Name: Birincil Fare trofoblast hücreleri ve trofoblast invazyonu Assay İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Öğrenin, fare plasentasından birincil trofoblast hücreleri izolasyonunu ve Matrigel invazyon analiziyle işlevlerini değerlendirmeyi. Bu yöntem, plasental biyoloji ve hücre davranışları araştırmaları için güvenilir bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar bu videoyu üretti Missouri Akademik Destek Merkezi Üniversitesi Yaratıcı Hizmetler ekibi teşekkür etmek isterdim. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Eunice Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü, hibe sayısı HD055231 tarafından desteklenmiştir

1. Fare plasentanın Diseksiyon <ol><li> Farelerde çiftleşme çiftleri ayarlayın. </li><li> İlerleyen günlerde her birinde, bir çiftleşme fiş varlığını kontrol edin. Bir fiş tespit edildiği gün 0.5 gün sonrası cinsel birleşme (DPC), 7. olarak kabul edilir. </li><li> Plasentası d 10.5 olgun plasentanın gelişimi ile plasenta mümkün başında temiz bir diseksiyon ile, gebeliğin istenen aşamada toplanabilir. Burada, 14.5 DPC göstermektedir. Verilen miktarlar ise, 10.5 DPC üzerine 40-60 plasenta ve 14.5 DPC 10-20 plasentası açıkça görülebilen bir trofoblast hücre tabakası verecektir. </li><li> Hamile fare Euthanize ve servikste kesme, rahim kaldırmak ve mesometrium boyunca. </li><li> Her konseptus (Şekil 1A) arasında kesilmiş keskin bir makas, kullanma. </li><li> Forseps, iki çift kullanarak, kesme kenarında rahim duvarına kavramak ve uzaklaşmayı, myometrium (Şekil 1B) kaldırma . Bir çift tırtıklı, (kavisli veya düz) orta ince forseps artı bir çift çok ince forseps (# 5, örneğin) tavsiye edilir. </li><li> Plasenta karşısında, plasenta teşhir, forseps veya makas ile desidua açın. Tek bir forseps bir çift ile uterus dokusu kavra, ayırmak için plasenta (Şekil 1C) altında başka bir forseps kaydırın. Eğer plasenta gerekli, ayrı fetüs ve fetal membranlar. Ayrıca plasental doku kaybetmeden diseksiyonu bütün desidual doku kaldırmak mümkün değildir, ancak ek desidual doku (soluk) yavaşça forseps ile soyulması ile plasenta yüzeyinden uzaklaştırılabilir. Biz daha fazla arıtma Percoll degrade üzerinde de durulacaktır. </li><li> Her diseksiyonlar bitene kadar 50 ml konik bir tüp içinde 25 ml buz gibi soğuk tampon içinde her bir ayrılma parçalara plasenta yerleştirin. Daha sonraki aşamalarda, iri ayrışma tampon içine aktarmak için önce makas veya jilet ile plasental doku kıyma. </li></ol>trofoblast hücrelerin alışını "&gt; 2. İzolasyonu <ol><li> 45-60 dakika için bir 37 ° C banyo içinde gevşek bir şekilde kapak konik boru ve bir yer. Yaklaşık her 10 dk pipetleme tarafından şiddetle ayrışma çözüm karıştırın. Toplam sindirim süresi yakından izlenmeli ve muhtemelen bazı deneme yanılma optimum hücre iyileşme elde etmek isteyecektir. Dokular 10 ml pipet geçirilecek gerekir, ancak doku görünür parçaları kalır. Overdigestion zayıf hücre hayatta kalma ve kaplama verimi ile sonuçlanır. Birkaç hücre kümeleri mevcut olduğunda Optimal hücre sağkalım ve kaplama verimliliği yerine tam ayrışma elde edildiğinde daha ortaya çıkacaktır. Tersine, underdigestion Percoll ayrışmadan sonra azalır saflığı yol açacaktır. Uygun sindirim noktasına ulaşıldığında, buz üzerinde yer tüp kollajenaz aktivitesini durdurmak için. </li><li> Sindirilmemiş malzemeleri çıkarın ve 5 dakika boyunca @ 500 xg'de santrifüj bir hücre süzgecinden çözümü geçirin. </li><li> Yıkamak için kaldırmak10 ml yıkama çözeltisi içinde tekrar süspansiyon ve süpernatant hücreler. 