Name: Cercarial Dönüşüm ve In vitro Yetiştiriciliği Schistosoma mansoni Schistosomules (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Öğrenin, Schistosoma mansoni'nin enfeksiyöz sirkaryalarını Biomphalaria glabrata salyangozlarından toplayarak şistosomüllere dönüştürme yöntemini. Bu teknik, parazitoloji araştırmalarında güvenli in vitro kültür için kritik öneme sahiptir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu proje, E. Jolly sağlanan Case Western Reserve Üniversitesi&#39;nde başlangıç ​​fonları tarafından finanse edildi. Enfekte salyangoz şiştozom Kaynak Merkezi, NIH-NIAID (NIAID Sözleşme No HHSN272201000009I) tarafından verilmiştir. Ayrıca Chris King ve Ronald Blanton enfekte şiştozom salyangoz güvence destek ve yararlı tartışmalar için teşekkür ederiz.

Güvenlik önlemleri: Şiştozom cercariae bir kesik veya gözeneklerin ihtiyaçları olmadan doğrudan cilde nüfuz eder ve kronik hastalık schistosomiasis neden olabilir. S. mansoni bir biyogüvenlik düzeyi 2 organizma, bu nedenle uygun kişisel koruyucu ekipman ve enfektif cercaria ile çalışırken uygun güvenlik önlemleri takip edilmelidir. Schistosomes büyümeye dönüştürmek için gerekli ekipmanların çoğu protokol sonunda tabloda belirtildiği gibi birkaç önemli istisnalar dışında, standart. Tüm cercarial çalışma, izole bir odada yapılmalıdır. Schistosomules steril, onaylı biyogüvenlik kaput kültüre olmalıdır. İki kat nitril ya da lateks eldiven giyilmelidir bir laboratuvar önlüğü, su geçirmez bir çift ayakkabı, bilek ve silah için herhangi bir delik veya yırtık ve su geçirmez kol koruyucuları pantolon gerekir. Kazara dökülme durumunda, derhal şiddetle kişi hakkında ise sürtünme,% 70 etanol veya% 10 çamaşır suyu ile kirlenmiş alanda sprey. Bu parazit devre dışı bırakmak için yeterli olacaktır, ancak tüm olası enfeksiyonlara ve ciddiye alınmalıdır. Schistosomules doğuştan enfektif olmasa da, kurumsal kurallar değişir ve BSL2 önlemler noninfeksiyöz yaşam aşamalarında gerekli olup olmadığını belirlemek için danışılmalıdır. Biohazard onaylı bir kapta yapılır ve deney atık atmak sonra herhangi bir potansiyel bulaşıcı madde ile temas eden tüm yüzeyler dezenfekte edin. NOT: Kapak salyangoz ana bidonları, 1 ila 2 gün önce dökülme ve ışıktan korumak için 1. Salyangoz konak cercariae Hasat <ol><li> Yarım distile su ile oda sıcaklığına gelmesi dolu deterjan, 500ml temiz bir behere doldurun. Farklı tarihlerde miracidia ile enfekte konak salyangoz ile çalışıyorsanız, her enfeksiyon tarih için ayrı bir beher kullanmak (salyangoz gelecek deneyler için tekrar olacak, bu özellikle önemlidir). Beher boyutu da kullanıcı deneyimine bağlı olarak daha küçük olabilir. </li><li> Gerektiği gibi net bir standart akvaryum balığı ve genel amaçlı forseps kullanarak beher döken ve dikkatli bir şekilde yatırmak isteyen enfekte salyangoz ev sahipliği toplayın. </li><li> Acil bir dökülme Yeri beher akkor bir ışık kaynağı altında yaklaşık 8 ila 12 inç tepsisi. Işığı altında 1-2 saat bekletin. Parlak ışığa maruz kaldığında Cercariae salyangoz konak çıkın. </li><li> Cercariae karışımı dikkatlice salyangoz dışarı filtre. Karışımının son derece bulaşıcı olduğundan, ekstra güvenlik önlemleri alın. Unutmayın, cercariae doğrudan insan derisi nüfuz edebilir! </li><li> Herhangi bir partikül atık madde yerleşmelerine izin verme, yaklaşık 15 dakika ışık kaynağı altında karışımı değiştirin. </li><li> Cercariae beher altındaki enkaz kaçınarak, bir pipetlemeyin kullanarak temiz bir Erlenmeyer şişesinin içine aktarın. Şişesi 60 dakika, cercariae bir