Name: Zebra balığı Tek Hücre Kader Haritalama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Öğrenin, zebra balığı embriyolarında tek hücre kader haritalama yöntemini kullanarak gelişimsel biyoloji araştırmalarında hücre soyunu ve doku yerleşimini nasıl belirleyebilirsiniz.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz kafesli floresein-dekstran sentezi protokolü sağlayan J. Chen ederim. Bu araştırma Dimes ödülü 5-FY09-78, Amerikan Kalp Derneği ödülünü 09BGIA2090075 yılının Mart tarafından desteklenen ve SS NIH / NHLBI ödülü R01 HL107369-01 özel yaptığı mikroskopi yardım için C. Closson için teşekkür ederim. Edildi

1. Kafesli floresein-dekstran sentezi (Ref uyarlanmıştır. 14) <ol><li> Sodyum ve bir 0.1 M çözelti hazırlayın GKD 2 O. içinde seyreltilmiş bor </li><li> 10 kDa aminodextran 4 mg ölçün ve CMNB-kafesli floresein tüpüne ekleyin. </li><li> CMNB-kafesli floresein tüpüne hazırlanmış sodyum borat çözeltisi (adım 1.1) 500 mcL ekleyin. Karışım çözünmesi için 30 saniye için tüp ve girdap kapak takın. </li><li> Karışım, oda sıcaklığında bir gece boyunca reaksiyona nutator izin verir. Ortam ışığına karışımın maruz kalmasını önlemek için metal görünümlü folyo ile tüp örtün. </li><li> Alt kapağı kapalı bir Zeba desalt spin kolon ve büküm edinin. Santrifüj zaman yönlendirmek için kolon kullanılır sütun üzerinde bir nokta işaretleyin. Bir 15 mL konik Falcon tüp içinde sütun yerleştirin. Not: spin kolon içinde çözüm sütunu tampon olduğunu. </li><li> Desalt spin kolon üzerine üst kapağını gevşetin. Bir centr yılında desalt spin kolon evler 15 ml konik Falcon tüp yerleştirinifuge. Orient işaretlenmiş nokta ile spin kolon (adım 1.4) santrifüj rotor merkezine bakan. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüjleyin tüp. </li><li> Santrifüj sonra, Falcon tüp desalt spin kolon çıkarın. Yoluyla toplanmış akış ve 15 ml konik boru her ikisi de atın. Yeni bir 15 ml konik Falcon tüp alın ve yeni Falcon tüp desalt spin kolon yerleştirin. Not: santrifüjleme sonra, reçine yatağının kolon sıkıştırılmış olmalıdır görünür. Hemen sütunu kullanın. </li><li> Adım 1.3 reaksiyon karışımı (floresein-dekstran kafesli) edinin. Spin kolon kapağını çıkarın ve reaksiyon karışımı aspirat ve desalt spin kolon merkezine yavaşça uygulayın. Reaksiyon karışımı uyguladıktan sonra, spin kolon üzerindeki kapağı değiştirin. </li><li> Bir santrifüj desalt spin kolon evler Falcon tüp yerleştirin. Gibi adım 1.5, santrifüj rotor merkezine bakan İşaretli nokta ile şark spin kolon yapılır. Centrifuge oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 1000 x g'de tüpü. </li><li> Santrifüjlemeden sonra, sarı bir karışım (fluorescein-dekstran kafesli) 15 ml Falcon tüp içinde (yaklaşık 400 ul) alınır. 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne kafesli floresein-dekstran karışımı aktarın. </li><li> Hemen ortam ışığına karışımın maruz kalmasını önlemek için metal görünümlü folyo ile tüp kapağı. Bir Speedvac olarak kafese fluoresein-dekstran karışım Lyophilize. 350 mcL Liyofilizasyon yaklaşık 4 saat sürer. </li><li> Liyofilizasyon tamamen sonra, yaklaşık olarak% 1 arasında bir nihai konsantrasyona GKD 2 O toz (yaklaşık 3 mg) tekrar süspansiyon w / v Kısaca toz askıya vorteks karıştırın. </li><li> Tablet ayrı metal folyo kaplı tüpler içine floresein-dekstran kafesli ve -20 ° C'de saklayın </li></ol> 2. Embriyoların Hasat ve kafesli floresein-dekstran mikroenjeksiyon * Bu işlem zebrafish kullanırhayvan modeli sistem olarak. <ol><li> Gününde enjeksiyon öncesi, zebrafish haçlar 01:01 erkek-kadın veya bölücüler ile tanklarda yetiştiriciliği 2:1 erkek-kadın ya yukarı ayarlayın. </li><li> Ertesi sabah yetiştirme tankı su değiştirmek ve bölücüler çıkarın. Ardından bir 5 mcL 1 X Danieau medya ya da kafes floresein-dekstran, 1/10 seyreltilmiş çalışma çözeltisi (Çözeltilerinin Hazırlanması bakınız) ya da GKD 2 O. hazırlamak Işığa maruz kalmasını önlemek için metal görünümlü folyo ile çalışma çözüm tüp örtün. </li><li> Iğne içine hazırlanmış kafesli fluoresein-dekstran çözeltisi (adım 2.2) pipet. Diseksiyon mikroskop altında uygun bir boyuta iğne ucu kesim önce, beyaz ışık kaynağının önünde şeffaf sarı filtre bir parça yerleştirin. Sarı filtre enjeksiyonlar sırasında flöresein-dekstran spontan uncaging önleyecektir. Oküler göz parça ile bakıldığında, ışık kaynağı sarı görünmesi gerekir. </li><li> Embriyolar toplayın ve bir microi içine Pipetinjection kalıp tepsisi. Floresein-dekstran kafesli 4 nL 3 sunmak için mikroenjeksiyon saati ayarlayın. Diseksiyon mikroskobu altında, şark forseps ile embriyoların ve enjekte (3 ila 4 nL) blastomer hücreleri (blastomer sarısı arabirimi) üssü haline flöresein-dekstran kafesli. Enjeksiyon için embriyo 1 olmalıdır - 2-hücreli aşamada. </li><li> Enjeksiyon sonrası, mikroenjeksiyon kalıp tepsiden embriyolar kaldırmak ve taze balık su içeren temiz bir petri kabına koyun. Metilen mavi% 0.02 az bir nihai konsantrasyonda mantar gelişimini önlemek için balık suyu ilave edilebilir w / v Floresein-dekstran kafesli enjekte arasında uncaging önlemek için