GFP-Aktin ifade Canlı Endotel Hücreleri Aktin Sitoiskelet Çalışması

Bu prosedürün amacı, canlı endotel hücrelerin aktinle ilişkilendirilmiş hücre iskeletindeki dinamik değişiklikleri gözlemlemektir. İlk olarak, insan göbek veni endotel hücrelerini A GFP beta actin plazmidi ile transfect edin ve lameller üzerinde konfluens hale gelene kadar kültüre edin. Ardından, lamelleri ısıtmalı bir sahneye ve albüminli fizyolojik tuz çözeltisi infüzyonuna sahip bir canlı hücre görüntüleme odasına yerleştirin.

Son adım, farmakolojik bir ajanla tedavi öncesinde ve sonrasında zaman aşımlı görüntü yakalama yoluyla seçilen bir hücre alanının veri toplama işlemidir. Image J gibi görüntüleme yazılımlarıyla yapılan Chime grafik analizi; çıkıntıların mesafesi, süresi ve hızı gibi yerel lamelipodi çıkıntılarına dair bilgilerin yanı sıra, zaman içindeki aktin lif hareketleri hakkında da içgörüler sağlayabilir. Bu tekniğin immünofloresan görüntüleme gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, canlı hücre görüntülemesinin, aktin ve hücre iskeletinin dinamik doğasının endotelyal geçirgenliği belirleyen mekanizmalar üzerine yapılan çalışmalara dahil edilmesine olanak tanımasıdır.

Sabitlenmiş boyalı hücreler zaman içindeki anlık görüntüleri temsil ederken, bir biyolojik güvenlik kabininde inflamatuar bir mediyatör ile uygulama öncesi ve sonrasındaki aktin ve hücre iskeleti dinamikleri hakkında düşük miktarda bilgi sağlarlar. Lamelleri %70 ethanol ile iki dakika boyunca sterilize edin ve ardından havada kurumaya bırakın. Her bir lameli 10 santimetrelik bir kültür plağına yerleştirin ve lamelin kenarlarına değmeden merkezine 300 microliter sıcak jelatin çözeltisi ekleyin. Beş dakika sonra sıvıyı aspire edin.

Şimdi, %0,25 tripsin EDTA ile konfluens bir insan göbek kordonu ven endotel hücresi veya VE kültürünü hasat edin. Hücreleri sayın ve santrifüjle çöktürün. VE nükleer efektör kiti ile bir transfeksiyon reaksiyonu gerçekleştirmek için süpernatant medyanın mümkün olduğu kadar fazlasını aspire edin.

Hücre peletlerini temel nükleer efektör çözeltisi içinde yeniden süspande edin ve 0,2 ila 2 µg GFP beta actin vektör plazmidi ekleyin. Hücre süspansiyonundan 100 µL'yi bir nükleer efektör qve'ye aktarın. Q vet tabanı ile transfeksiyon örneği arasında hava kabarcığı kalmadığından emin olmak için kapağı kapatılmış vete'ye birkaç kez hafifçe vurun.

Q VET'i nuclear effector two cihazına yerleştirin ve nuclear effector kitinden bir transfer pipeti kullanarak, 500 µL ısıtılmış EGM two MV medyumunu qve'ye ekleyip A 0 3 4 programını çalıştırın. Ardından karışımı tekrar mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 15 dakika inkübe edin. Transfekte edilmiş VE süspansiyonunu nazikçe bir kez karıştırın ve kenarlara değdirmeden 300 µL süspansiyonu jelatin kaplı bir lamelle örtücü üzerine ekleyin.

Ardından bir ila dört saat boyunca inkübe edin. Transfekte edilen hücrelerin lam üzerine tutunduğunu doğrulamak için kontrol edin. Daha sonra plağa 10 mL E GM iki MV medyumu ekleyin ve GFP ekspresyonu gerçekleşene kadar inkübasyona devam edin.

İlk olarak, yerçekimi akış sistemine bir albumin fizyolojik tuz çözeltisi (PSS) ortamı ekleyin ve bunu hat içi ısıtıcıya bağlayın. Şimdi, yaklaşık 40 mililitre/saat akış hızı elde etmek için akış regülatörünü ayarlayın. Ardından, pamuk uçlu bir aplikatör yardımıyla musluğu kapatarak akışı durdurun.

Elmas banyosunun alt kısmındaki dış kenara vakum gresi uygulayın. Şimdi inkübatörden transfect edilmiş bir kültürü çıkarın. Lamine camı pens kullanarak nazikçe kaldırın.

Ardından, hücrelerin yüzü yukarı bakacak şekilde konumlandırılmış alt lamdaki fazla EGM two MV besiyerini bir Kim wipe ile emdirin. Bir hazne oluşturmak için örtü camının üzerine elmas banyosunu yerleştirin. Hazneyi hızla sahne ısıtıcısına yerleştirin.