köşeye yerleşmek için izin - 45 için karanlık buz üzerinde yaklaşık 45 derecelik bir açıyla yerleştirin. </li><li> Süpernatantı 75 -% 90% 10 çamaşır suyu ya da% 70 etanol içeren beher kaldırmak ve mevduat, su damlaları pipetlemeyin cercariae damla içeren girmemesine dikkat çekici bir 50 ml pipetlemeyin kullanın. </li><li> Swirl Erlenmeyer şişesinde çözüm cercariae tekrar süspansiyon yavaşça cercariae içeren. Steril 50 ml konik tüpler için örnek aktarmak için bir pipetlemeyin kullanın. Karanlıkta 20 dakika boyunca buz üzerinde tekrar tüpleri yerleştirin. Cercariae karanlıkta tüp alt kısmına doğru geçer. </li></ol> 2. Schistosomules için cercariae Manuel dönüşüm Başlamadan önce: RPMI 1640 (RPMI,% 5 fetal sığır serumu, 1X Pen / Strep) tamamlamak ve 37 ° C'ye kadar sıcak olun. (Kullanılan fetal sığır serumu inkübasyon inaktive edildiğini çok önemlidir 56 ° C 1 saat schistosomes tamamlamak için duyarlı olmak gibi). <ol><li> Biohazard kaput, her biri 50 ml konik bir pipet veya vakum cihazı kullanılarak çözüm 5 ila 10 ml kadar süpernatant çıkarın. </li><li> Döner lok uygun boyutta bir şırınga iğnesi bulamaç, çift uçlu, 22 gauge takın. </li><li> Yavaş yavaş şırınga içine karışımı çizin. Bir şırınga içinde 50 ml tüpler cercariae toplayın. Damlayan dikkatli olun. </li><li> Unattached iğne ucu kadar olduğu gibi üzerinde dikkatle şırınga açın. Bulamaç iğne bu tarafında başka bir şırınga takın. </li><li> Cercariae dönüştürmek için iğne ile toplam 40 kez (20 kez ileri ve geri) Pass karışımı. </li><li> Karışım, alt şırınga bulunan ve üst şırınga boş olduğunu dikey gibi şırınga yerleştirin. Üst şırınga çıkarın ve% 70 Etanol dezenfekte. </li><li> Mevduat karışımı temiz bir yüksek duvarlı 100mm x 50mm kabına ya da kristalize çanak içine damla damla. % 70 Etanol iğne ve şırınga dezenfekte edin. </li><li> 37 ° C RPMI 1640 eksiksiz bir medya gibi ekleyinPetri kabı alt Luria suyu plakası dökme gibi tamamen kaplıdır. </li><li> Petri kabı merkezinde schistosomules toplamak için hafifçe Swirl. Sıçramasını önlemek. Not: Bu adım için daha yeterli merkezinde schistosomules görselleştirmek için kaput ışığı kapatmak için yararlı olabilir. </li><li> Hemen steril bir damlalık kullanarak yeni bir 12-kuyu hücre kültür plakasına konsantre schistosomules yatırın. </li><li> 2.9 ve 2.10 schistosomules artık çanak (yaklaşık 10 kat) merkezi bugünkü kadar tekrarlayın. Sonraki her taze bir kuyu koleksiyonu Depozito. </li><li> Her iyi yarısına kadar (~ 1.5 mL) prewarmed RPMI tam medya ile doldurun. </li><li> Schistosomules varlığı ve cercariae yokluğu doğrulamak için bir inverted mikroskop gözünüzde canlandırın. </li><li> Büyümeye CO 2 inkübatör schistosomules - 37 ° C ve% 5 CO 2. </li></ol> 3. Temsilcisi Sonuçlar: Kültür ortamı haline dönüştürülmüş schistosomules Bekleyen transferi, ters bir parlak alan mikroskobu altında (örneğin ekipman tabloya bakınız) görselleştirme Şekil 1, sadece dönüştürülmüş schistosomules iyi olduğu için benzer bir görüntü elde edilmelidir. Potansiyel kirleticiler, sağlam cercariae, kopmuş cercarial kuyrukları, veya diğer çöküntüleri içerebilir. Hiçbir inverted mikroskop varsa, standart bir mikroskop ya da hatta bir diseksiyon kapsamı schistosomules görselleştirmek için yeterli olacaktır. Bu işlem her zaman% 100 cercariae dönüştürmek unutmayın. <img src="/files/ftp_upload/3191/3191fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1: Dönüştürülmüş Schistosomulum <img src="/files/ftp_upload/3191/3191fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2: Cercariae ve Severed Tails