metal görünümlü folyo ile petri örtün. </li><li> İlgi hücreleri fotoaktive gerektiğinde bir aşama için enjekte edilen embriyolar kaldırın. Fotoaktivasyon için GKD 2 O. bir% 0.6 düşük erime agaroz solüsyon hazırlanır Tricaine (MS222), embriyo bağlı olarak, düşük erime noktalı agaroz için ilave edilebilir. Bunu yapmak için, 0.0 sulandırmak% 0.0014 arasında bir nihai konsantrasyona kadar düşük erime noktalı agaroz içinde% 2 Tricaine. </li><li> Embriyoların uygun gelişimsel aşamada ulaşır ulaşmaz, forseps ile 1 X Danieau medya dechorionate embriyolar. Dechorionating zaman, şeffaf sarı filtre (adım 2.3) beyaz ışık kaynağının yolunu yerleştirilmiş olduğundan emin olun. </li><li> 37 ° C'ye% 0.6 düşük erime agaroz çözüm ısıtın Bir LABTEK odalı coverglass slayt kuyuya düşük erime agaroz pipetle 1 mL. Dikkatlice alt lamel karşı aşağı bakacak fotoaktive gereken hücreler ile forseps ile düşük erime agaroz ve yönlendirilmesi 4 embriyoların 3 monte. </li><li> Agaroz katılaşmaya bırakın. Katılaşma sonra pipet agaroz üzerinde 1 X Danieau medyanın 1 ml. </li><li> Daha embriyo için 2.9 adımları 2.8 tekrarlayın. </li></ol> 3. Kafesli floresein-dekstran İki fotonun aktivasyon * Bu işlem embriyonun reporte ifade ettiğini varsayarr GFP. Embriyo LSM 510 META NLO mikroskop bağlı argon iyon (488 nm) lazer kaynağı kullanılarak görüntülenebilir. Tek bir GFP pozitif hücre seçilir ve LSM 510 birleştiğinde Mai Tai lazer (femtosaniye lazer) kullanılarak fotoaktive edilir. Prosedür floresan olmayan embriyolar için aynıdır. Alternatif olarak, beyaz ışık Mai Tai lazer kaynağı kullanarak etkinleştirme ve ardından aktive edilmesi, hücre, bulmak için de kullanılabilir. <ol><li> LSM 510 yazılımı yükleyin. Beyaz ışık ışın yolu bir şeffaf sarı filtre yerleştirin. </li><li> Tarama Yeni Resim seçin ve Uzman Modu Başlat'ı tıklatın. </li><li> Lazer sekmesini seçin. Argon iyon (488 nm) ve Mai Tai (femtosecond) lazer kaynağı açın. </li><li> 740 nm Mai Tai dalgaboyu ayarlayın. </li><li> Yapılandırma sekmesini seçin. Argon iyon ve Mai Tai lazer optik yol yapılandırmasını ayarlayın. </li><li> Tara sekmesini seçin. 20X/0.8 için objektif değiştirin. </li><li> Max tıklayarak maksimum tarama hızı ayarlayın. </li><li> Set Mode, Yöntem ve Hat Numara, Ortalama ve 1. </li><li> Kanallar sekmesini kaldırın Mai Tai dışında tüm lazer kaynaklarının altında. </li><li> Optik ışın yolu bir güç ölçer yerleştirin. </li><li> Sürekli tarama etkinleştirmek için Devam düğmesini seçin. </li><li> Güç metre 47 mW ortalama bir lazer güç okuyana kadar iletim% ayarlayın. </li><li> Durdur düğmesini seçerek taramayı durdurun. </li><li> Kanallar sekmesini kaldırın Mai Tai lazer kaynağı ve argon iyon (488 nm) altında seçin. </li><li> Hızlı xy düğmesini seçin. Kanallar sekmesinin altında iğne deliği, dedektör kazanç, amplifikatör ofset, ve en iyi görüntü kalitesini elde etmek için argon iyon lazer yükselteç kazancı ayarlayın. </li><li> Sahne denetleyici kullanarak, bulmak ve etkinleştirmek için hücre odaklanmak. </li><li> Durdur düğmesine tıklayın. </li><li> Mod sekmesi altında yakınlaştırma faktörü 50 ile 70 görüntüler kadar aktif hücre üzerinde yakınlaştırma aracı, yakınlaştırma kullanma. </li><li> Durdur düğmesini seçerek taramayı durdurun. </li><li> Kanallar sekmesini kaldırın argon iyon las altındave er (488 nm) Mai Tai lazer seçin. </li><li> Mod sekmesi altında 31.46 sn tarama hızını ayarlayabilirsiniz. </li><li> Seçilen hücrenin floresein-dekstran Kafeste iki-foton aktivasyonu için tarama başlatmak için tek düğmesini seçin. </li><li> Sonra aktivasyon seçimini kaldırın Mai Tai Kanallar sekmesi altında lazer ve yeniden seçme argon iyon lazer (488 nm). </li><li> 1 Mod altında yakınlaştırma faktörünü ayarlayın ve hızlı tarama hızını ayarlamak için başlığı Hız altında Max düğmesini tıklatın. </li><li> Fotoaktive bölgeyi incelemek için Hızlı xy seçin. Fotoaktive bölgeye lazer ablasyon olmadığını kontrol edin. Lazer ablasyon hakkında daha fazla bilgi için, tartışma bölümüne bakın. </li><li> Diğer embriyolar için yukarıdaki adımları tekrarlayın. </li></ol> 4. Uncaged floresein-dekstran İmmuno (Ref uyarlanmıştır. 16) <ol><li> Photoativation sonra, beyaz ışık kaynağının önünde şeffaf bir sarı filtre yerleştirin ve elle l her bir embriyo çıkarınkeskin forseps kullanarak ow erime agaroz. Taze 1 X Danieau medya içeren yeni bir petri tüm kaldırıldı embriyolar yerleştirin. Işığa embriyoların maruz kalmasını önlemek için metal görünümlü folyo ile petri örtün. </li><li> Gerekirse istenen gelişim aşamasına embriyolar, arka. Bu arada, (Çözeltilerin Hazırlanması bakınız)% 4 paraformaldehid solüsyon hazırlanır. Bir mikrosantrifüj tüp içine hazırlanmış paraformaldehid arasında kısım 1.5 ml. </li><li> Embriyoların ilgi gelişim aşamasına ulaşmış sonra, mikrosantrifüj tüp (adım 4.2 'dan itibaren) içine embriyolar Pipeti. Işığa maruz kalmasını önlemek için metal görünümlü folyo ile tüp örtün. </li><li> 4. gece boyunca tüp Nutate ° C. Ertesi gün için fosfat tamponu (PBS) ve GKD 2 O derecelendirildi etanol (EtOH) çözümler hazırlamak;% 30 EtOH: PBS,% 50 EtOH: PBS,% 70 EtOH: GKD 2 O ve% 100 EtOH. </li><li> Ertesi gün, 4 ° C arasında embriyolar çıkarmak Tüp kaplayan metal folyoyu çıkartın ve hızlı para kapalı aspireformaldehye (embriyolar kaplayacak kadar küçük bir hacim geride bırakmak). % 30 lik EtOH pipetle 1.5 mL: tüp içine PBS ile yıkandı. Metal görünümlü folyo ile tüp yeniden kapsamaktadır. 