Name: GFP-Aktin ifade Canlı Endotel Hücreleri Aktin Sitoiskelet Çalışması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Öğrenin canlı endotel hücrelerinde GFP-aktin görüntüleme ile aktin iskelet dinamiklerini gözlemleme yöntemini. Bu teknik, endotel geçirgenliği mekanizmalarını anlamak için gerçek zamanlı analiz sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

GFP-β-aktin plazmid cömertçe Dr. Wayne Orr LSUHSC-S Patoloji Bölümü tarafından sağlanan ve LSUHSC-NO Farmakoloji Bölümü Dr. Becky Worthylake, laboratuvar amplifiye edildi. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü (P20 RR-018.766) ve Amerikan Kalp Derneği (05835386N) hibe tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Spindler, V., Schlegel, N., Waschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+GTPases+in+control+of+microvascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Role of GTPases in control of microvascular permeability.</a> Cardiovasc. Res. 87, 243-253 (2010).</li>
<li>Wojciak-Stothard, B., Ridley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+GTPases+and+the+regulation+of+endothelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Vascul.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Rho GTPases and the regulation of endothelial permeability.</a> Vascul. Pharmacol. 39, 187-199 (2002).</li>
<li>Yuan, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+pathways+in+enhanced+microvascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Signal transduction pathways in enhanced microvascular permeability.</a> Microcirculation. 7, 395-403 (2000).</li>
<li>Birukov, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+GTPases+in+mechanosensitive+regulation+of+endothelial+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Small GTPases in mechanosensitive regulation of endothelial barrier.</a> Microvasc. Res. 77, 46-52 (2009).</li>
<li>Duran, W. N., Sanchez, F. A., Breslin, J. W. Microcirculatory Exchange Function. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDuran%2C+WN+%22Handbook+of+Physiology%3A+Microcirculation%22">Handbook of Physiology: Microcirculation</a>. Tuma, R. F., Duran, W. N., Ley, K. , 2nd Edition, Elsevier. San Diego. 81-124 (2008).</li>
<li>Hu, Y. L., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+motion+of+paxillin+on+actin+filaments+in+living+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Dynamic motion of paxillin on actin filaments in living endothelial cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 357, 871-876 (2007).</li>
<li>Borm, B., Requardt, R. P., Herzog, V., Kirfel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+ruffles+in+cell+migration%3A+indicators+of+inefficient+lamellipodia+adhesion+and+compartments+of+actin+filament+reorganization%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Membrane ruffles in cell migration: indicators of inefficient lamellipodia adhesion and compartments of actin filament reorganization.</a> Exp. Cell. Res. 302, 83-95 (2005).</li>
<li>Hotulainen, P., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+fibers+are+generated+by+two+distinct+actin+assembly+mechanisms+in+motile+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stress fibers are generated by two distinct actin assembly mechanisms in motile cells.</a> J. Cell. Biol. 173, 383-394 (2006).</li>
<li>Pellegrin, S., Mellor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+stress+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Actin stress fibres.</a> J. Cell. Sci. 120, 3491-3499 (2007).</li>
<li>Ballestrem, C., Wehrle-Haller, B., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+dynamics+in+living+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Actin dynamics in living mammalian cells.</a> J. Cell. Sci. 111, 1649-1658 (1998).</li>
<li>Helmke, B. P., Rosen, A. B., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+mechanical+strain+of+an+endogenous+cytoskeletal+network+in+living+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Mapping mechanical strain of an endogenous cytoskeletal network in living endothelial cells.</a> Biophys. J. 84, 2691-2699 (2003).</li>