<ol><li>Ross, A. G., Bartley, P. B., Sleigh, A. C., Olds, G. R., Li, Y., Williams, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis.</a> N Engl J Med. 346, 1212-1220 (2002).</li>
<li>Steinmann, P., Keiser, J., Bos, R., Tanner, M., Utzinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis+and+water+resources+development%3A+systematic+review%2C+meta-analysis%2C+and+estimates+of+people+at+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis and water resources development: systematic review, meta-analysis, and estimates of people at risk.</a> Lancet Infect Dis. 6, 411-425 (2006).</li>
<li>Savioli, L., Albonico, M., Engels, D., Montresor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+the+prevention+and+control+of+schistosomiasis+and+soil-transmitted+helminthiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Int%22%5BJournal%5D)">Progress in the prevention and control of schistosomiasis and soil-transmitted helminthiasis.</a> Parasitol Int. 53, 103-113 (2004).</li>
<li>King, C. H., Dickman, K., Tisch, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reassessment+of+the+cost+of+chronic+helmintic+infection%3A+a+meta-analysis+of+disability-related+outcomes+in+endemic+schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Reassessment of the cost of chronic helmintic infection: a meta-analysis of disability-related outcomes in endemic schistosomiasis.</a> Lancet. 365, 1561-159 (2005).</li>
<li>Haas, W., Grabe, K., Geis, C., Pach, T., Stoll, K., Fuchs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+and+invasion+of+human+skin+by+Schistosoma+mansoni+cercariae%3A+the+key-role+of+L-arginine.+Parasitology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Recognition and invasion of human skin by Schistosoma mansoni cercariae: the key-role of L-arginine. Parasitology.</a> 124, 153-167 (2002).</li>
<li>Grabe, K., Haas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigation+within+host+tissues%3A+cercariae+orientate+towards+dark+after+penetration%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Res%22%5BJournal%5D)">Navigation within host tissues: cercariae orientate towards dark after penetration.</a> Parasitol Res. 93, 111-113 (2004).</li>
<li>Shiff, C. J., Cmelik, S. H., Ley, H. E., Kriel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+human+skin+lipids+on+the+cercarial+penetration+responses+of+Schistosoma+haematobium+and+Schistosoma+mansoni%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">The influence of human skin lipids on the cercarial penetration responses of Schistosoma haematobium and Schistosoma mansoni.</a> J Parasitol. 58, 476-480 (1972).</li>
<li>Saladin, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosoma+mansoni%3A+cercarial+responses+to+irradiance+changes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Schistosoma mansoni: cercarial responses to irradiance changes.</a> J Parasitol. 68, 120-124 (1982).</li>
<li>Chai, M., McManus, D. P., McInnes, R., Moertel, L., Tran, M., Loukas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+of+lung+schistosomula%2C+in+vitro+cultured+schistosomula+and+adult+Schistosoma+japonicum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling of lung schistosomula, in vitro cultured schistosomula and adult Schistosoma japonicum.</a> Cell Mol Life Sci. 63, 919-929 (2006).</li>
<li>Gobert, G. N., Tran, M. H., Moertel, L., Mulvenna, J., Jones, M. K., McManus, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+changes+in+Schistosoma+mansoni+during+early+schistosomula+development+and+in+the+presence+of+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Transcriptional changes in Schistosoma mansoni during early schistosomula development and in the presence of erythrocytes.</a> PLoS Negl Trop Dis. 4, (2011).</li>