10 dakika için oda sıcaklığında tüp Nutate. </li><li> 4,5, 70 50 ile ve% 100 EtOH çözümler derecelendirildi adımı yineleyin. % 100 EtOH yıkamadan sonra, 10 dakika için% 100 EtOH içinde yeniden embriyolar durulayın. </li><li> Yıkamadan sonra, -20 ° C'de gece boyunca embriyolar depolamak Ertesi gün için fosfat (PBT; Çözeltilerin Hazırlanması bakınız) aranın tamponlu hazırlamak, 5 X engelleme tampon (Hazırlık üreticisi protokol bakın), maleik asit (Hazırlık protokolü engelleme tampon protokol bulunabilir), 10 mg / ml proteinaz K, ve bir 10 x antikor çözeltisi (Anti-florosin AP-; Çözeltilerinin Hazırlanması bakınız). </li><li> PBT seyreltilir; Ayrıca kuzu serum (Çözeltilerin Hazırlanması bkz. LS)% 2 hazırlar. 4 de antikor Mağaza ° C gecede bir nutator sallayarak. % 2 LS 4 ° C'de muhafaza edilebilir </li><li> Ertesi gün embriyolar kaldırmak-20 ° C'den Tüp kaplayan metal folyoyu çıkartın ve hızlı% 100 EtOH kapalı aspire. Tüp GKD 2 O:% 70 EtOH 1.5 mL ekleyin. Metal görünümlü folyo ile tüp yeniden kapsamaktadır. 10 dakika için oda sıcaklığında tüp Nutate. </li><li> 4.8 kullanılarak 50 ve% 30 EtOH çözümleri derecelendirildi ve% 100 PBT adımı yineleyin. % 100 PBT yıkamadan sonra, 10 dakika için% 100 PBT olarak embriyolar daha fazla 3 kez yıkayın. </li><li> Embriyoların 24 saatten daha yaşlı iseniz, proteinaz K onları tedavi. Değilse, 4.13 adıma geçin. Bunu yapmak için, PBT Hazırlanan proteinaz K (adım 4.7) 1:1000 sulandırmak. Embriyoların büyükseniz 10 dakika veya daha uzun süre proteinaz K embriyolar inkübe edin. Işığa maruz kalmasını önlemek için metal görünümlü folyo ile kaplanmıştır embriyolar tutun. </li><li> Proteinaz K tedaviden sonra, 10 dakika için PBT içinde embriyoların 5 kez yıkayın. Yıkamadan sonra, bir nutator oda sıcaklığında 30 dakika için% 4 paraformaldehit içinde embriyolar düzeltmek. Daha sonra, hemen 10 dakika PBT içinde embriyoların 5 kez yıkayın. Embriyolar tutunışığa maruz kalmasını önlemek için metal görünümlü folyo ile kaplanmıştır. </li><li> 1 X. PBT gelen embriyolar çıkarın ve 1 X tampon engelleme yerleştirmek için maleik asit tampon tampon engelleme 5 X sulandırarak engelleme tampon yapın. Metal folyo ile, embriyoları örtün ve 5-6 saat için oda sıcaklığında onları nutate. </li><li> 65 de ısı şoku, embriyolar engelleme 15-20 dakika için ° C. 5-6 saat sonra </li><li> Antikor çözeltisi ve bir önceki gün hazırlandı% 2 LS elde edilir. Max rpm antikor çözüm santrifüjleyin. % 2 LS tüp için sulu faz transfer edin. Karıştırmak için Tüpü ters çevirin. </li><li> LS-antikor karışımı tampon engelleme embriyolar transfer. Işığa maruz kalmasını önlemek için metal görünümlü folyo ile kaplanmıştır embriyolar tutun. 4 ° C'da gece boyunca embriyolar Nutate. </li><li> Ertesi gün, 6 kez, PBT içinde 15 dakika için oda sıcaklığında embriyolar yıkayın. AP tamponu (Çözeltilerin Hazırlanması bakınız) hazırlayın. </li><li> AP met içinde 10 dakika için oda sıcaklığında 2 kez yıkayın embriyolarffer. NBT / BCIP gelişmekte çözeltisi (Çözeltilerin Hazırlanması bakınız) hazırlayın. </li><li> NBT / BCIP için embriyolar transfer. Leke karanlıkta geliştirmek için izin ver. </li><li> 5 dakika her embriyolar PBT 3 kez yıkanarak gelişimini durdurur. </li><li> Görüntü alımı için% 0.6 düşük erime agaroz veya% 3 metilselüloz embriyolar monte ve bir ters veya dik bileşik mikroskop kullanılarak görüntü elde. </li><li> Fotoaktive örnekleri derecelendirilmiş bir EtOH yıkama onları dehydrating gelecek analizi (boyama sabit kalır) saklanabilir. Örnekleri dehydrating 4.7 adımları 4.4 izleyin. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: <img src="/files/ftp_upload/3172/3172fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Floresein-dekstran kafesli bir Fotoaktivasyona. (A, B) ve aydınlık fotoaktivasyon önce 13/14-somite aşamada bir yan görünümdür zebrafish embriyo floresan imaj. (C, D) Embriyo fotoaktive edildi740 nm dalga boyuna sahip Somitlerin (ok) bir t the13/14-somite aşamasında, 31 saniye saati ve 47 mW ortalama bir lazer güç tarayın. Post-aktivasyonu, (d) Uncaged floresein-dekstran dan floresan gözlemlenmiştir. Oryantasyon: Dorsal (sağda), ventral (solda). Ölçek çubuğu 100 mikron. <img src="/files/ftp_upload/3172/3172fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2,"> Şekil 2. Floresein-dekstran kafesli bir İmmuno. Şekil 2 18/19 hpf zebrafish embriyo Uncaged floresein-dekstran immün gösteriyor. 10-somite aşamada embriyo küçük bir bölgeye Şekil 1'de belirtilen aynı lazer parametreleri kullanarak lateral plaka mezoderm faaliyete geçmiştir. İmmuno prosedürü kullanarak, ok en az arka plan boyama yöntemi ile, aktive edilmiş bölgesini tanımlar. Oryantasyon: Dorsal (üst), ventral (alt). Ölçek çubuğu 100 mikron.

