Caenorhabditis elegans Nöronlarında Hücre Altı Kalsiyum Dinamiğinin Görüntülenmesi

İki ayrı transgenik Caenorhabditis elegans suşunu agar pedleri ile slaytlar üzerinde alın. Pedler, hareketi en aza indiren felçli bir ajan içeren yuvarlanan bir çözelti içerir.

Solucanların ventral sinir kordonu veya VNC, bir suşta sitoplazmik kalsiyum göstergelerini ve diğerinde mitokondriyal kalsiyum göstergelerini eksprese eden uyarıcı internöronlar içerir.

Solucanları yuvarlamak için bir lamel yerleştirin, VNC'yi görselleştirme için yönlendirin, ardından bunları bir floresan mikroskobu altında konumlandırın.

Solucanları bulmak için görünür ışık kullanın, ardından floresan moduna geçin.

Dinlenme nöronlarında, düşük hücre içi kalsiyum, göstergeleri bağlanmamış halde tutar ve bu da zayıf floresan ile sonuçlanır.

Spontan nöronal aktivite, voltaj kapılı kalsiyum kanallarını açarak kalsiyum akışına izin verir.

Sitoplazmik indikatörleri olan suşta, kalsiyum indikatörlere bağlanarak sitoplazmik floresansı arttırır.

Fazla sitoplazmik kalsiyum mitokondriye kanallar yoluyla girer. Mitokondriyal göstergeleri olan suşta, kalsiyum bağlanması mitokondriyal floresansı arttırır.

Hücre altı kalsiyum dinamiklerini izlemek için her iki suştaki nöronları görüntüleyin.

13 x 100 milimetrelik bir cam kültür tüpünde, moleküler dereceli agarı M9 ve mikrodalgada birkaç saniye çözerek 3 mililitre% 10 agar hazırlayın. Agar pedlerini yapmak için önce iki kat laboratuvar bandı ekleyerek iki slayt hazırlayın. Ardından iki slayt arasına bir mikroskop lamı yerleştirin. 1.000 mikrolitrelik bir pipet ucunun ucunu kesin ve lamel ortasına küçük bir damla agar pipetlemek için kullanın.

Agarın üzerine başka bir sürgü bastırarak agarı düzleştirin. Soğuduktan sonra, 10 mililitrelik bir tüpün açıklığını kullanarak agarı küçük bir diske kesin ve ardından çevreleyen agarı çıkarın. Daha sonra, 30 milimolar bir stok oluşturmak için muscimol tozunu M9'da çözerek solucan haddeleme çözeltisini hazırlayın. Haddeleme çözeltisini yapmak için stoğu polistiren boncuklarla bire bir oranında seyreltin.

Solucanı görüntüleme için konumlandırmak için, önce 1.6 mikrolitre yuvarlanma solüsyonunu agar pedinin ortasına yerleştirin. Daha sonra, tercih edilen bir solucan penası kullanarak, istenen yaştaki bir solucanı agar pedi üzerindeki yuvarlanma çözeltisine aktarın. Muscimol'ün solucan hareketini azaltması için yaklaşık beş dakika bekleyin ve ardından agar pedinin üzerine 22 x 22 milimetrelik bir lamel bırakın.

Ventral sinir kordonundaki nöritleri görüntülemek için, lamel hafifçe kaydırarak solucanı yuvarlayın. Solucanı mikroskoba monte etmek için, lamel üzerine bir damla daldırma yağı koyun. Parlak alanda düşük büyütme hedefi kullanarak solucanı bulun. Ardından 100X objektife geçin ve 488 nanometre görüntüleme lazeri ile GCaMP veya mito-GCaMP'nin aydınlatmasını kullanarak AVA nöritini bulun.