<li>Basch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+Schistosoma+mansoni+in+vitro.+I.+Establishment+of+cultures+from+cercariae+and+development+until+pairing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Cultivation of Schistosoma mansoni in vitro. I. Establishment of cultures from cercariae and development until pairing.</a> J Parasitol. 67, 179-185 (1981).</li>
<li>Yoshino, T. P. &amp, Laursen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Schistosoma+mansoni+daughter+sporocysts+from+mother+sporocysts+maintained+in+synxenic+culture+with+Biomphalaria+glabrata+embryonic+%28Bge%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells.</a> J Parasitol. 81, 714-722 (1995).</li>
<li>Colley, D. G., Wikel, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosoma+mansoni%3A+simplified+method+for+the+production+of+schistosomules%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Schistosoma mansoni: simplified method for the production of schistosomules.</a> Exp Parasitol. 35, 44-51 (1974).</li>
<li>Lazdins, J. K., Stein, M. J., David, J. R., Sher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosoma+mansoni%3A+rapid+isolation+and+purification+of+schistosomula+of+different+developmental+stages+by+centrifugation+on+discontinuous+density+gradients+of+Percoll%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Schistosoma mansoni: rapid isolation and purification of schistosomula of different developmental stages by centrifugation on discontinuous density gradients of Percoll.</a> Exp Parasitol. 53, 39-44 (1982).</li>
<li>Cousin, C. E., Stirewalt, M. A., Dorsey, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosoma+mansoni%3A+ultrastructure+of+early+transformation+of+skin-+and+shear-pressure-derived+schistosomules%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Schistosoma mansoni: ultrastructure of early transformation of skin- and shear-pressure-derived schistosomules.</a> Exp Parasitol. 51, 341-365 (1981).</li>
<li>Lewis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 19, 1-1 (2001).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bazı potansiyel sorunları dönüşüm işlemi sırasında ortaya çıkabilecek; Ancak, bu protokol, bu sorunların en önlemek için tasarlanmıştır. Potansiyel bir tehlike genellikle adım 1.3 &#39;de hasat arta kalan enkaz nedeniyle ortaya çıkar bulamaç iğne, tıkanma. Bu sorunu önlemek için tüm partikül madde, 1.5 adım yerleşmek ve adım 1.6 cercariae dikkatli bir şekilde aktarmak için izin emin olun. Ayrıca, biyolojik güvenlik kabini içinde çalışmak, daha önce açıklandığı gibi, kişisel koruyucu ekipman kullanımı (hatta yüz kalkanlar) ve şırınga aşırı basınç kaçınma tavsiye edilir. Müstakil cercarial kuyrukları 2.9 adım sırasında kötü ayrılması göstergesidir medya, görüntülenebilir. Kuyrukları spazm gibi hareket sergiler ve farklı bir şekil var (bkz. Şekil 2) ve thusly schistosomules kolayca ayırt edilebilir. Schistosomules yerleşmelerine izin tamamlamak RPMI aşan schistosomules yıkama kuyrukları tarafından kaldırılabilir. Kuyrukları kayan kalacak ve kapalı vakumlu olabilir. Sağlam cercariae medya varsa, adım 2.5 dönüşüm düzgün idam değildi. Şekil 3b başvuru için sağlam bir cercaria bir görüntü tasvir edilmiştir. Bu sorun oluşursa, kullanılan bulamaç iğne uygun büyüklükte olduğunu sigorta. Ayrıca, cercarial karışımı iğne geçirilir kez, 40 kez genellikle cercarial kuyrukları% 100 kesme yaklaşım çok daha fazla olmasına rağmen, artmış olabilir. Schistosomules içine cercaria Dönüşümü ilk Colley ve Wikel (13) tarafından 1974 yılında tarif edilmiştir. O zamandan beri, schistosomules hazırlanması, bir iğne ve şırınga ile ya kesme strateji kullanarak Bu çalışmada gösterdiği gibi, bu protokolde tanımlanan veya vorteks bir yaklaşım kullanarak ve Percoll, gradyanlar ile ayrılmış (14, 15) ya da dönen olarak yapılmıştır. Schistosomules hazırlanması için bu iki teknik güzel Fred Lewis (16) ve uzun vadeli büyüme için daha fazla schistosomules kültür için daha fazla bilgi NIAID şiştozom Kaynak Merkezi (bulunabilir tarafından <a href="http://www.schisto-resource.org/">açıklanan www.schisto-</a> resource.org) .