<ol><li>Mathur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mEosFP-based+green-to-red+photoconvertible+subcellular+probes+for+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">mEosFP-based green-to-red photoconvertible subcellular probes for plants.</a> Plant physiology. 154, 1573-1587 Forthcoming.</li>
<li>Wiedenmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EosFP%2C+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 15905-15910 (2004).</li>
<li>Subach, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+mCherry+for+high-resolution+two-color+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy.</a> Nature. 6, 153-159 (2009).</li>
<li>Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+tracking+using+a+photoconvertible+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein.</a> Nature protocols. 1, 960-967 (2006).</li>
<li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12651-12656 (2002).</li>
<li>Watanabe, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-organelle+tracking+by+two-photon+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+express%22%5BJournal%5D)">Single-organelle tracking by two-photon conversion.</a> Optics express. 15, 2490-2498 (2007).</li>
<li>Warga, R. M., Kane, D. A., Ho, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+embryonic+blood+in+zebrafish%3A+multi-+and+unipotential+lineages+are+segregated+at+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">Fate mapping embryonic blood in zebrafish: multi- and unipotential lineages are segregated at gastrulation.</a> Developmental cell. 16, 744-755 (2009).</li>
<li>Chudakov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kindling+fluorescent+proteins+for+precise+in+vivo+photolabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling.</a> Nature. 21, 191-194 (2003).</li>
<li>Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mKikGR%2C+a+monomeric+photoswitchable+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein.</a> PloS ONE. 3, e3944-e3944 (2008).</li>
<li>Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+KikGR+a+photoconvertible+green-to-red+fluorescent+protein+for+cell+labeling+and+lineage+analysis+in+ES+cells+and+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos.</a> BMC developmental biology. 9, 49-49 (2009).</li>
<li>Stark, D. A., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+comparison+of+photoactivatable+fluorescent+proteins+in+an+avian+embryo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">An in vivo comparison of photoactivatable fluorescent proteins in an avian embryo model.</a> Dev Dyn. 236, 1583-1594 (2007).</li>
<li>Zhong, T. P., Childs, S., Leu, J. P., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gridlock+signalling+pathway+fashions+the+first+embryonic+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Gridlock signalling pathway fashions the first embryonic artery.</a> Nature. 414, 216-220 (2001).</li>
<li>Vogeli, K. M., Jin, S. W., Martin, G. R., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+progenitor+for+haematopoietic+and+endothelial+lineages+in+the+zebrafish+gastrula%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A common progenitor for haematopoietic and endothelial lineages in the zebrafish gastrula.</a> Nature. 443, 337-339 (2006).</li>
<li>Clanton, J. A., Shestopalov, I. A., Chen, J. K., Gamse, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+Labeling+of+Zebrafish+Cells+with+Laser+Uncagable+Fluorescein+Dextran%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran.</a> J. Vis. Exp. (50), e2672-e2672 (2011).</li>
<li>Niemz, M. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNiemz%2C+MH+%22Laser-Tissue+Interactions%3A+Fundamentals+and+Applications%22">Laser-Tissue Interactions: Fundamentals and Applications</a>. , Springer. (2003).</li>
<li>Jowett, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein and gene expression.</a> Methods in cell biology. 59, 63-85 (1999).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu kağıt floresein-dekstran kafesli bir fotoaktivasyon dayalı tek bir hücre kaderi haritalama için çok yönlü bir yöntem açıklanır. Tek hücreler içinde floresein-dekstran kafesli bir Uncaging Zeiss LSM 510 Meta konfokal mikroskop ile birleştiğinde bir Mai Tai femtosaniye lazer iki-foton soğurma kullanılarak elde edilir. Fotoaktive hücrelerinde Uncaged floresein-dekstran basit immünohistokimya prosedürü kullanarak hızla görüntülenmiştir. Bu protokolde kafesli floresein-dekstran fotoaktivasyon için iki foton soğurma dalga boyu 740 nm. Bu dalga boyu deneysel olarak kafese floresein-dekstran enjekte yabani-tip embriyolar photoactivating ile tespit edilmiştir. Lazer uyarma dalga boyu 600 ila 800 nm arasında değişiyordu, floresein floresan sonrası aktivasyonunun varlığı veya yokluğu niteliksel olarak tespit edilmiştir. Biz 740 nm güçlü flöresein sinyal aşağıdaki aktivasyon ürettiğini bulundu. İdeal olarak, 740 nm herkes için çalışması gerektiğinimodel sistemler, ancak biz örnek için en uygun iki foton uyarma dalgaboyu belirlemek için dalga boyu bir dizi test öneriyoruz. Her iki foton uyarma dalgaboyu biz de ortalama lazer gücü zengindir test için kafesli olarak floresein-dekstran, yabani-tip embriyolar enjekte. 740 nm&#39;lik bir eksitasyon dalga boyu için, 47 arasında bir ortalama lazer güç mW ortalama lazer güçler düşürmek ile karşılaştırıldığında, aktif bölge de daha kuvvetli bir fluoresein sinyal üretti. Yükseköğretim ortalama lazer güçler güçlü floresan sinyalleri üretmek, ancak doku kaynaklı ablasyonu vermedi. Femtosaniye lazer darbeleri ablasyonu biyolojik doku 15 verimli olduğundan, biz doku ablasyonu önler fotoaktivasyon için eşik ortalama lazer gücünün belirlenmesinde öneririz. İki foton soğurma küçük bir etkileşim hacmi içinde gerçekleşir. Kafesli floresein-dekstran uygun aktivasyon sağlamak için, hücrenin uygun odak noktasına getirilmelidir. Thprotokolü yukarıdaki e, GFP pozitif hücreler aynı anda hücre odak onaylamak için beyaz ışık altında görüntülendi. Bu nedenle, beyaz ışık toplama diğer kanallarına ek olarak tavsiye edilir. Hücre odak onayladıktan sonra, bizim protokolü aktif hücre büyütme göstermektedir. 50 ila 70 arasında bir büyütme faktörü tavsiye edilmektedir, bununla birlikte, bu değer hücre seçilmiş büyüklüğüne bağlıdır. Zum arttırılması bitişik hücrelerin aktive olan hücre izole etme, ve iki-fotonlu aktivasyonu için tarama alanı sınırlar. İdeal olarak, tarama alanının hücre geniş bir alanı kapsamalıdır. Tek aktif hücrelerin saptanması plan boyama minimal olmasını gerektirir. Yukarıdaki İmmuno protokolde bu örnek 5 ila 6 saat (adım 4.13) için tampon engelleme engellenmiş olduğunu önemlidir. NBT / BCIP ile geliştirirken, Uncaged floresein-dekstran 10 ila 20 dakika içinde görünür hale gelmelidir. Arka plan boyama güçlü ise, anti-kaldırmak için uzun bir engelleme süre ve ek yıkar öneririzvücut (adım 4.17). Şekiller 1 ve 2 fotoaktivasyon ve İmmuno temsili sonuçlar sağlar. Şekil 1, erken 1 - 2-hücreli aşamada yabani-tip embriyolar floresein-dekstran kafesli enjekte edildi. Embriyolar orta somitogenesis kaldırdı ve yanal yönde düşük erime agaroz monte edildi. Şekil 1. (a, b) fotoaktivasyon önce Aydınlık ve embriyo floresan görüntüler betimliyor. Embriyo Uncaged kalmıştır dair kanıt Şekil 1 (b) &#39;de floresan floresan olmaması ile ortaya konmuştur. Bir somite içinde küçük bir bölge 47 ortalama bir lazer güç mW, Şekil 1 (; ok c) kullanarak 31 saniye için 740 nm dalga boyu ile aktive edildi. Floresein-dekstran Post-aktivasyon, iki-fotonlu uncaging olarak etkin alan, Şekil 1 (; ok d) floresan ile gösterilen oluştu. Somitic dokusu bozulmadan, Şekil 1 (c) kalmıştır Aktivasyon, lazer ablasyon eşlik etmemişti. Şekil 2, Uncaged florun İmmuno göstermektedir<html> -dekstran escein. 10 somite aşama embriyo yan plaka mezoderm içinde küçük bir bölge Şekil 1 &#39;de belirtildiği gibi aynı lazer parametreleri kullanarak fotoaktive edildi. Embriyo kaldırdı ve 4.20 arasındaki adımları 4.1 kullanılarak işlendi. Şekil 2 bulur ok aktif bölge olarak mavi çökelti birikimi ile gösterilir. Sadece aktif konum açıkça arka plan boyama müdahale olmadan tespit edilir. Çözeltilerin Hazırlanması: 1 X PBT (1 L) 100 ml 10 X PBS 2 g BSA 10 mL% 20 Tween 10 x PBS (1 L) 80 g NaCl 2 g KCI 6.1 g Na 2 HPO 4 1.9 g KH 2 PO 4 1 L GKD 2 O 7.3 pH % 4 paraformaldehit (160 mL) % 32 Paraformaldehyde (iki 10 ml flakon) 8 ml 20 X PBS 132 ml GKD 2 O jove_content &quot;&gt; AP Tamponu (50 mL) 1 mL 5 M NaCl 2,5 ml 1 M MgCl2 5 mL 1 M Tris, pH 9.5 250 ul% 20 Tween 41.25 ml GKD 2 O Antikor çözeltisi (1 numune için) 5.5 mcL Aseton tozu 40 ul PBT 0.8 mcL LS 0.1 mcL Anti-florosin AP-antikor % 2 LS (1 numune için 360 mcL) 7.2 mcL% 100 LS 352,8 mcL PBT 1 X Danieau ortamı (1 L) ‡ 11.6 ml 5 M NaCI 700 mcL 1 M KCl 400 ul 1 M MgSO4 600 ul 1 M Ca (NO 3) 2 5 mL 1 M HEPES 1 L GKD 2 O pH 7,6 ayarlamak ‡ Danieau dechorionated zebrafish embriyolar yetiştirme için ideal bir tuz bir çözümdür. Diğer medya kullanılıyor olabilir, bunlar pro ile izotonik çözeltiler şartıylaPerly ozmolarite (zebrafish için ~ 300 mOsm) NBT stok (1 mL) 50 mg Nitro Blue Tetrazolium 0.7 ml dimetil formamid anhidrid 0.3 ml GKD 2 O BCIP stok (1 mL) 50 mg 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfat 1 ml dimetil formamid anhidrid NBT / BCIP gelişmekte çözümü 1 mL AP tampon 4.5 mcL NBT stok 3.5 mcL BCIP stok Aseton tozu <ol><li> 20 erişkin balık seçin ve sıvı azot içinde bunları dondurmak. </li><li> Bir harçla dondurulmuş balık Grind ve toz pestle. </li><li> Bir 50 mL konik bir tüp içine balık tozu aktarın. </li><li> % 100 aseton ile konik boru doldurun. Vorteks tüpü. </li><li> 10 dakika için maksimum devirde tüp Spin. Süpernatantı atın. </li><li> % 100 aseton pelet 3 kez yıkayın ve 10 dakika için maksimum devirde tüp dönerler. By son yıkama süpernatantı açıkça görünmelidir. </li><li> Tekrar pelet% 100 aseton ekleyin ve tüpü oda sıcaklığında bekletin. Ince parçacıkların süspansiyon kalır ise daha yoğun parçacıklar, razı olacak. </li><li> Yeni bir tüp içine ince parçacıklar süzün. Tablet toz ayrı tüpleri içine çözelti ve -20 ° C&#39;de saklayın </li></ol>