5 dakika @ 500 xg santrifüjleyin. </li><li> Santrifüj sırasında, 9.6 ml Percoll, 13.4 ml yıkama çözeltisi ve yüksek hızlı santrifüjleme için uygun olan bir 50 ml tüp içinde 1.1 ml ortam 10x 199 karıştırılarak Percoll solüsyon hazırlanır. </li><li> 2 mL yıkama solüsyonu içinde süpernatant ve tekrar süspansiyon hücre pelletini çıkarın. </li><li> Çözelti Percoll ve 4 de 30 dakika @ 30,000 x g'da santrifüj ile hücreler ekleme ° C. </li><li> Degrade bozmadan santrifüj tüpü çıkarın. Parlak bir ışık kaynağının önünde degrade, yerde tüp görselleştirmek için. Trofoblast bant (Şekil 2) bulun ve aşağıdaki kırmızı kan hücresi bant rahatsız etmemek için özen bir pipet yardımıyla aspire. Trofoblast bant hacmi 5-8 ml olacaktır. </li><li> 50 ml'lik bir konik tüpe trofoblastların aktarın. 45ml toplam hacme yıkama çözeltisi ekleme. </li><li> 5 dakika @ 500 xg santrifüjleyin. Süpernatantı ve kültür medi tekrar süspansiyonum (NCTC-135). Hücreler 37 ° C'de ve% 5 CO2 de ince tabaka Matrigel ya da plastik doku kültürü üzerinde kültive edilebilir. Günlük 10.5, her plasenta% 80-90 pozitif sitokeratin hangi kabaca 50.000 canlı hücreleri üretir. </li></ol> 3. Trofoblast invazyonu Assay <ol><li> 37 her Matrigel odası ve inkübe için 1-2 ml kültür ortamı (NCTC-135) ekle °, 30-90 dakika süreyle% 5 CO 2. </li><li> Orta çıkarın ve üst odacığı 2ml orta 1,5 ml x 10 5 taze izole hücreleri ekleyin. Alt membran yüzeyini kapsayacak şekilde alt kanadı 1 ml orta ekleyin. </li><li> 18-24 saat için ekler kültür hücreleri. </li><li> Bir köpük çubukla ovülden Pençe hücreleri ve Matrigel. </li><li> 2 ml PBS içinde üst ve alt bölme çalkalayın. </li><li> PBS içinde 1 ml% 4 paraformaldehit içinde 5 dakika için düzeltildi. </li><li> 400 ul DAPI (300m) ile alt kanadı doldurarak Leke ve 30 dakika inkübe edilir. </li><li> PBS içinde kısaca üç kez yıkayın. </li><li keskin bir ne b ile ekler membranlar><li> Kaydırmak için montaj ortam maddesi (PBS,% 50 gliserol) ve bir damla 10 ul ekle. Forseps kullanarak, damla membran yatıyordu. Orta bir 10 ul damla ekleyin, sonra dikkatlice lamel. </li><li> Fotoğraf ve sayım hücreler. Kullanılan mikroskop için uygun şark membran (aşağı cep tarafını yukarı veya hücre tarafı) emin olun. Image J yazılımı (Ulusal Sağlık Enstitüleri) bu amaç için kullanılabilecek bir el sayma özelliği içerir, can Adobe Photoshop veya manuel sayaç. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Fare plasentanın Diseksiyon. (A) rahim mesometrial yüzeyi boyunca, (sarı) yumurta kanalı boyunca kesilerek çıkarılır ve serviks (alt) olarak alır. Bireysel conceptuses sonra gösterildiği gibi, makas ile kesme ile ayrılabilir. (B) rahim duvar kesme rahim içinde iki yüzey forseps yerleştirerek ve fetus yakın ve uzak plasenta, anti-mesometrial tarafı boyunca yırtarak ile uzaklaştırılır. (C) Plasenta sonra forseps ile açgözlü ve plasenta ve uterus dokusu arasında bir kayma ile izole edilir. Umbilikal kord ve diğer extraembryonic membranlar daha sonra plasenta ayrılabilir. <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2,"> Trofoblastların Şekil 2. Percoll ayrılması. Santrifüj sonra, üç büyük grup solda karikatür gösterildiği gibi görünür, ve fotoğraf sağda olacak. Üst bant, hücre tortularını ve fibroblastlar içeren ve en çok belirgin olacaktır. Kırmızı kan hücreleri içeren altına yakın Sıkı (kırmızı) bant sadece diffüz trofoblast grup altında gözükecektir. Sadece fotoğraftaki ok sol gösterilen iki gibi Hücre agrega olasılıkla, trofoblast bandında görülen olacaktır. ove_content "&gt; <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3,. İstilacı trofoblastların (beyaz ok) zarın alt yüzeyi üzerinde görünen, Matrigel tabaka ve zar gözenekleri geçecek. Gözenekler (siyah ok başı) da görülebilir. Tüm zar yüzey ya da temsili bir numune alanına hücrelerin sayısı sayılır. Floresan DAPI nükleer boyanma bir gri görüntü hücrelerin görsel geliştirmek için ters edilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4,"> Şekil 4,. Trofoblast hücreleri tespit ve izole nüfusun saflık sitokeratin 7 (merkez, macenta) ile immüno-, değerlendirilebilir. Hücreler DAPI (üst, mavi) ile zıt edilir. Birleştirilmiş görüntü, alt.