<li>Birukova, A. A., Smurova, K., Birukov, K. G., Kaibuchi, K., Garcia, J. G., Verin, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Rho+GTPases+in+thrombin-induced+lung+vascular+endothelial+cells+barrier+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Role of Rho GTPases in thrombin-induced lung vascular endothelial cells barrier dysfunction.</a> Microvasc. Res. 67, 64-77 (2004).</li>
<li>van Nieuw Amerongen, G. P., van Delft, S., Vermeer, M. A., Collard, J. G., van Hinsbergh, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+RhoA+by+thrombin+in+endothelial+hyperpermeability%3A+role+of+Rho+kinase+and+protein+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Activation of RhoA by thrombin in endothelial hyperpermeability: role of Rho kinase and protein tyrosine kinases.</a> Circ. Res. 87, 335-340 (2000).</li>
<li>Moy, A. B., Blackwell, K., Kamath, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+histamine+and+thrombin+on+endothelial+barrier+function+through+actin-myosin+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differential effects of histamine and thrombin on endothelial barrier function through actin-myosin tension.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 282, H21-H29 (2002).</li>
<li>Wittman, T., Littlefield, R., Waterman-Storer, C. Fluorescent speckle microscopy of cytoskeletal dynamics in living cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWittman%2C+T+%22Live+Cell+Imaging%3A+A+Laboratory+Manual%22">Live Cell Imaging: A Laboratory Manual</a>. Goldman, R. D., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 184-204 (2005).</li>
<li>Rabut, G., Ellenberg, J. Photobleaching techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, iFRAP, and FLIP. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRabut%2C+G+%22Live+Cell+Imaging%3A+A+Laboratory+Manual%22">Live Cell Imaging: A Laboratory Manual</a>. Goldman, R. D., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 101-126 (2005).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Canlı endotel hücreleri GFP-aktin görüntüleme inflamatuar uyaranlara yanıt aktin hücre iskeletinin dinamiklerini ayrıntılı bir analiz sağlar. Bu yöntem ayrıca, kayma gerilmesi 11 gibi fiziksel güçlerine yanıt olarak hücre iskeletinin yeniden şekillenme gösteren önceki bulgularla üzerine inşa etmek için yararlı olabilir . Buna ek olarak, bu yöntem, göç, mitoz, hücrelerarası kavşaklar ve junctional olgunlaşma oluşumu ve bariyer fonksiyonu bakım dahil olmak üzere çeşitli endotel hücre faaliyetleri, aktin hücre iskeleti dinamiklerinin katkısı ayrıntılı bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. Gösterilen veriler, trombin ile tedavi öncesi ve sonrası endotel aktin hücre iskeletinin davranışı görülebilir. Endotelyal hücrelerin kenarlarında Yerel lamellipodia oluşturan ve hem nonconfluent ve konfluent hücre mono tabakaları zamanla gerileyebilen gözlendi. Trombin ile tedavisi kısaca lamellipodia formu kesilditirme ve ciro. Trombin, ayrıca endotel hücreleri 12-14 trombin aktin stres lifli yapısı ve artan merkezcil gerginlik geliştirme neden olduğu daha önceki raporlarda ile anlaşma hücreleri, biraz sözleşme neden oldu . Ancak, bu gibi canlı hücre görüntüleme çalışmaları, stres liflerin kökeni artık tespit edilebilir. HUVEC, stres liflerinin çoğu hücre çevre kaynaklı ve hücreleri 8, 9 göç enine yay liflerin benzeyebilir. Sabit hücreleri kullanarak üzerinde bu yöntemi başka bir gücü, deneysel gruplar arasında seçim yanlılığı ortadan kaldırarak, stres liflerin sayısı, trombin tedavi öncesi ve sonrasında tek tek hücrelerin sayısal olabilir ki. Bu protokol ile, hücre kenar ve aktin stres lifleri dinamik hareketi değerlendirir. Endotel hücreleri, floresan kurtarma gibi daha gelişmiş teknikleri photobleaching sonra aktin monomeri dinamiklerini anlamak (sıkı bağlamak) veya floresan mikro specklekopyası (FSM) 16, 15 uygulanabilir. Buna ek olarak, çünkü mikrovasküler endotel hücreleri mikrovasküler bariyer fonksiyonunu daha iyi bir modeli, etkin bir şekilde mantıksal bir gelecekteki yönünü temsil mikrovasküler endotel hücrelerinde GFP-aktin ifade etmek transfeksiyon protokolleri optimizasyonu temsil edebilir. Özetle, GFP-aktin ifade canlı endotel hücreleri görüntüleme endotel hücre aktin hücre iskeletinin çeşitli tipte uyaranlara nasıl tepki vereceğini belirlemek için güçlü bir araçtır temsil eder. Sıkı konfluent endotel mono tabakaları kullanılarak yapılan çalışmalar, aktin-zengin lamellipodia ve endotel bariyer fonksiyonu enine yay stres lifleri gibi dinamik yapıların rolleri belirlemek yardımcı olacaktır. Buna ek olarak, GFP-aktin veya diğer hücre içi yapıların görüntülenmesi sağlayan diğer füzyon proteinleri ifade endotel hücreleri canlı hücre görüntüleme, sinyalizasyon ve yapısal mekanizmaları anlamak için gerekli detaylı uzaysal bilgi sağlayacak bu determine bariyer bütünlük.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> 1. Zil 5x STOKUN </td></tr><tr><td> Kimyasal </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Miktar </td></tr><tr><td> Sodyum klorür </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 35 g </td></tr><tr><td> Potasyum klorid </td><td> JT Baker </td><td> 3040 </td><td> 1.75 g </td></tr><tr><td> Kalsiyum Klorür </td><td> Sigma </td><td> C-3881 </td><td> 1.47 g </td></tr><tr><td> Magnezyum Sülfat </td><td> Sigma </td><td> M-9397 </td><td> 1,44 g </td></tr><tr><td> Steril Filtreli su </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 1 L Getir </td></tr><tr><td colspan="4"> 4 otoklavlanmış mağaza şişe ve içine steril filtre ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 2. MOPS tampon </td></tr><tr><td> Kimyasal </td><td>Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Miktar </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> Sigma </td><td> M3183 </td><td> 125.6 g </td></tr><tr><td> Steril Filtreli su </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 1 L Getir </td></tr><tr><td colspan="4"> 4 otoklavlanmış mağaza şişe ve içine steril filtre ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 3. Albumin Fizyolojik Tuz Çözeltisi (APSS) </td></tr><tr><td> Kimyasal </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Miktar </td></tr><tr><td> Zil stoku (5x) </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> Mops Tampon </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Sodyum Fosfat </td><td> Sigma </td><td> S-9638 </td><td> 0.168 g </td></tr><tr><td> Sodyum Piruvat &lt;/ Td&gt; <td> Sigma </td><td> P5280 </td><td> 0,22 g </td></tr><tr><td> EDTA sodyum tuzu </td><td> Sigma </td><td> ED2SS </td><td> 0,0074 g </td></tr><tr><td> Glikoz </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> 0,901 g </td></tr><tr><td> Albümin, Bovine </td><td> USB </td><td> 10856 </td><td> 10 g </td></tr><tr><td> Steril Filtreli su </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 1 L Getir </td></tr><tr><td colspan="4"> 37 ° pH 7.4 &#39;e ayarlayın ° C, 4 otoklavlanmış şişe ve depoya sonra steril filtre ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 4. % 0.9 salin </td></tr><tr><td> Kimyasal </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Miktar </td></tr><tr><td> Sodyum klorür </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 9 g </td></tr><tr><td> Steril Filtreli su </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 1 L Getir </td></tr><tr><td colspan="4"> 4 otoklavlanmış mağaza şişe ve içine steril filtre ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 5. % 1,5 jelatin Çözüm </td></tr><tr><td> Domuz deri gelen Jelatin </td><td> Sigma </td><td> G2500 </td><td> 15 g </td></tr><tr><td> % 0.9 salin </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 1 L Getir </td></tr><tr><td colspan="4"> 37 çözüm Sıcak ° C yeterince jelatin çözülür. Iken 4 otoklavlanmış şişe ve mağaza hala sıcak, steril filtre ° C </td></tr></tbody></table>