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> 22g x 2-7/8 &quot;Bulamaç iğne </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-825-17G </td></tr><tr><td> RPMI 1640 Orta 1X (500ml) </td><td> Invitrogen </td><td> 11835030 </td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu (FBS) ısı inaktive </td><td> Invitrogen </td><td> 10082139 </td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 15070063 </td></tr><tr><td> Kristalize Bulaşık (100mm) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-741D </td></tr><tr><td> Genel Amaçlı Cımbızlar </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-316C </td></tr><tr><td> Salamura karides için Petco Akvaryum net </td><td> Petco </td><td> SKU: 1190954 </td></tr></tbody></table>

cercarial dönüşüm ve in vitro yetiştiriciliği schistosoma mansoni schistosomules

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

Şiştozom parazitler etken schistosomiasis kronik zayıflatıcı hastalığı, dünyada 200 milyon insanı etkileyen ve halk sağlığı ve sosyo-ekonomik etkileri (1-4) açısından paraziter hastalıklar arasında sıtma ile ikinci sırada yer alıyor. Şiştozom parazitler karmaşık bir yaşam döngüsü serbest yüzen aşamalarında müdahale molluscan ve memeli ev sahipliği yapan asalak bir yaşam arasındaki ¤ lantılarını trematod solucanlar. Kısaca, serbest yüzen cercariae schistosomules dönüşürken, cercariae kuyrukları kaybetmek ve bu süre boyunca salgılanan proteazlar yardımı ile cilde nüfuz konak memeli bozar. Schistosomules şimdi, konak bağışıklık sistemini kaçınmak, kırmızı kan hücrelerinin bir bağırsak sindirim için geliştirmek ve göç gerekir rağmen akciğer ve karaciğer portal sisteminin nihai hedefe giderken portal dolaşıma ve sonunda mezenterik damarlar (S. mansoni ) erkek ve dişi solucanlar çifti ve arkadaşı, her gün yüzlerce yumurta üretmek. Bazı yumurta, taze su, serbest yüzen miracidia (5-10) içine yumurtadan çıkar yumurta içine vücuttan atılır. Miracidia özel salyangoz türleri enfekte ve anne ve kızı da, yaşam döngüsünü tamamlayarak, enfektif cercariae üretmek sporocysts dönüşmek. Ne yazık ki, tüm şiştozom yaşam döngüsü in vitro kültüre, ancak infektif cercariae schistosomules dönüşebilir ve schistosomules vitro veya mikroarray analizi şiştozom gelişme analizi için hafta boyunca kültüre olabilir. Bu protokol, biz cercarial dönüşüm ve schistosomules in vitro kültür görsel bir açıklama sağlar. Biz salyangoz ana Biomphalaria glabrata bulaşıcı cercariae döken ve elle, bir bulamaç çift uçlu bir iğne kullanarak kendi kuyrukları ayırarak schistosomules haline dönüştürmek. , In vitro cercarial dönüşümü ve schistosomules kültür teknikleri, schistosomes, görselleştirme kolaylaştırır ve deneysel analizi için parazit toplanmasını kolaylaştırır. In vitro dönüşüm ve kültür teknikleri schistosomes yıl için yapılmış bir konak memeli, (11 kullanımını önlemek açıklanan 12), ancak hiçbir görsel protokoller tüm toplum için kullanılabilir olduğunu geliştirilmiştir var.

Biz bir tarif<em&gt; In vitro</em&gt; Flatworm parazit kültür schistosomula yöntemi<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Tatlı su salyangozu ara konak Biomphalaria glabrata enfektif cercariae hasat ve dönüşüm yoluyla.