<ol><li>Thordarson, G., Folger, P., Talamantes, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+placental+cell+culture+system+for+studying+the+control+of+mouse+placental+lactogen+II+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Development of a placental cell culture system for studying the control of mouse placental lactogen II secretion.</a> Placenta. 8, 573-585 (1987).</li>
<li>Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+term+human+trophoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of term human trophoblast cells.</a> Methods. Mol. Med. 121, 203-217 (2006).</li>
<li>Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification%2C+characterization%2C+and+in+vitro+differentiation+of+cytotrophoblasts+from+human+term+placentae%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae.</a> Endocrinology. 118, 1567-1582 (1986).</li>
<li>Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+reaction+patterns+in+first+trimester+placenta%3A+implications+for+trophoblast+isolation+and+purity+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening.</a> Placenta. 21, 733-741 (2000).</li>
<li>Librach, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((92-kD+type+IV+collagenase+mediates+invasion+of+human+cytotrophoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">92-kD type IV collagenase mediates invasion of human cytotrophoblasts.</a> J. Cell. Biol. 113, 437-449 (1991).</li>
<li>Schulz, L. C., Widmaier, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+leptin+on+mouse+trophoblast+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">The effect of leptin on mouse trophoblast cell invasion.</a> Biol. Reprod. 71, 1963-1967 (2004).</li>
<li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+FGF4%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4.</a> Science. 282, 2072-2075 (1998).</li>
</ol>

Biz ifşa etmek başka bir şey var.

Bu video olarak, fare plasenta trofoblast hücrelerin izolasyonu göstermektedir. Biz sonra trofoblast invazyonu için in vitro deney göstermektedir. Bu prosedür kullanıldığında, büyük ölçüde tamamen olmasa da, trofoblast hücre saf nüfus elde edilebilir. Daha fazla saflık gerekli ise primer insan trofoblast hücreleri için tarif edildiği gibi, manyetik boncuk ayırma ya da akış sitometrisi, yapılabilmektedir. Kollajenaz ayrışma adımın doğru uzunluğu her bir deney ile tespit edilmeli ve deneyimi ile öğrenmiş olacaktır. Altınd...

birincil fare trofoblast hücreleri ve trofoblast invazyonu assay İzolasyonu

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

Plasenta fetusun besin, gazlar ve büyüme faktörlerinin taşıma yanı sıra, atıkların ortadan kaldırılması için sorumludur. Böylece, plasental gelişim kusurları, anne ve fetus için önemli sonuçları vardır ve embriyonik ölümcül önemli bir nedenidir. Plasenta fetal kısmının başlıca bir hücre türüdürler trofoblast olup. Birincil fare plasental trofoblast hücreleri normal ve anormal plasental geliştirme çalışmaları için yararlı bir araçtır, ve hücre çizgileri, farklı olarak, izole edilmiş ve hamilelik belirli aşamalarında trofoblast incelemek için kullanılabilir. Buna ek olarak, transgenik fareler trofoblast primer kültürlerden plasental hücreleri içinde belirli genlerin rolü incelemek için kullanılabilir. Burada sunulan protokol Thordarson ve arkadaşları tarafından açıklama esas alınmaktadır. Bir Percoll gradient izole edilmiş fare plasentası gelen, saf bir trofoblast hücre popülasyonu elde etmek için kullanıldığı, 1,. Bu, daha yaygın olarak kullanmak için benzerİnsan trofoblast hücre izolasyonu 2-3 d yöntemleri. Saflık sitokeratin 7 4 için izole hücrelerin immünohistokimyasal boyama ile değerlendirilebilir. Burada, izole hücreler daha sonra in vitro 5-6 trofoblast invazivlik değerlendirmek için bir Matrigel işgali testi kullanılarak analiz edilmiştir. Işgal hücrelerin sayımı için immünsitokimya ve lekeli tarafından analiz edilir.