gfp-aktin ifade canlı endotel hücreleri aktin sitoiskelet Çalışması

Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

Mikrovasküler endotele çözünen sıvıları ve seçici geçirgen bir bariyer olarak önemli bir rol oynar. Endotel hücreleri arasındaki yapışkan kavşak endotel geçirgenliği düzenleyen ve birçok çalışmalar junctional bütünlüğünü belirleyen 1-5 aktin hücre iskeletinin önemli bir katkı koymuştur. Kortikal aktin kemeri istikrarlı kavşaklar 1, 2, 4, 5, bakım için önemli olduğu düşünülmektedir. Buna karşılık, aktin stres lifler kavşaklar 2-5 zayıflatır endotel hücreleri içinde merkezcil gerginlik oluşturmak için düşünülmektedir. Bu teorinin endotel hücreleri, endotel geçirgenliği arttırdığı bilinen inflamatuvar mediatörlerin tedavi ve sonra hücrelerin mikroskobik gözlem için sabitleme ve F-aktin etiketleme olduğu çalışmalar esas almıştır. Ancak, sabit hücrelerin görüntüler sadece anlık görüntü sağlar, çünkü bu çalışmalar aktin hücre iskeletinin rolü çok sınırlı bir anlayış sağlamakaktin yapılar 5 dinamikleri hakkında hiçbir bilgiye sahip. Canlı hücre görüntüleme endotel bariyer bütünlüğünü belirleyen mekanizmaların çalışmalar içine aktin hücre iskeletinin dinamik yapısı dahil sağlar. Bu yöntemin en büyük avantajı, önce canlı hücreler aynı set ve tedaviden sonra değerlendirilir sabit örneklerinde gözlemleyerek oluşabilecek olası önyargı kaldırarak, endotel hücreleri aktin yapılar üzerinde çeşitli inflamatuvar uyaranların etkisi olabilir ki. İnsan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVEC) plazmid GFP-β-aktin ile transfekte ve cam lamelleri izdiham büyüdü. Ayrıca endotel bariyer bütünlük içinde zamana bağlı değişimlere sebep inflamatuvar mediatörlerin önce ve sonra, GFP-aktin konfluent HUVEC Time-lapse görüntüleri yakalanır. Bu çalışmalar endotelin katkıda aktin hücre iskeletinin değişiklikleri sıvı sıra görsel gözlem sağlarl bariyer bozulması ve restorasyon. Bizim sonuçlarımız, endotel hücreleri yerel, aktin-zengin lamellipodia oluşumu ve ciro sürekli göstermektedir. Aktin stres liflerinin oluşumu ve hareketi de görülebilir. Inflamatuar uyaranlara ile tedavi öncesi ve sonrası, yerel lamellipodia oluşumu ve ciro sıklığını bir analiz, kymograph analizleri ile belgelenmiştir. Bu çalışmalar endotel bariyer bütünlüğünün sürdürülmesi için önemli, önceden tanımlanmamış moleküler mekanizmalarını keşfetmek için kullanılabilir endotel hücreleri aktin hücre iskeletinin dinamik yapısı hakkında önemli bilgiler sağlar.

GFP-aktin ifade canlı endotel hücreleri mikroskobik görüntüleme iskelet yapıları dinamik değişimlere karakterizasyonu sağlar. Sabit örneklerinde kullanan teknolojilerden farklı olarak, bu yöntem önce aynı hücrelerde aktin hücre iskeletinin temporal değişikliklerin ayrıntılı bir değerlendirme sırasında, çeşitli fiziksel, farmakolojik veya inflamatuvar uyaranlara sonra sağlar.

GFP-Aktin ifade Canlı Endotel Hücreleri Aktin Sitoiskelet Çalışması

Mikrovasküler endotel, sıvılar ve çözünmüş maddeler için seçici geçirgen bir bariyer olarak önemli bir rol oynar. Endotelyal hücreler arasındaki adhezif bağlantılar...

