Bir Chip Lensless Floresan Mikroskopi
17 Ağustos 2011
Lensless bir çip üzerinde floresan mikroskobu platformu göstermiştir floresan nesneler, örneğin bir ultra-geniş alanda-görünüm görüntü> <4μm çözünürlük çözme algoritması tabanlı bir basınç örnekleme yöntemiyle 0,6-8 cm2. Böyle bir kompakt ve geniş alan floresan çip üzerinde görüntüleme yöntemidir yüksek verimli sitometri, nadir hücre araştırmaları ve mikroarray-analiz için değerli olabilir.
Bu prosedürün genel amacı, floresan nesneleri ultra geniş bir görüş alanı üzerinde görüntülemek için lenssiz bir çip üzerinde floresan mikroskobu platformunu göstermektir. Bunu başarmak için, ince bir absorpsiyon filtresi ve bir fiber optik yüz plakası, bir opto elektrik sensör dizisinin veya CCDC yosununun üzerine nazikçe yerleştirilir ve ardından yüz plakasının üzerine bir mikroakışkan çip yerleştirilir. Daha sonra, indeks eşleştirme yağı kullanılarak mikroçip ile bir prizma monte edilir.
Floresan atıf, eşkenar dörtgen bir prizmanın yan yüzünden elde edilir ve holografik aydınlatma, aynı prizmanın üst yüzeyinden yapılır. Sonuç olarak, elde edilen floresan görüntülerden, ham görüntülerin dijital algoritmalar aracılığıyla çözülmesi ile yüksek çözünürlüklü mikroskobik görüntüler elde edilebilir. Gerekirse, kodu çözülen floresan nesneler, özel olarak geliştirilmiş bir arayüz kullanılarak otomatik olarak sayılabilir.
Çip lens üzerinde. Genel olarak görüntüleme, hantal lens tabanlı optik mikroskopları daha basit ve daha kompakt tasarımlarla değiştirmeyi amaçlar. Gelişmekte olan bu teknoloji platformu, yeni teoriler ve dijital yeniden yapılandırma algoritmalarının yardımıyla hantal ve maliyetli çekici bileşenlere olan ihtiyacı ortadan kaldırma potansiyeline sahiptir.
Çip üzerinde görüntüleme platformundaki lens listesi, bir dijital sensör dizisi, tutarsız bir aydınlatma kaynağı, bir prizma, bir absorpsiyon filtresi ve bir fiber optik yüz plakası veya bir fiber optik konik dahil olmak üzere çeşitli optik bileşenlerden oluşur. Bu platformda, hedef mikro nesnelerden gelen floresan sinyalin algılanması için farklı tipte sensör dizileri kullanılabilir. Bu videonun amaçları doğrultusunda, şarj bağlantılı bir cihaz kullanılacak, floresan uyarımı için basit bir ışık yayan diyot gibi tutarsız bir ışık kaynağı kullanılacaktır.
Bu diyagramda gösterildiği gibi gerekli karanlık alan arka planını oluşturmak için paralel olarak iki farklı uyarma filtreleme yöntemi kullanılır. İlk olarak, ilgilenilen örnekleri barındıran mikroakışkan çipin alt yüzeyinde toplam iç yansıma veya TIR oluşturmak için bir cam prizma veya bir cam yarım küre kullanılır. Buna paralel olarak, TIR işlemine uymayan haftalık dağınık uyarma ışıklarını gidermek için ucuz bir absorpsiyon filtresi kullanılır.
Bu iki mekanizma kullanılarak uyarmanın başarılı bir şekilde reddedilmesinin ardından, dedektör düzleminde sadece numunelerin floresan emisyonu elde edilir. Bu kadar büyük bir algılama sayısal açıklığına rağmen, sensör dizisindeki ham floresan noktaları, bu floresan sinyalinin uzamsal yayılımını tasarlamak ve daha iyi kontrol etmek için oldukça geniş hale gelir. Normal bir yüz plakasına alternatif olarak nesne ile sensör düzlemleri arasına bir fiber optik yüz plakası yerleştirilecektir.