Bu protokol, biz bir Percoll gradyanı kullanılarak trofoblast hücrelerinin izolasyonu takiben gebelik d10.5 üzerinde fare plasenta diseksiyonu tarif. Daha sonra bir Matrigel işgali tayininde izole hücrelerin kullanımını göstermektedir.

Birincil Fare trofoblast hücreleri ve trofoblast invazyonu Assay İzolasyonu

Plasenta, besin maddelerinin, gazların ve büyüme faktörlerinin fetüse taşınmasının yanı sıra atıkların uzaklaştırılmasından sorumludur.
Bu nedenle, defektler...

Bu prosedürün genel amacı, hücre kültürü için farelerden primer plasental trofoblast hücrelerini izole etmektir. Ayrıca, bu hücrelerin bir kullanım alanı olan matrigel invazyon analizini göstereceğiz. Gebe fareden uterus çıkarılacak ve plasenta diseke edilecektir.Plasenta dokusu, tekil hücreler veya küçük hücre kümeleri elde etmek için enzimatik olarak sindirilecek ve hücreler bir protokol yoğunluk gradyanında ayrıştırılacaktır. Trofoblast hücrelerini içeren bant aspire edilecek ve elde edilen hücre popülasyonu ardından yıkanıp ekilecektir. Daha sonra, hücrelerin ince bir membranı kaplayan bir matrigel tabakası üzerine ekildiği invazyon analizini göstereceğiz.İnvaziv hücreler matrigel tabakasını sindirerek membrandaki sekiz mikrometrelik gözeneklerden geçecektir. Ardından hücreler sabitlenir ve membran çıkarılır. İnvazyon yapan hücreler daha sonra boyanabilir ve sayılabilir.Merhaba, ben Missouri Üniversitesi, Columbia, Missouri'deki Kadın Hastalıkları ve Doğum ile Kadın Sağlığı Bölümü'ndeki Schultz Laboratuvarı'ndan Kathleen Pennington. Bugün sizlere, gebe farelerden primer trofoblast hücrelerini izole etmek için kullandığımız prosedürü göstereceğiz. Ardından, hücreleri test etmek

isolation-primary-mouse-trophoblast-cells-trophoblast-invasion

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, fare blastosist blastosist trofoblast kök hücrelerinin izolasyonu ve derivasyon göstermektedir. Ayrıca kök hücre özelliği yanı sıra kültür farklılaşma indüksiyonu için bakım koşulları açıklar.

Blastosist Fare trofoblast Kök Hücre türetilmesi

Bu protokol, etkili bir şekilde, taze izole edilmiş beşeri villöz sitotrofoblastlar siRNA transfekte gözeneklendirilmesinin kullanılarak bu hücrelerde DNA-protein kompleksleri tanımlanması için bir yöntem tarif eder. Transfekte edilen hücreler, Western Blot ile izlenebilir ve EMSA 4-günlük kültür döneminde analiz eder.

Taze izole edilmiş insan Villöz sitotrofoblastlar ilgili siRNA transfeksiyonu ve EMSA analizi

Bu el yazması, hipoksi/reoksijenasyon altında kültürlenen, immün olarak saflaştırılmış insan villöz sitrofoblast hücrelerinin benzersiz bir in vitro modelini sunmaktadır. Bu model, melatonin gibi umut verici tedavilerin, artmış oksidatif stres ve değişmiş plasenta fonksiyonu ile ilişkili gebelik komplikasyonları üzerindeki koruyucu etkilerini incelemek için uygundur.

İnsan İlköğretim Trofoblast Melatonin Karşı Hipoksi Koruyucu Etkilerinin Eğitim için Hücre Kültürü Modeli / reoksijenasyon kaynaklı bozulması

Burada, murin embriyonik fibroblastlarının, Tfap2c, Gata3, Eomes ve Ets2'nin on günlük aşırı ekspresyonu ile tamamen işlevsel ve stabil trofoblast kök hücrelerine doğrudan dönüştürülmesi için bir protokol sunuyoruz.