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> CMNB-kafesli floresein SE </td><td> Invitrogen </td><td> C20050 </td></tr><tr><td> 10 kDa Aminodextran </td><td> Invitrogen </td><td> D1860 </td></tr><tr><td> Zeba desalt Spin Kolon </td><td> Delmek </td><td> 89889 </td></tr><tr><td> Düşük erime agaroz </td><td> Amresco </td><td> 0815-100G </td></tr><tr><td> Sodyum Borat </td><td> Amresco </td><td> 1131117-100G </td></tr><tr><td> Tricaine Methylsulfonate / MS222 </td><td> Araştırma Organics </td><td> 1347A </td></tr><tr><td> Anti-florosin AP- </td><td> Roche </td><td> 11376622 </td></tr><tr><td> Tampon Engelleme </td><td> Roche Uygulamalı Bilimler </td><td> 11 096 176 001 </td></tr><tr><td> Maleik Asit </td><td> Sigma </td><td> MO375-500G </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> ElektrMikroskopi Bilimler </td><td> 15714 </td></tr><tr><td> NBT </td><td> Sigma </td><td> I8377-250mg </td></tr><tr><td> BCIP </td><td> Fischer Scientific </td><td> PI-34040 </td></tr><tr><td> Mikroenjektör </td><td> Harvard Apparatus </td><td> PLI-2000 </td></tr><tr><td> LABTEK Chambered coverglass slaytlar </td><td> Nalge Nunc Uluslararası </td><td> 155380 </td></tr><tr><td> Proteinaz K </td><td> Invitrogen </td><td> AM2544 </td></tr><tr><td> Kuzu Serum </td><td> Invitrogen </td><td> 16070096 </td></tr><tr><td> LSM 510 META NLO </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> 20X 0.8 NA Hava apochromatic hedefi </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> Şeffaf sarı filtre </td><td> Tiyatro House Inc </td><td> Roscolux filtre levha Renk: 312 </td></tr></tbody></table>