Üst yüzünde, alt yüzüne kıyasla önemli ölçüde daha fazla fiber optik kablo yoğunluğuna sahip olan konik bir fiber optik yüz plakası, büyütme yoluyla daha yüksek çözünürlüklü görüntüleme için kullanılabilir. Bu platformda kullanılan mikroakışkan çipler, topraksız çip üstü görüntüleme platformunun montajına başlamak için çip üzerinde görüntüleme için gerekli olan mikro kanalları oluşturmak için cam slaytlar üzerine yerleştirilmiş poli dimetil Sloane duvarlar kullanılarak üretilir. İlk olarak, bir vakum kalemi kullanarak optoelektronik sensör dizisinin kapak camını çıkarın, dedektör aktif alanının üstüne nazikçe ince bir absorpsiyon filtresi yerleştirin.
Bu absorpsiyon filtresinin üzerine bir fiber optik yüz plakası yerleştirin. Ardından fabrikasyon mikroakışkan çipi doğrudan fiber optik dizinin üzerine yerleştirin. Daha sonra, mikroakışkan çip kullanım indeksi eşleştirme yağının üzerine bir cam prizma monte edilir, böylece arayüzün kırılma indisi camın kırılma indisi ile eşleştirilir.
FC konektörleri kullanarak ışık kaynaklarını fiber optik kablolara bağlayın. Bu prosedürün en zor yönlerinden biri, bileşenlerin hizalanmasıdır. Bileşenler arasındaki mesafeleri, aydınlatmanın konumunu ve açısını dikkatlice hizalayın.
Son olarak, yan aydınlatma fiberini prizmaya yaklaştırın ve mikroakışkan çiplere karşılık gelen cam hava arayüzünde toplam iç yansımanın meydana gelmesini sağlamak için açısını ayarlayın. Alt substrat, çeşitli hücreler veya küçük hayvan modelleri bu çip üstü platform kullanılarak görüntülenebilir, ancak beyaz kan hücreleri bu gösterinin amaçları doğrultusunda görüntülenecektir. Beyaz kan hücrelerini floresan bir boya ile etiketlemek için, önce yaklaşık 100 mikrolitre tam kanı yaklaşık bir mililitre kırmızı kan hücresi yükselen tamponla karıştırın, yaklaşık üç dakika oda sıcaklığında inkübe edin, ardından yalan kan çözeltisini santrifüjleyin.
Üst tabakayı bir mikro pipet kullanarak çıkardıktan sonra, hücrelerin nükleik asidini floresan boya ile etiketlemek için pelet tabakasını fosfat tamponlu salin içinde yeniden süspanse edin, resus süspansiyonuna SYTO 16 ekleyin ve ardından numuneyi karanlıkta yaklaşık 30 dakika inkübe edin oda sıcaklığında. 30 dakika sonra etiketli numuneyi santrifüjleyin. Bağlanmamış boyalardan kaynaklanan floresan emisyonu nedeniyle arka plan gürültüsünü azaltmak için supinatı çıkarın.
Reese, beyaz kan hücresi pelet tabakasını yaklaşık beş mililitre PBS'de büktü. Numune artık çip üzerinde lenssiz floresan görüntüleme için mikroakışkan çipe yüklenmeye hazırdır. Beyaz kan hücrelerini görüntülemeden önce, görüntüleme platformu floresan mikroboncuklar kullanılarak kalibre edilmelidir.
Deiyonize su ve ham boncuk çözeltisi kullanarak seyreltilmiş mikro boncuk örneği hazırlayın. Keskin bir iğne şırınga kullanarak. Bu ilk numuneyi PDMS duvarlarının yanından mikroakışkan çipe enjekte edin.
Çip üzerinde floresan görüntüleme elde etmek için bileşenleri bir araya getirdikten sonra, bir bilgisayar aracılığıyla özel olarak geliştirilmiş laboratuvar görünümü arayüzünü kullanarak floresan boncukların ham görüntülerini elde edin. Tüm görüş alanı boyunca en az 20 izole floresan boncuk görüntüsü olup olmadığını kontrol ettiğinizden emin olun. Lenssiz floresan mikroskobu platformunun nokta yayılma işlevini kalibre etmek ve çıkarmak için daha sonra kullanılacak olan kalibrasyon verilerini kaydedin.
Floresan boncuk örneğini içeren mikroakışkan çipi çıkarın ve prizmayı bu çipten ayırın. Önceden hazırlanmış beyaz kan hücresi örneğini, PDMS duvarlarının yanından kullanılmayan başka bir mikroakışkan çipe enjekte edin. A: Bileşenleri, özellikle mesafeler ve uyarma gücü ile ilgili olarak, aynı deneysel koşullarla bir kez daha birleştirin.
