındaki tüm lazer kaynaklarının seçimini kaldırın. Ardından, optik ışın yoluna bir güç ölçer yerleştirin ve ardından sürekli taramayı etkinleştirmek için con düğmesini seçin.

Güç ölçer ortalama 47 miliwatt'lık bir lazer gücü okuyana kadar iletim yüzdesini ayarlayın. Ardından, kanallar sekmesi altındaki durdur düğmesini seçerek taramayı durdurun. Mi tai lazer kaynağının seçimini kaldırın ve argon demirini seçin.

Ardından kanallar sekmesi altındaki hızlı XY düğmesini tekrar seçin, iğne deliğini ayarlayın. Argonne demir lazerin en iyi görüntü kalitesini elde etmesi için kazancı tespit edin, bir ofseti yükseltin ve tekrar yükseltin. Sahne denetleyicisini kullanarak, etkinleştirilecek hücreyi bulun ve ona odaklanın, ardından durdur düğmesine tıklayın Kırpma aracını kullanarak, etkinleştirilmiş hücreyi, mod sekmesinin altındaki kırpma faktörü 50 ile 70 arasında olacak şekilde kırpın.

Ardından kanallar sekmesi altındaki durdur düğmesini seçerek taramayı durdurun. Argon iyon lazerinin seçimini kaldırın ve mod sekmesi altında My Tai lazerini seçin. Tarama hızını 31,46 saniye olarak ayarlayın.

Ardından, seçilen hücrenin kafesli floresein dekstranının iki foton aktivasyonu için taramayı başlatmak için tek düğmeyi seçin. Etkinleştirmeden sonra, kanallar sekmesine gidin ve şimdi mi tai lazerinin seçimini kaldırın ve argon iyon lazerini yeniden seçin. Ardından mod altında, yakınlaştırma faktörünü bir olarak ayarlayın. Önümüzdeki.

Hız başlığı altında, en hızlı tarama hızını ayarlamak için maks düğmesine tıklayın. Fotoğrafla etkinleştirilen bölgeyi gözden geçirmek için hızlı xy'yi seçin. Ardından kanallar sekmesini seçin ve iğne deliğini ayarlayın ve tekrar tespit edin, fotoğrafla etkinleştirilen bölgenin lazerle kesilmediğini kontrol edin.

Fotoğrafla aktive edilmiş embriyoları hazırladıktan sonra, ekteki makalede belirtilen protokolü izleyerek kafessiz floresein dekstran immün tespiti için. Embriyoları PBT'de altı kez ve AP tamponunda iki kez yıkayın. Daha sonra embriyoları AP tamponundaki dokuz oyuklu plakaya aktarın.

Ardından, AP arabelleğini aspire edin ve N-B-T-B-C-I-P ekleyin. N-B-T-B-C-I-P solüsyonunu aspire ederek N-B-T-B-C-I-P leke gelişimini durdurun. Daha sonra embriyoları PBT'de yıkayın.

Şimdi embriyoları kurtarın ve beş dakikalık oda sıcaklığında dönen bir platformda sallayın. Ardından yıkama PBT'sini iki kez daha tekrarlayın. Son olarak, embriyoları %0.6 düşük erime noktalı aroslara monte edin ve dik bir bileşik mikroskop kullanarak foto-aktive hücrelerin görüntülerini elde edin.

Bu şekilde, foto aktivasyondan önce kafesli bir floresein dex iplikçikli mikro enjekte edilmiş zebra balığı embriyosunun solda gösterilen parlak alan görüntüsü ve sağda gösterilen bir floresan görüntü. Burada gösterildiği gibi, embriyo, yedi 40 nanometre dalga boyuna, 31 saniyelik bir tarama süresine ve ortalama 47 miliwatt'lık bir lazer gücüne sahip soldaki parlak alan şeklindeki okla gösterilen somitlerden birinde foto aktive edilmiştir. Sağdaki şekilde, bu şekilde kafessiz floresein dekstrandan fotoaktivasyon sonrası floresan görülebilir.

Kafessiz floresein dekstranın immün boyanması, lateral plakada küçük bir bölge, 10'luk bir mezoderm olarak tasvir edilmiştir. Bu nedenle, akar evresi embriyosu, immün tespit prosedürü kullanılarak önceki şekildekiyle aynı lazer parametreleri kullanılarak foto aktive edildi. Burada okla gösterildiği gibi aktive edilmiş bölge, bu prosedürü takiben minimum arka plan boyaması ile tanımlanabilir.

Etiketli hücrelerin yerini ve kaderini daha iyi karakterize etmek için farklı dokuya özgü belirteçler için immüno boyama gibi ek analizler yapılabilir. Bu tekniği kullanarak, vasküler biyoloji alanındaki araştırmacıların, gelişmekte olan zebra balığı embriyolarında venöz progenitör hücrelerdeki arteriyellerin kökenini incelemelerinin yolunu açıyor. NBT ve BCIP gibi kimyasal reaktiflerle çalışırken bunların son derece tehlikeli olabileceğini ve her zaman eldiven giyilmesi gerektiğini unutmayın.