zebra balığı tek hücre kader haritalama

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

Ayirt tek hücre etiketlemek için yeteneği gelişimsel biyoloji açısından önemli olmaktadır. Örneğin, nasıl hematopoetik belirlenmesi, lenf ve kan damarı soy embriyolar gelişmekte ortaya farklılaşmamış prekürsör hücrelerinin izleme kaderi haritalama ve soy gerektirir. Son zamanlarda, photoactivatable proteinler içerir: Eos 1, 2, 3 PAmCherry, Kaede 4-7, 8 pKindling, ve KikGR 9, 10 hücre izleme probları olarak büyük ilgi gördü. Bu proteinlerin ışığa duyarlı floresan spektrum kolayca hücre popülasyonunun bitişik olanları ayırt edilmesi için izin UV uyarma ile dönüştürülebilir. Bununla birlikte, aktif protein photoefficiency 11 izleme uzun süreli hücre sınırlayabilir. Photoactivatable proteinlerin bir alternatif olarak, kafes floresein-dekstran yaygın olarak embriyo model sistemler 7, 12-14 olarak kullanılmıştır. Geleneksel olarak, floresein-dekstran, UV excit uncage içinBir floresan lamba ev veya tek bir foton UV lazer ation kullanılır olmuştur, ancak bu tür kaynaklardan fotoaktivasyon mekansal çözünürlüğü sınırlar. İşte kader haritası, soy izleme ve tek etiketli hücreleri algılamak için bir protokol rapor. Floresein-dekstran kafesli ile enjekte edilen embriyolar tek hücrelerin bir titanyum safir femtosaniye lazer üretilen yakın-kızılötesi lazer darbeleri ile fotoaktive edilir. Bu lazer gibi bu çalışmada kullanılan LSM 510 META NLO mikroskop gibi tüm iki-foton konfokal mikroskoplar gelenektir. Biyolojik doku yakın kızılötesi radyasyon 15 şeffaf olduğundan, lazer darbeleri Seçilen odak düzlemi üzerinde veya altında hücreler uncaging olmaksızın embriyonun içinde derin odaklı olabilir. Bu nedenle, non-lineer iki-foton soğurma tek bir hücrede floresein-dekstran uncage için geometrik odak sadece indüklenir. Floresein-dekstran Uncaged içeren hücre algılamak için, biz hızla visua basit bir immünhistokimya protokolü 16 tarifaktive edilmiş hücre lize. Bu çalışmada sunulan aktivasyon ve algılama protokolü yönlü ve herhangi bir model sistem uygulanabilir. Not: Bu protokolde kullanılan reaktifler madde sonunda ekteki tabloda bulunabilir.

Safir femtosaniye lazer osilatör: Ti bir yöntem olup, bir iki-fotonlu emme ile bir kafes floresan proteini içeren tek bir hücre photoactivate için tarif edilmiştir. Kader haritası için fotoaktive hücre, immunohistokimya kullanılır. Bu teknik, her hücre tipi için de uygulanabilir.