Floresan mikro boncuklar için kullanılan aynı yazılım parametreleriyle özel yapım laboratuvar görünümünü kullanarak beyaz kan hücrelerinin ham görüntülerini elde edin. Kalibrasyon verileri ve ham beyaz kan hücresi görüntüleri daha sonra dijital işleme yoluyla MATLAB'da daha yüksek çözünürlüklü görüntüler oluşturmak için kullanılır. Dört mikron ve 10 mikron yeşil floresan parçacıkları içeren bir karışımın geniş alan lensli floresan çip üzerinde görüntülenmesinin temsili sonuçları, karşılaştırma amacıyla burada gösterilmiştir, 10 x mikroskop.
Gösterilen lensle daha az floresan görüntü ile iyi uyum sağlayan objektif görüntüler de sağlanır. Daha sonra, geniş alan merceği sonucu, 10 mikron yeşil ve 10 mikron kırmızı floresan parçacıkları içeren bir karışımın az floresan görüntüleme. Lenssiz floresan görüntüler, aynı numunelerin 10 x mikroskop objektif görüntüleriyle iyi bir eşleşme sağlar.
Bu şekil, çeşitli 10 mikron boncuk çiftlerinin görüntülenmesi için kod çözme algoritmalarına dayalı Lucy Richardson Dekonvolüsyon ve basınçlı örneklemenin bir performans karşılaştırmasını sağlar. Üst sıra, lensin daha az ham floresan görüntülerini gösterir ve burada iç görüntüler, 10 x objektif lens kullanılarak gerekli olan aynı parçacıkların mikroskop karşılaştırmalarını gösterir. Orta sıra, sıkıştırma kod çözme sonuçlarını gösterirken, alt sıra Lucy Richardson Dekonvolüsyon sonuçlarını gösterir: DDCS ve DLR, sırasıyla merkezden merkeze mesafelere ve mikroskop görüntülerine, CS kodu çözülmüş lens görüntülerine ve LR de kıvrımlı lenssiz görüntülere atıfta bulunur.
Daha sonra, lensin dijital olarak işlenmesi, daha az floresan ham görüntüler gösterilmektedir. Sıkıştırılmış örnekleme tabanlı bir algoritma, yakından paketlenmiş iki mikron çapında boncuk çiftini çözerek dört mikrondan daha az uzamsal çözünürlük elde etmek için kullanılır. İç kısımlar, kodu çözülmüş floresan görüntülerle çok iyi uyum sağlayan 40 x mikroskop objektif karşılaştırmalarını gösterir.
Burada D, mikroskop görüntülerinde merkezden merkeze olan mesafeleri ifade eder. DCS, CS kodu çözülmüş lenste merkezden merkeze mesafeleri ifade ederken, daha az floresan görüntüler. Bu şekil, floresan olarak işaretlenmiş beyaz kan hücrelerinin lenssiz görüntülenmesinin sonuçlarını göstermektedir.
Ham lenssiz görüntülerin kodu, 10 x objektif lens ile elde edilen aynı numunenin geleneksel bir mikroskop görüntüsüyle çok iyi uyum sağlayan CS tabanlı bir kod çözücü kullanılarak hızlı bir şekilde çözülür. Gerekirse görüntülemeye ek olarak, kodu çözülen floresan nesneler, çip üzerinde sitometri uygulamaları için özel olarak geliştirilmiş bir arayüz kullanılarak otomatik olarak sayılabilir Burada gösterilen, matlab'da özel olarak tasarlanmış, otomatik bir floresan nesne sayma arayüzüdür. Etiketli hücrelerin topraksız floresan mikroskobu ve sekiz santimetre karelik bir görüş alanı üzerinde mikro vuruşlar için prosedürü yeni gösterdik.
Böyle bir gemi görüntüleme platformu, arkasındaki hızlı basınç kod çözücü ile karşılaştırıldı. Yüksek verimli sitometri, mikro nadir analiz ve gerçek hücre araştırma uygulamaları için oldukça değişken olacaktır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, ultra geniş bir görüş alanında floresan nesneleri görüntüleme kabiliyetine sahip, merceksiz bir çip üzeri floresan mikroskopi platformunu gösterir. Sistem, sıkıştırmalı örnekleme tabanlı bir kod çözme algoritması kullanarak 4μm'den daha düşük bir çözünürlük elde eder ve bu da onu yüksek verimli uygulamalar için uygun kılar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Floresan Mikroskopi
- Görüntüleme Teknikleri
- Mikroakışkanlar
Arka Plan
- Geleneksel mikroskopi genellikle hacimli lensler gerektirir.