Bu prosedürün amacı, canlı endotel hücrelerin aktin sitoskeletindeki dinamik değişimleri gözlemlemektir. Öncelikle, insan göbek kordonu ven endotel hücrelerini A GFP beta actin plazmidi ile transfekte edin ve lameller üzerinde konfluens olana kadar kültüre edin. Ardından, lamelleri ısıtmalı bir sahneye ve albumin fizyolojik tuz çözeltisi infüzyonuna sahip bir canlı hücre görüntüleme haznesine yerleştirin.Son adım, farmakolojik bir ajanla tedavi öncesi ve sonrası zaman ayarlı görüntü yakalama yoluyla seçilen bir hücre alanının veri kazanımıdır. Image J gibi görüntüleme yazılımlarıyla yapılan Chime grafik analizi; çıkıntıların mesafe, süre ve hız gibi yerel lamelipodia çıkıntılarına dair bilgilerin yanı sıra zaman içindeki aktin lifi hareketine ilişkin veriler sağlayabilir. Bu tekniğin immunofloresan görüntüleme gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, canlı hücre görüntülemenin, aktin ve hücre iskeletinin dinamik doğasının endotel geçirgenliğini belirleyen mekanizmalara ilişkin çalışmalara dahil edilmesine olanak tanımasıdır.Sabitlenmiş boyalı hücreler zamandaki anlık görüntüleri temsil ederken, inflamatuar bir mediyatörle işlem öncesi ve sonrasındaki eylem ve hücre iskeleti dinamikleri hakkında düşük düzeyde bilgi sağlarlar. Biyolojik güvenlik kabininde, lamelleri %70 ethanol ile iki dakika boyunca sterilize edin ve ardından havada kurumaya bırakın. Her bir lamelin 10 santimetrelik bir kültür plağına yerleştirin ve lamel kenarlarına temas etmeden merkezine 300 microliter ılık jelatin çözeltisi ekleyin. Beş dakika sonra sıvıyı aspire edin.Şimdi, konfluen durumdaki insan göbek bağı ven endotel hücrelerini veya VE'yi %0,25 tripsin EDTA ile hasat edin. Hücreleri sayın ve santrifüj yoluyla doldurun. VE nükleer efektör kiti ile yapılacak bir transfeksiyon reaksiyonu için süpernatant medyanın mümkün olduğunca fazlasını aspire edin.Hücre peletlerini temel nükleer efektör çözeltisinde tekrar süspande edin ve 0,2 ile 2 µg arasında GFP beta aktin vektör plazmidi ekleyin. Hücre süspansiyonundan 100 µL'yi bir nükleer efektör qve'ye aktarın. Q vet tabanı ile transfeksiyon örneği arasında hava kabarcığı kalmadığından emin olmak için kapağı kapalı vete'ye birkaç kez hafifçe vurun.Q VET'i nükleer efektör iki cihazına yerleştirin ve nükleer efektör kitinden bir transfer pipeti kullanarak, 500 µL ısıtılmış EGM iki MV medyumu qve'ye ekleyerek A 0 3 4 programını çalıştırın. Ardından karışımı tekrar mikrofüj tüpüne aktarın ve 15 dakika boyunca inkübe edin. Transfekte edilmiş VE süspansiyonunu nazikçe bir kez karıştırın ve kenarlara değdirmeden 300 µL süspansiyonu jelatin kaplı bir lameli üzerine ekleyin.Ardından bir ila dört saat boyunca inkübe edin. Transfekte edilen hücrelerin lam üzerine tutunduğunu doğrulamak için kontrol edin. Sonra plağa 10 mililitre E GM two MV medyumu ekleyin ve GFP ekspresyonu için inkübasyona devam edin.İlk olarak, yer çekimi akış sistemine bir albümin fizyolojik tuz solüsyonu ortamı veya bir PSS ekleyin ve hat içi ısıtıcıya bağlayın. Şimdi, yaklaşık 40 mililitre/saat'lik bir akış sağlamak için akış düzenleyiciyi ayarlayın. Ardından, pamuk uçlu bir aplikatör ile musluğu kapatarak akışı durdurun.Elmas banyosunun alt kısmındaki dış kenara vakum gresi uygulayın. Şimdi inkübatörden transfekte edilmiş bir kültürü çıkarın. Lamellenin üzerini pens yardımıyla nazikçe kaldırın.Ardından, hücrelerin yüzü yukarı bakacak şekilde konumlandırılmış olan alt lamdaki fazla EGM two MV ortamını bir Kim wipe ile emdirin. Bir hazne oluşturmak için ön camın üzerine elmas banyosunu yerleştirin. Hazneyi hızlıca sahne ısıtıcısına yerleştirin.Hazne üzerindeki