Trofoblast Kök Hücre içine Fare Embriyonik Fibroblastlar Doğrudan Dönüşüm Protokolü

Burada sunulan örnekleme cytotrophoblasts birincil hücre kültürü için yalıtım ardından insan plasental villous dokusunun bir protokoldür. Trophoblasts ile TNFα tedavisinde iltihabı obez intrauterin ortamda beyannamedir ve moleküler hedeflerin plasenta iltihabı ile anne obezite sahiplenilip keşfi kolaylaştırır.

Plasenta Autophagy düzenlenmesi üzerinde anne obezite ile ilişkili iltihap etkisini incelemek için bir birincil insan Trofoblast modeli

Bu iletişim kuralı bir yöntem için birincil insan decidual hücreleri çeşitli uygulamalar (Yani immunocytochemistry, Akış Sitometresi, vb) için kullanılan terim placentae fetal membranlar toplanan yalıtım gösterir hedefleyen farklı hücre popülasyonlarının gebelik komplikasyonları olarak rol çalışmak için.

Dönem Placentae Fetal membranlar birincil insan Decidual hücre izolasyon

Burada, üç tüp bebek deneyleri kullanarak insan Trofoblast hücreleri hücre hareketinde değerlendirmek için son derece erişilebilir bir iletişim kuralı mevcut: sıfırdan tahlil, transwell istila tahlil ve Hücre proliferasyonu tahlil.

Vitro deneyleri içinde geçiş, işgal ve ölümsüzleştirdi insan birinci üç aylık dönem Trofoblast hücre hatları yaygın değerlendirmek için

İn vitro hücre invazyonu assay, protein matrisini içeren hücre kültürü eklemlerini kullanarak invazyon ve göç için hücresel potansiyelin ölçülmesi ile kanser metastifinin potansiyelini ölçmek için kullanılır. Hücreler protein matrisinde ve gözenekli membrandan, bir kemoçekiciye doğru göç etmek ve sonra ışık mikroskobu ile ölçülebilir.

Onkojenik hücre davranışının bir ölçüsü olarak bir In vitro Invazif tahlil içinde Mouse mammary tümör hücrelerinin kullanımı

Burada, vitrifiye insan blastosistlerinin ısınması, in vitro implantasyon dönemi boyunca ekinde, tek hücrelere sindirilmesi ve daha fazla araştırma için erken trofenlast hücrelerinin toplanması için bir yöntem tanımlıyoruz.

Peri-implantasyon Aşamasında Trophoblast Hücrelerinin Tek Hücre Li Hücre Koleksiyonu İnsan Embriyoları

Mevcut protokol, trofoblast hücreleri gibi hücrelerin, hücre dışı bazal membran matrisinin bir tabakası üzerinde kılcal benzeri yapılar halinde organize olduğu klasik in vitro anjiyogenez-tüp oluşum testinde oluşan tüp benzeri yapıların geri kazanılmasına izin verir. Geri kazanılan yapılar, çeşitli biyokimyasal analizler için RNA ve protein izolasyonu için kullanılır.

Farklılaşma İşaretleyici İfade Analizi için Anjiyogenez-Tüp Oluşum Testinden Trofoblast Hücre Geri Kazanımı

Bu protokol, insan termi plasentalarının decidua bazalis ve koriyonik membranından primer HLA-G+ ekstravillous trofoblastlarının (EVT) arındırılması, karakterizasyonu ve kültürünü sağlar. Birincil EVT kültürleri 96 saat boyunca canlılık korur; bu da örnek eşleştirilmiş anne bağışıklık hücreleriyle birlikte kültür yapılmasına ve ardından etkileşimlerinin akış sitometrik ve moleküler analizine olanak tanır.

İnsan termi plasenta dokularından HLA-G+ ekstravillous trofoblastların fenotipleme ve fonksiyonel analiz için arındırılması

Öğrenin, fare plasentasından birincil trofoblast hücreleri izolasyonunu ve Matrigel invazyon analiziyle işlevlerini değerlendirmeyi. Bu yöntem, plasental biyoloji ve hücre davranışları araştırmaları için güvenilir bir model sunar.

Birincil Fare trofoblast hücreleri ve trofoblast invazyonu Assay İzolasyonu

Daha fazla video keşfet