Zebra balığı Tek Hücre Kader Haritalama

Tek hücrelerin farklı şekilde etiketlenebilme yeteneği, gelişimsel biyolojide önemli çıkarımlara sahiptir. Örneğin, hematopoetik...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, zebrafish embriyolarındaki seçili tek hücrelerin kader haritalaması (fate mapping) ve soy takibinin (lineage tracing) gerçekleştirilmesidir. Bu işlem, kafeslenmiş (caged) floreseinle yüksek moleküler ağırlıklı dekstranın kimyasal olarak konjugasyonuyla sağlanır. Ardından, hazırlanan kafeslenmiş floresein dekstran zebrafish embriyolarına mikroenjeksiyonla aktarılır ve daha sonra iki foton absorbsiyonu kullanılarak seçili hücrelerde fotoaktive edilir.Embriyoların fotoaktivasyonundan sonra, aktive edilen hücrelerin kader haritalamasını yapmak amacıyla kafesten kurtulmuş florisayn dekstranı tespit etmek için immünohistokimyasal analiz gerçekleştirilir. Nihayetinde bu yöntem, fotoaktive edilmiş tek hücrelerin soy hattı katkısını ve doku lokalizasyonunu belirlemek için kullanılabilir. Bu tekniğin standart floresan mikroskobu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, kader haritalaması için tek hücrelerin farklı şekilde etiketlenmesine olanak tanımasıdır.Bu yöntem, farklılaşmamış öncül hücrelerin farklı doku türlerine nasıl katkıda bulunabildiği gibi gelişimsel biyolojideki temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Embriyo montajı ve fotoaktivasyon adımlarının yalnızca metin açıklamalarına dayanarak öğrenilmesi zor olduğundan, görsel gösterim kritik öneme sahiptir. Başlamadan önce, kafeslenmiş floresein dekstran sentezleyin ve metal folyo ile kaplı tüplerde saklayın. Ardından, bir ila iki hücre aşamasındaki embriyolara sentezlenen kafeslenmiş floresein dekstranı mikroenjekte edin.Embriyolar uygun gelişim aşamasına ulaştıktan sonra onları kaplayın. Ardından, fotoaktivasyon için kaplanmış embriyoları düşük erime noktalı agar içerisine yerleştirin. Agar katılaştığında LSM 510 yazılımını yükleyin.Beyaz ışık demeti yoluna şeffaf sarı bir filtre yerleştirin, ardından yeni görüntü tara (scan new image) seçeneğini belirleyin ve uzman modunu başlat (start expert mode) düğmesine tıklayın. Lazer sekmesini seçin, argon iyonu ve mi tai lazer kaynaklarını açın. Mi tai dalga boyunu 740 nm olarak ayarlayın.Ardından, config sekmesini seçin. Argon iyonu ve mi tai lazeri için optik yol konfigürasyonlarını ayarlayın. Daha sonra scan sekmesini seçin.Objektifi 20x 0.8 ile değiştirin. Kanallar (channels) sekmesi altında, sırasıyla "max set mode method" ve "number to line" seçeneklerine tıklayarak maksimum tarama hızını "mean" ve "one" olarak ayarlayın; mi tai dışındaki tüm lazer kaynaklarının seçimini kaldırın. Ardından, optik ışın yoluna bir güç ölçer yerleştirin ve sürekli taramayı etkinleştirmek için "con" düğmesini seçin.Güç ölçer ortalama 47 milliwatts lazer gücü okuyana kadar iletim yüzdesini ayarlayın. Ardından kanallar sekmesi altındaki durdurma düğmesini seçerek taramayı durdurun. mi tai lazer kaynağının seçimini kaldırın ve argonne iron'u seçin.Ardından kanallar sekmesi altındaki fast XY düğmesini tekrar seçin, pinhole'u ayarlayın. Argonne demir lazeri ile en iyi görüntü kalitesini elde etmek için detect gain, amplify a offset ve amplify değerlerini yeniden ayarlayın. Sahne kontrol cihazını kullanarak aktive edilecek hücreyi bulun ve odaklayın, ardından durdurma düğmesine tıklayın. Kırpma aracını kullanarak, mod sekmesi altındaki kırpma faktörü 50 ila 70 arasında görünecek şekilde aktive edilmiş hücreyi kırpın.Ardından, kanallar sekmesindeki durdurma butonunu seçerek taramayı durdurun. Mod sekmesi altından argon iyon lazerinin seçimini kaldırın ve My Tai lazerini seçin. Tarama hızını 31,46 saniye olarak ayarlayın.Ardından, seçilen hücrenin kafeslenmiş floresein dekstranının iki foton aktivasyonu için taramayı başlatmak üzere tekli düğmeyi seçin. Aktivasyondan sonra, kanallar sekmesine gidin; burada mi tai lazer seçimini kaldırın ve argon iyon lazerini yeniden seçin. Daha sonra mod kısmında, yakınlaştırma faktörünü bir olarak ayarlayın. İleri.Hız başlığı altındaki max düğmesine tıklayarak en hızlı tarama hızını ayarlayın. Foto-aktive edilen bölgeyi incelemek için fast xy'yi seçin. Ardından kanallar sekmesini seçip iğne deliğini (pinhole) ayarlayın ve tekrar tespit ederek foto-aktive edilen bölgenin lazerle ablate edilmediğini kontrol edin.Eşlik eden makalede belirtilen protokolü takip ederek, foto-aktive edilmiş embriyoları kafessiz floresein dekstran immün deteksiyonu için hazırladıktan sonra, embriyoları altı kez PBT ile ve iki kez AP tamponu ile yıkayın. Ardından embriyoları, AP tamponu içeren dokuz kuyucuklu plakalara aktarın.Ardından, AP tamponunu aspire edin ve N-B-T-B-C-I-P ekleyin. N-B-T-B-C-I-P solüsyonunu aspire ederek N-B-T-B-C-I-P boyama gelişimini durdurun. Daha sonra embriyoları PBT ile yıkayın.Şimdi embriyoları geri alın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca döner bir platform üzerinde sallayın. Ardından PBT ile yıkama işlemini iki kez daha tekrarlayın. Son olarak, embriyoları %0,6 düşük erime noktalı agar içine yerleştirin ve dik bir bileşik mikroskop kullanarak fotoaktifleşmiş hücrelerin görüntülerini elde edin.Bu şekilde, foto-aktivasyon öncesinde kafesli fluorescein dekstran zincirinin mikroenjeksiyonu yapılmış bir zebra balığı embriyosunun sol tarafta parlak alan görüntüsü ve sağ tarafta floresan görüntüsü gösterilmektedir. Burada görüldüğü üzere, embriyo; sol taraftaki parlak alan figüründe okla belirtilen somitlerden birinde 740 nm dalga boyu, 31 saniye tarama süresi ve 47 mW ortalama lazer gücü ile foto-aktive edilmiştir. Sağdaki figürde, foto-aktivasyon sonrası kafesi açılmış fluorescein dekstrandan gelen floresan gözlemlenebilmektedir.Kafes dışı floresein dekstranın immün boyaması, 10 somit evresindeki bir embriyonun lateral plağı, mezoderminin küçük bir bölgesinde gösterilmiştir. Önceki şekildekiyle aynı lazer parametreleri kullanılarak fotoaktivasyon gerçekleştirilmiş ve immün deteksiyon prosedürü uygulanmıştır. Burada okla belirtilen aktive edilmiş bölge, bu prosedürün ardından minimum arka plan boyaması ile tanımlanabilmektedir.Etiketlenen hücrelerin konumunu ve akıbetini daha iyi karakterize etmek için farklı dokuya özgü belirteçler için immün boyama gibi ek analizler gerçekleştirilebilir. Bu teknik, vasküler biyoloji alanındaki araştırmacıların, gelişmekte olan zebra balığı embriyolarındaki venöz progenitör hücrelerin arteriyel kökenini incelemelerine yol açmaktadır. NBT ve BCIP gibi kimyasal reaktiflerle çalışırken, bunların son derece tehlikeli olabileceğini ve her zaman eldiven takılması gerektiğini unutmayın.