- Merceksiz sistemler, görüntüleme için kompakt çözümler sunabilir.
- Yüksek verimli sitometre ve nadir hücre araştırmaları, geniş alan görüntülemeden yararlanır.
- Dijital algoritmalar, ham verilerden görüntü çözünürlüğünü artırır.
Çalışmanın Amacı
- Kompakt bir merceksiz görüntüleme sistemi geliştirmek.
- Geniş bir alanda yüksek çözünürlüklü görüntüleme elde etmek.
- Floresan nesnelerin otomatik sayımını kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Bir sensör dizisi üzerine ince bir absorpsiyon filtresi ve fiber optik yüz plakasının yerleştirilmesi.
- Numune işleme için bir mikroakışkan çipinin konumlandırılması.
- Floresan uyarım ve holografik aydınlatma için bir eşkenar dörtgen prizmanın kullanılması.
- Görüntü kod çözme ve analizi için dijital algoritmaların uygulanması.
Ana Sonuçlar
- 0.6-8 cm²'den daha geniş bir alandaki floresan nesnelerin başarılı bir şekilde görüntülenmesi.
- 4μm'den daha düşük bir çözünürlüğün elde edilmesi.
- Yüksek verimli uygulamalar için potansiyelin gösterilmesi.
- Özel bir arayüz aracılığıyla floresan nesnelerin otomatik sayımının sağlanması.
Sonuçlar
- Merceksiz çip üzeri mikroskopi platformu, geniş alan görüntüleme için etkilidir.
- Geleneksel mikroskopi yöntemlerine kompakt bir alternatif sunar.
- Bu teknoloji, sitometre ve mikrodizgi analizini önemli ölçüde ilerletebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Lensless on-chip fluorescent microscopy addresses the need for compact, high-throughput imaging in early discovery workflows by eliminating bulky optical components. The platform enables rapid screening of fluorescently labeled samples over ultra-wide fields of view, supporting scalable cytometric and microarray applications. Its integration with digital decoding algorithms enhances predictive confidence in target validation and phenotypic screening by delivering quantitative, reproducible imaging data.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through high-resolution imaging of fluorescently labeled cellular targets over large areas.
- Operational Value: Supports functional target validation by providing label-specific signal detection without optical complexity.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by generating reliable imaging data for mechanistic de-risking of cellular pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by enabling uniform excitation and collection of fluorescent signals across microfluidic channels.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through fixed optical geometry and digital point spread function calibration.
- Scalability: Facilitates high-throughput screening readiness via imaging of vertically stacked micro-channels, increasing sample throughput per run.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports disease-relevant imaging of primary cells such as white blood cells, enabling biomarker-aligned readouts.
- Preclinical Alignment: Bridges discovery to preclinical validation by providing quantitative imaging outputs compatible with histopathological benchmarks.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables data-driven advancement decisions through automated counting and spatial distribution analysis of fluorescent objects.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, particularly for assays requiring wide-field, label-specific detection.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving subcellular fluorescent signals in primary cell populations.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible fluorescent signal capture and digital reconstruction across large fields of view.
- Analytics: Provides quantitative measurements such as object count, intensity, and spatial distribution via compressive sampling-based decoding.
- Translational Research: Connects to preclinical workflows through imaging of clinically relevant cell types like white blood cells, enabling biomarker correlation.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging platform across multiple projects due to its modular design and algorithm-driven adaptability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through high-resolution, label-specific imaging over wide fields of view.
- Operational Value: Standardization and scalability via fixed optical components and automated image decoding.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing biological ambiguity in phenotypic screening data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through high-content, reproducible imaging outputs for lead selection.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescent labeling, microfluidic handling, and digital image processing.
- Dependent on optoelectronic sensor arrays, fiber optic face plates, and prism-based excitation systems.
- Necessitates cross-team standardization of calibration protocols using fluorescent microbeads for point spread function derivation.
- Adaptation considerations include microfluidic channel design and excitation power tuning across different cell types or bead sizes.
- Practical limitations include dependency on fluorescent signal strength and potential background from unbound dyes, mitigated by washing steps.