klempleri sıkın ve plaktan hazneye yaklaşık 1 mL EGM two MV medyumu pipetleyin. Şimdi vakum hortumunu haznenin sol tarafındaki tutucusuna ve hat içi ısıtıcıdan gelen A PSS hattını haznenin sağ tarafındaki kanala bağlayın. Ardından, transfekte edilmiş hücreler üzerinde banyo perfüzyonunu sağlamak için vakumu açın ve A PSS hattını aktif hale getirin.Ayrıca, hat içi ısıtıcıyı 37 °C'ye ayarlayarak açın. Ardından, ısıtmalı tabla için termistör probunu banyonun kenarına yerleştirin ve tabla ısıtıcısını 37 °C'de çalıştırın. Kalan EGM-2 MV besiyeri ve tuz birikintilerini temizlemek için, lamelin alt kısmını %70 etanol ile ıslatılmış bir Kim wipe ile dikkatlice silin ve ardından kuru bir Kim wipe ile kurulayın; transfekte edilmiş HU hücrelerini 30 dakika boyunca dengeleyin.Kursu kilitleyin. Çalışma için seçilen kültür hücreleri alanına odaklanın. Kamera pozlama süresini, hücrelerdeki GFP Act in sinyal yoğunluğuna bağlı olarak 0.5 ile iki saniye arasında ayarlayın.Ayrıca deney için aralık ve süre zamanlarını ayarlayın. Şimdi oda ışıkları kapalıyken, ayarları değerlendirmek için tek bir görüntü yakalayın. Görüntüleri ihtiyaç duyulduğunda izleyerek zaman atlamalı seriyi yakalayın.Tipik bir protokolde, bir test ajanı eklemeden önce 20 ila 30 dakikalık bazal görüntüler elde edin ve ardından 0,5 ila dört saatlik ek görüntüleme gerçekleştirin. Son olarak, beraberindeki metinde detaylandırıldığı üzere, lameli podia çıkıntı mesafesini, kalıcılığını ve hızını CH grafik analizi ile değerlendirin. Tipik bir deneyde, GFP aktin, transfekte edilen VE'lerin %50'sinden fazlasında rastgele bir şekilde eksprese edilir.Dakikada bir kez alınan bu görüntüler, sitoplazma genelindeki GFP aktinin yanı sıra filamentöz yapılar ve hücre kenarı boyunca uzanan yerel e meli podiaları yakalamıştır. Hücre çıkıntılarının mesafe kalıcılığı ve hızı, zaman serisi görüntü setlerinden nicelleştirilmiştir. Chm grafik analizi kullanılarak, öncelikle hücre kenarına kabaca dik bir tek piksellik çizgi çizilir.Bu bölge, zamanla değişen bölgenin bir montajını veya burada görülen chime grafiğini oluşturmak için zaman geçimli setin her bir görüntüsünden çıkarılır; chime grafiğinde soldan sağa bakıldığında, uzantılar hücre kenarındaki yukarı yönlü hareketler olarak temsil edilir. Bu uzantılardan birinin kenarına bir çizgi bindirildiğinde, uzantı dinamiklerini nicelleştirmek için o çizgiyle ilişkili piksel verileri toplanabilir. Bir chime grafiğindeki toplam uzantı sayısı, uzantı frekansını tahmin etmek için kullanılabilir.Bu analiz, hücre çevresinde oluşan ve sonunda parçalandıkları hücre merkezine doğru hareket eden stres lifi hareketlerini betimlemektedir. Chio grafiğinde stres lifleri, sitoplazmik alanda sürekli çizgiler şeklinde görünür ve genellikle hücre merkezine doğru aşağıya ve sağa doğru hareket ederler; liflerin orijinal chio grafiğinde görülmesinin zor olduğu durumlarda, unsharp mask filtresi görüntüyü netleştirir ve stres lifleri üzerine çizilen çizgiler, measure fonksiyonu kullanılarak piksel verilerinin toplanmasını kolaylaştırır. Alternatif olarak, tanımlanan stres lifinin başlangıcından sonuna kadar çizilen çizgiler, lifin gözlemlendiği süre boyunca kütle ortalama piksel verilerini sağlar.Bu sunum, time-lapse görüntü setinden elde edilen verilerin Image J gibi yazılımlar kullanılarak grafik analizi yoluyla nasıl analiz edileceğini göstermiştir. Bu videoyu izledikten sonra, transfekte edilmiş endotel hücrelerin canlı hücre görüntülemesini kullanarak, inflamatuar mediyatörlere yanıt olarak aktin hücre iskeleti dinamiklerinin nasıl inceleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