Kelepçeleri hazne üzerinde sıkın ve plakadan hazneye yaklaşık bir mililitre EGM two MV medyumu pipetleyin. Şimdi vakum hortumunu haznenin sol tarafındaki tutucuya ve hat içi ısıtıcıdan gelen A PSS hattını haznenin sağ tarafındaki kanala bağlayın. Ardından vakumu açın ve transfekte edilmiş hücrelerin üzerinden banyo perfüzyonuna izin vermek için A PSS hattını açın.

Ayrıca, hat içi ısıtıcıyı 37 °C'de çalıştırın. Ardından, ısıtmalı platform için termistör probunu banyonun kenarına yerleştirin ve platform ısıtıcısını 37 °C'de açın. Kalan EGM two MV medyumunu ve tuz birikintilerini temizlemek için, lamelin alt kısmını önce %70 ethanol ile ıslatılmış bir Kim wipe ile, ardından kuru bir Kim wipe ile dikkatlice silin; transfekte edilen HU hücrelerini 30 dakika boyunca dengeleyin.

Kursu kilitleyin. Çalışma için seçilen kültür hücreleri alanına odaklanın. Kamera pozlama süresini, hücrelerdeki GFP Act in sinyal yoğunluğuna bağlı olarak 0.5 ve iki saniye arasında ayarlayın.

Ayrıca deney için aralık ve süre zamanlarını ayarlayın. Şimdi oda ışıkları kapalıyken, ayarları değerlendirmek için tek bir görüntü yakalayın. Gerekli görüldüğünde görüntüleri izleyerek zaman atımlı seri çekimi gerçekleştirin.

Tipik bir protokolde, bir test ajanı eklemeden önce 20 ila 30 dakikalık bazal görüntüler elde edin ve ardından 0,5 ila dört saat boyunca ek görüntüleme yapın. Son olarak, beraberindeki metinde ayrıntılı olarak açıklandığı üzere, lamely podia çıkıntı mesafesini, kalıcılığını ve hızını CH grafik analizi ile değerlendirin. Tipik bir deneyde, GFP aktin, transfekte edilen VE'lerin %50'den fazlasında rastgele bir şekilde eksprese edilir.

Dakikada bir kez alınan bu görüntüler, sitoplazma boyunca GFP aktini, ayrıca filamentöz yapılar ile hücre kenarı boyunca uzanan yerel melipodyumları yakalamıştır. Hücre çıkıntılarının mesafe sürekliliği ve hızı, zaman ayarlı görüntü setlerinden nicelleştirilir. Kym graf analizi kullanılarak, öncelikle hücrenin kenarına kabaca dik olacak şekilde tek piksellik bir çizgi çizilir.

Bu bölge, bölgenin zaman içindeki bir montajını veya bir chime grafiğini oluşturmak için zaman atlamalı setin her görüntüsünden çıkarılır; buradaki chime grafiğinde, soldan sağa perspektiften bakıldığında, çıkıntılar hücre kenarındaki yukarı yönlü hareketler olarak temsil edilir. Bu çıkıntılardan birinin kenarına bir çizgi bindirildiğinde, protrusion dinamiklerini nicelleştirmek için o çizgiyle ilişkili piksel verileri toplanabilir. Bir chime grafiğindeki toplam çıkıntı sayısı, çıkıntı frekansını tahmin etmek için kullanılabilir.

Bu analiz, hücre çevresinde oluşan ve sonunda parçalandıkları hücre merkezine doğru hareket eden stres liflerinin hareketlerini tasvir etmektedir. Chio grafiğinde stres lifleri, sitoplazmik bölgede sürekli çizgiler şeklinde görünür ve genellikle hücre merkezine doğru aşağıya ve sağa hareket ederler; liflerin orijinal chio grafiğinde görülmesinin zor olduğu durumlarda, unsharp mask filtresi görüntü çizgilerini netleştirir ve stres lifleri üzerine çizilen çizgiler, ölçüm fonksiyonu kullanılarak piksel verilerinin toplanmasını kolaylaştırır. Alternatif olarak, tanımlanan stres lifinin başlangıcından sonuna kadar çizilen çizgiler, lifin gözlemlendiği süre boyunca ortalama kütle piksel verilerini sağlar.

Bu sunum, Image J gibi yazılımlar kullanılarak grafik analizi yoluyla zaman ayarlı (time-lapse) görüntü setinden elde edilen verilerin nasıl analiz edileceğini göstermiştir. Bu videoyu izledikten sonra, transfekte edilmiş endotel hücrelerin canlı hücre görüntülemesi kullanılarak, inflamatuar mediyatörlere yanıt olarak aktin hücre iskeleti dinamiklerinin nasıl inceleneceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.