Cercarial Dönüşüm ve In vitro Yetiştiriciliği Schistosoma mansoni Schistosomules

Schistosome parazitleri, dünya genelinde 200 milyondan fazla insanı etkileyen ve kronik olarak zayıflatıcı bir hastalık olan şistosomiyazın etkenleridir ve...

Bu prosedürün genel amacı, enfeksiyöz CRC'leri shisom'a dönüştürmektir. Bu işlem, öncelikle enfeksiyöz CRC'lerin salyangoz konakçıdan hasat edilmesiyle gerçekleştirilir. Enfeksiyöz CRC'ler konsantre edilir ve ardından çift taraflı bir iğne kullanılarak enfeksiyöz olmayan shisom'a dönüştürülür.Son olarak, shisomlar konsantre edilip bir kültür plağına toplanır ve 37 °C sıcaklık ile %5 karbon dioksit içeren RPMI ortamında inkübe edilir. Bu yöntem kullanılarak, FU cial veya cial kuyruk kontaminasyonuna sahip transforme shisomlar elde edilebilir. Transformasyon prosedürünün öğrenilmesi zor ve potansiyel olarak tehlikeli olabildiği için, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir.Cica'lar bulaşıcıdır ve yüksek konsantrasyonlardadırlar; bu nedenle izolasyon işleminin güvenli ve etkili bir şekilde ilerlemesi için hassas ve titiz bir uygulama gereklidir. Prosedürü laboratuvarımdaki araştırma asistanı John uygulamalı olarak gösterecektir. Standart bir akvaryum kepçesi ve pens kullanarak, temiz 500 mililitrelik bir beherin yarısını oda sıcaklığındaki distile su ile doldurun. Enfekte salyangozları behere aktarın.Beheri, akkor bir ışık kaynağının 8 ila 12 inç altına, bir acil dökülme tepsisi üzerine yerleştirin ve bir ila iki saat boyunca orada bırakın. Parlak ışığa maruz kalma, CRC'lerin salyangoz konakçıdan çıkmasını sağlar. Salyangozları çıkarmak için, doğrudan insan derisine nüfuz edebilen CRC'ler içeren enfektif suyla herhangi bir temastan kaçınmak amacıyla ekstra güvenlik önlemleri aldığınızdan emin olun.Salyangozları çıkarın, ardından partikül halindeki atık maddelerin erlenmeyer balonunun dibine çökmesini sağlamak için çözeltiyi bir ışık kaynağı altında yaklaşık 15 dakika boyunca bekletin. Atıklar çöktüğünde, beherin altındaki kalıntılara değmeden, bir pipet yardımıyla sirkülasyon sıvısını temiz bir erlenmeyer balonuna aktarın.Balonu buz üzerinde 45 derecelik bir açıyla yerleştirin. CRC'nin bir köşeye çökmesine izin vermek için çözeltiyi karanlıkta 45 ila 60 dakika inkübe edin. Parazitler çöktükten sonra, süpernatantın çoğunu uzaklaştırmak için 50 milliliter'lik bir pipet kullanın ve bunu dikkatlice atın.%10 çamaşır suyu veya %70 etanol içeren bir beher içinde, parazitleri yeniden süspande etmek için erlenmeyer balonunu hafifçe çalkalayın. Ardından, örneği steril 50 mililitrelik konik tüplere aktarmak için bir pipet kullanın. Tüpleri buza yerleştirin ve CRC'nin çökmesine izin vermek için bir kez daha 20 dakika boyunca karanlıkta inkübe edin.Parazitler çöktükten sonra, her tüpte beş ila 10 mililitre sıvı kalacak şekilde süpernatanların çoğunu uzaklaştırmak için bir pipet kullanın. Ardından, bir şırıngaya 22 gauge çift uçlu lure lock emulsifying iğne takın. Her tüpteki parazit içeren çözeltiyi yavaşça şırıngaya çekin.Enfeksiyöz karışımın çeker ocak içerisine damlamamasına dikkat edin. Şırıngayı, iğne yukarı bakacak şekilde dikkatlice döndürün ve iğnenin boşta kalan ucuna ikinci bir şırınga takın. CRC'yi dönüştürmek için karışımı iki şırınga arasında yaklaşık 20 kez ileri geri geçirin.Ardından, boş olan şırınga üstte kalacak şekilde şırıngaları dikey olarak konumlandırın. Üstteki şırıngayı dikkatlice çıkarın ve %70 Ethanol ile dezenfekte edin. Parazitleri damla damla temiz, yüksek duvarlı bir Pyrex kristalizasyon kabına aktarın.Ardından iğneyi ve şırıngayı %70 etanol ile dezenfekte edin. Sonrasında, parazitlerin daha iyi görüntülenmesine yardımcı olmak için kabı beyaz bir arka plan üzerine yerleştirin ve 37 °C'ye ön ısıtılmış RPMI ekleyerek Pyrex kabın tabanının tamamen kaplanmasını sağlayın.Steril bir damlalık kullanarak, shisomları merkezde toplamak için hafifçe çalkalayın. Konsantre shisomlardan bir miktar toplayın ve parazitleri yeni bir 12 kuyucuklu hücre kültür plakasına aktarın. Parazit kalmayana kadar bu durulama adımını tekrarlayın.Parazitler aktarıldıktan sonra, shisom varlığını doğrulamak için her kuyucuğu yaklaşık yarıya kadar sıcak RPMI ile doldurun. Plakayı ters ışık mikroskobu kullanarak görüntüleyin. Bu noktada, çoğu parazit shisom formuna dönüşmüş olmalıdır; bunlar, daha az modal olmaları ve karakteristik cial kuyruğuna sahip olmamaları nedeniyle CRC E'den ayırt edilebilir.Az sayıda sağlam CRC e kopmuş CRC cial kuyrukları veya diğer kalıntılar da mevcut olabilir. Shta daha sonra 37 °C ve %5 karbondioksit içeren bir inkübatörde, haftalık besiyeri değişimleri ile altı haftaya kadar büyütülebilir ve sürdürülebilir. Enfeksiyöz aria ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedür gerçekleştirilirken çift kat eldiven, kol koruyucular gibi önlemlerin alınması ile tesislerin ve biyotehlike davlumbazlarının uygun şekilde kullanılması gerektiğini unutmayın.