study-actin-cytoskeleton-live-endothelial-cells-expressing-gfp

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Seçimi, mikroenjeksiyon ve görüntüleme floresan ile F-aktin floresan etiketli (FSM) mikroskopi speckle.

Floresan üzerinden F-aktin Dynamics Canlı Hücre Görüntüleme speckle Mikroskopi (FSM)

Bu protokol zebrafish embriyolar yaşayan tek tek nöronların veya nöral krest hücreleri görüntüleme açıklar. Bu yöntem, floresan konfokal zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak cep davranışlar ve aktin lokalizasyonu incelemek için kullanılır.

Zebra balığı Embriyolar Bireysel Nöronlar ve Sinir Crest Hücreler Aktin Sitoiskelet Hücre Motilite ve Canlı Görüntüleme

Bu kağıt kültürü canlı hücreleri mekanik uyarılması için entegre bir atom operasyon okuyucu kuvvet optik görüntüleme mikroskop öğretmeyi hedefliyor. Bir adım-adım protokol sunulmuştur. Mekanik stimülasyonu canlı hücre yanıtı gösteren bir temsilci veri seti sunulmaktadır.

Tümleşik Optik ve Atomik Kuvvet Mikroskobu eğitimi Mekanik Uyarım Canlı Hücre Tepki

Nöronal büyüme konileri dikenli biter görselleştirmek ve F-aktin ölçmek için bir yöntem açıklanmıştır. Cam lamelleri kültür nöronlar sonra, hücreler saponin içeren bir çözüm permeabilize. Sonra, rodamin-aktin içeren saponin tamponu ile kısa bir inkübasyon ücretsiz aktin dikenli uçları üzerine floresan aktin içermektedir.

Nöronal Büyüme Konileri permeabilize rodamin-aktin ile F-aktin Dikenli Ends Etiketleme

Adaptif bağışıklık, T hücreleri ile antijen sunan hücreler arasında oluşan dinamik 'immünolojik sinapslar' tarafından kontrol edilir. Bu protokol, endotel hücrelerinin hem az çalışılmış fizyolojik APC'ler hem de yeni bir 'düzlemsel hücresel APC modeli' türü olarak araştırılması için yöntemleri tanımlar.

Görüntüleme İmmünoloji Synapse Dynamics için bir Endotel Hücre Modeli Düzlemsel

Hücre nakli, hücre iskeleti etiketleme ve fonksiyon kaybı/kazanımı yaklaşımlarını birleştiren bu protokol, göç eden zebra balığı prospektif prekordal plağın, in vivo hücre göçünde bir aday genin işlevini analiz etmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar.

Analiz<em&gt; İn Vivo</em&gt; Hücre Göç Zebra balığı Embriyolar hücre nakli ve Time-lapse Görüntüleme kullanılarak

Erken endosome fonksiyonları F-aktin polimerizasyon üzerinde bağlıdır. Burada, böylece reaksiyonlar karmaşık bu dizi biyokimyasal ve genetik mükellef işleme çekirdekleşme ve F-aktin polimerizasyon test tüpleri, erken endosomal membranlar üzerinde reconstitutes mikroskobu tabanlı vitro tahlil açıklamak manipülasyonlar.

Vitro F-aktin üzerinde erken Endosomes polimerizasyon

Biz nasıl sıkı BAĞLAMAK ve photoactivation gibi mikro - ve photomanipulation teknikleri hareketliliği parametreleri belirlenmesi etkinleştirmek ve proteinler geçiş içinde kronolojik zamanmekansal dinamikleri hücreleri tanımlamak. Deneysel veriler hücre altı dinamikleri ve ciro hareketliliği düzenleyiciler veya temel aktin sitoiskeleti içerir.

Morfogenetik dinamiklerini analiz ve hücre iskeleti düzenleyiciler ciro sağlayan Embriyolardan teknikleri

Bu protokol, yayılan hücrelerin kenarındaki çıkıntıların dinamik parametrelerini (çıkıntılar, geri çekmeler, fırfırlar) ölçmeyi amaçlamaktadır.

Canlı Hücre Mikroskobu ile Yayılma Sırasında Hücre-Kenar Çıkıntı Dinamiğinin Ölçülmesi

Basit aktin filament mikroakışkan tahlilleri için, floresan mikroskobu ile birlikte, bireysel aktin filamentlerini gerçek zamanlı olarak doğru bir şekilde izlemeyi ve sırayla farklı protein çözeltilerine maruz bırakmayı sağlayan protokoller sunuyoruz.

Tek Aktin Filamentlerin ve Demetlerin Montaj Dinamiğini İncelemek için Mikroakışkanlar ve Floresan Mikroskobu Kullanma

Öğrenin canlı endotel hücrelerinde GFP-aktin görüntüleme ile aktin iskelet dinamiklerini gözlemleme yöntemini. Bu teknik, endotel geçirgenliği mekanizmalarını anlamak için gerçek zamanlı analiz sağlar.

GFP-Aktin ifade Canlı Endotel Hücreleri Aktin Sitoiskelet Çalışması

Daha fazla video keşfet