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, biz gelişmekte olan omurgalı beyin konfokal mikroskobu ile tek bir hücre çözünürlükte canlı zebrafish embriyolar analiz edildiği bir yöntem gösteriyor. Bu, tek hücreli zebrafish embriyo enjekte ve daha sonra gelişmekte olan beyin montaj ve görüntü hangi yöntemi içerir.

Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı

Bu protokol zebrafish embriyolar yaşayan tek tek nöronların veya nöral krest hücreleri görüntüleme açıklar. Bu yöntem, floresan konfokal zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak cep davranışlar ve aktin lokalizasyonu incelemek için kullanılır.

Zebra balığı Embriyolar Bireysel Nöronlar ve Sinir Crest Hücreler Aktin Sitoiskelet Hücre Motilite ve Canlı Görüntüleme

Erken embriyo şekli morfogenetik süreçleri anlamanın anahtarı, yüksek çözünürlükte görüntü hücrelerinin yeteneği. Biz burada tüm zebrafish embriyolar membran hedefli Yeşil Floresan Protein hücrelerin tek hücreler veya küçük kümeler etiketleme için kullanılan bir tekniktir açıklar.

Zebra balığı Beyin Etiketleme ve Görüntüleme Hücreleri

Bu protokol, Uncaged floresein gelen sinyali yükseltmek için immunolabeling tüm montaj takip kafesli flöresein UV uncaging kullanarak hücrelerin zebrafish embriyoların küçük gruplar kaderi etiket ve takip etmek için bir yol çizer.

Lazer Uncagable Floresein Dextran&#39;ın Zebra balığı Hücre Lineage Etiketleme

Bu protokol, zebra balığı embriyolarından tek hücreleri izole etmek, ilgilenilen hücreleri zenginleştirmek, mikroakışkan tabanlı tek hücreli multipleks sistemlerde zebra balığı hücrelerini yakalamak ve tek hücrelerden gen ekspresyonunu değerlendirmek için bir yöntemi tanımlar.

İzolasyon ve Zebra balığı Embriyolar gelen Tek Hücre Karakterizasyonu

Kirpikler geliştirme için uygun organogenesis hayati önem taşımaktadır. Bu iletişim kuralı etiket ve Zebra balığı siliyer hücreleri görselleştirmek için en iyi duruma getirilmiş bir yöntemini açıklar.

Zebra balığı bütün Dağı Floresan Situ hibridizasyon ve ayirt kombine bir protokol aracılığıyla Multiciliated hücrelerde görüntülenmesi

Transgenik lck:eGFP Zebra balığı GFP son derece T lenfosit hızlı ve T hücre gelişimi ve Akut lenfoblastik lösemi çalışmaya kullanılmıştır. Bu satırı lck daha alt düzeylerde hızlı çalışma B hücreleri için kullanılabilir. Bu iletişim kuralı arıtma lck:eGFP Zebra balığı kötü huylu ve kötü huylu olmayan B hücre açıklar.

İzoleli Malignant ve sigara-Malignant B hücreleri lck:eGFP Zebra balığı

In vivo görüntüleme sinir sistemi gelişiminin altında yatan hücresel mekanizmaları araştırmak için kullanılabilecek güçlü bir araçtır. Burada, gelişmekte olan zebra balığı sinir sistemi içinde çok renkli Brainbow etiketli çok sayıda hücreyi gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için zaman atlamalı konfokal mikroskopiyi kullanma tekniğini açıklıyoruz.

Brainbow ve Time-lapse Konfokal Görüntüleme kullanarak Yaşayan Zebrabalıklarında Gelişen Beyni Görselleştirme

Burada, tek hücreli RNA dizileme analizi için döllenmeden 5 gün sonra zebra balığı larvalarından bağırsak izolasyonu için bir yöntem açıklıyoruz.

Tek Hücreli RNA Dizilimi için Zebra Balığı Larvalarından Bağırsak İzolasyonu

Burada, zebra balığı embriyolarında ve larvalarında döllenmeden en az 1 ila 7 gün sonra herhangi bir aşamada yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlüğe sahip hücrelerin nakli için bir protokol sunuyoruz.

Embriyonik ve Larva Zebra Balıklarında Yüksek Çözünürlüklü Hücre Nakli

Öğrenin, zebra balığı embriyolarında tek hücre kader haritalama yöntemini kullanarak gelişimsel biyoloji araştırmalarında hücre soyunu ve doku yerleşimini nasıl belirleyebilirsiniz.

Zebra balığı Tek Hücre Kader Haritalama

Daha fazla video keşfet