cercarial-transformation-vitro-cultivation-schistosoma-mansoni

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Schistosoma mansoni yumurta T hücre tip 2 (Th2) immün yanıt, parazit enfeksiyonu karakteristik, astım ve allerjik inflamasyonun güçlü uyarıcılar vardır. Bu protokol S. kullanır CD4 Th2 sitokin bağlı inflamatuar yumurtanın etrafında akciğer granülom oluşumu ile karakterize, akciğerin yanıt, eozinofili ve makrofaj aktivasyonu alternatif oluşturmak için mansoni yumurta enjeksiyon.

Gelen Yumurta kullanma<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Bir şekilde<em&gt; In vivo</emHelmint bağlı Akciğer iltihabı ve&gt; Model

Bu makalede büyük ölçekli axenic yalıtım ve insan kan fluke Schistosoma mansoni free-swimming miracidia toplanması için bir protokol ve onların sonraki işlem vitro kültür içine giriş için.

Kitle yalıtım ve Intramolluscan insan kan Fluke Schistosoma Mansoni aşamalarında Vitro ekimi

Trypanosoma cruzi Ajan Chagas hastalığının klinik olarak tanınan patoloji aniden geliştirmek uzun ömürlü asemptomatik enfeksiyondan üretir. Aşağıdaki araştırma Protokolü cinsel üst nesneden döl için aktarılan T. cruzi enfeksiyon çözülmeye bir kısa vadede ailesi tabanlı epidemiyolojik çalışma açıklar.

Naive arkadaşları için kadın ve erkek üzerinden Amerikan Tripanozomlar cinsel iletim

Burada, sporozoitler veya ikinci nesil merozoitler nükleofekting tavuk Eimeria parazitlerin kararlı transfeksiyon elde etmek için bir yöntem sağladı. Heterolog antijenik genleri ifade eden genetiği değiştirilmiş eimerian parazitler aşı dağıtım aracı olarak kullanılabilir.

Tavuk Eimeria Parazitlerinin Nükleofeksiyon uyup In Vivo Propagation

Sıtma parazitlerinin sivrisinek aşamaları üzerinde ayrıntılı araştırmalar, etkili bulaşma engelleme stratejileri tasarlamak için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, enfeksiyöz gametositlerin etkili bir şekilde nasıl kültüreılacağını ve daha sonra bu gametositlerin sivrisineklere nasıl beslendiğini gösterir P. falciparumsivrisinek aşamaları .

Plazmodium falciparum Yapay Membran Besleme Yoluyla Gametosit Kültürü ve Sivrisinek Enfeksiyonu

Üçüncü nesil lentiviral vektörler kullanılarak Echinococcus granulosus'un farklı gelişim evrelerinde hızlı geçici transdüksiyon tekniğini tanımladık.

Echinococcus granulosus'un Strobilated Formlarının Geçici Transdüksiyonu

Burada, pLEXSY sistemini kullanarak eGFP genini stabil bir entegre transgen olarak eksprese eden L. panamensis ve L . donovani suşlarını oluşturmak için kullanılan metodolojiyi açıklıyoruz. Transfekte edilen parazitler, seyreltme sınırlandırılarak klonlandı ve her iki türde de en yüksek floresan yoğunluğuna sahip klonlar, ilaç tarama testlerinde daha fazla kullanılmak üzere seçildi.

eGFP'nin Yapısal Ekspresyonu ile Leishmania Tür Suşlarının Gelişimi

Sıtma, enfekte sivrisinekler tarafından Plasmodium'un sporozoit aşamasının aşılanması yoluyla bulaşır. Transgenik Plazmodyum , sıtmanın biyolojisini daha iyi anlamamızı sağladı ve sıtma aşısı geliştirme çabalarına doğrudan katkıda bulundu. Burada, transgenik Plasmodium berghei sporozoitleri üretmek için aerodinamik bir metodolojiyi açıklıyoruz.

Genetiği Değiştirilmiş Plasmodium berghei Sporozoitlerinin Üretilmesi

Bu çalışma, Chagas hastalığından sorumlu patojen olan Trypanosoma cruzi'nin üç in vitro yaşam döngüsü aşamasında ultrayapı genişletme mikroskobunu gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol göstermektedir. Hücre iskeleti proteinleri ve pan-proteom etiketleme için optimize edilmiş tekniği dahil ediyoruz.

Ultrastrüktürel Genleşme Mikroskobu in Üç İn Vitro Yaşam Döngüsü Aşamaları Trypanosoma cruzi

Kimyasal genetik, bir kapı bekçisi kalıntısının, hedef lokusta farklı bir yan zincir içeren bir amino asit ile değiştirilmesini içerir. Burada, cdpk1'in hipomorfik bir alelini içeren mutant bir parazit oluşturduk ve mutant arka planda parazit tarafından benimsenen telafi edici yolları belirledik.

Bitki Benzeri Kinazların Hipomorfik Alelini Barındıran Mutant Bir Sıtma Parazitinde Telafi Edici Yolların Gelişimini Anlamak

Burada, Echinococcus granulosus'tan in vitro kültür koşullarını, izolasyonu ve hücre dışı veziküllerin (EV'ler) artan oluşumunu açıklıyoruz. Küçük EV'ler, dinamik ışık saçılımı ve transmisyon elektron mikroskobu ile karakterize edildi. Kemik iliği kaynaklı dendritik hücrelerin tutulumu ve fenotipik modülasyonları, konfokal mikroskopi ve akış sitometrisi kullanılarak incelendi.

Echinococcus granulosus'tan Küçük Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu ve Dendritik Hücre Alımı

Öğrenin, Schistosoma mansoni'nin enfeksiyöz sirkaryalarını Biomphalaria glabrata salyangozlarından toplayarak şistosomüllere dönüştürme yöntemini. Bu teknik, parazitoloji araştırmalarında güvenli in vitro kültür için kritik öneme sahiptir.

Cercarial Dönüşüm ve In vitro Yetiştiriciliği Schistosoma mansoni Schistosomules

Daha fazla video keşfet