Name: Vasküler Endotel Yüksek Lumen Basıncı Görüntüleme Lökosit Adezyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: Öğrenin, yüksek basınçlı damarlarda lökosit adezyonunu canlı görüntüleme yöntemini. Fare veya sıçan karotis arterleri kullanılarak inflamasyon ve hipertansiyon mekanizmaları incelenir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmada, Victoria Hükümeti OIS Programı, Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi, Avustralya, program ve proje hibeleri (Toz-JPF Chin) ve yüksek lisans bursu (D Michell) tarafından kısmen desteklenmiştir.

1. Karotid arterlerin görme <ol><li> CO 2 / O 2 boğulma yoluyla Euthanase10 hafta eski Sprague Dawley rat. </li><li> Gemilerin minimum esneme sağlamak Vergi aort ve kalp ile sağ ve sol karotis arterler. </li><li> Buz Krebs tampon karotid arterler aorta ve kalp ayrı ve yakın diseksiyon. </li><li> Monte etmeden önce buz üzerinde Krebs izole damarlarda tutun. </li></ol> Yaklaşık. süresi = 45 dakika 2. Astar geminin kamara <ol><li> 37 tampon aracılığıyla ° C; carbogen gaz (% 5 CO 2% 95 O 2) beslerken fizyolojik pH muhafaza geminin kamara floş Krebs tampon proksimal ve distal konektörlerdeki </li><li> Tüp olun ve kanüller tamamen kızardı ve hizalanır. </li><li> Krebs tampon (proksimal) P1 ve P2 (distal) dönüştürücüler ile yıkayın. Dönüştürücüler içinde hava kabarcıkları sağlamak için Kapat musluklar. </li><li> Dönüştürücüler gelen konektörlere bağlayın ve hiç hava kabarcığı sağlamak daha Krebs tampon tekrar yıkayın. Odaya musluğu açıp kapatın. </li></ol> Yaklaşık. süresi = 15 dakika 3. Geminin kamara basınçlandırma <ol><li> Basınçlı ekipmanlar açın: basınç servo, basınç monitörü, peristaltik pompa (Şekil 1). </li><li> Hiç hava kabarcığı sağlamak 20 mmHg (1 arama), tüp aracılığıyla otomatik çalıştırmak Krebs tampon baskı ve basınç servo peristaltik pompa ile. </li><li> Kapalı P2 dönüştürücü boru bağlayın. Basınç kararlı hale gelecektir. </li><li> Kabarcıkları sonra kapatabilir dışarı atılması için geminin odasına P2 musluğu açın. </li><li> Krebs tamponu (5 - 7 ml) ile banyo doldurun. </li></ol> Yaklaşık. süresi = 10 dakika 4. Montaj gemi <ol><li> Her kanül üzerine bir diseksiyon mikroskobu yer siyah polyester bağları (Şekil 2) altında. </li><li> Kanüller ve kanül sahipleri dışında hareket ettirin ve montaj ¼ P1 kanül üzerine damar (aort kemer sonu). Geminin gözyaşı olun. </li><li> Krebs tamponu ile dolu bir şırınga kullanarak yavaşça P1 transdüser aracılığı ile geminin aşırı kan dışarı floş. Odasına P1 kapatın. </li><li> Polyester kravat P1 kanül Güvenli gemi. </li><li> P2 kanül üzerine montaj için kanüller / yakın kanül sahipleri taşıyın. </li><li> Mount gemi distal ucu (~ ¼ uzunluğu) distal kanül üzerine. Polyester kravat ile sabitleyin. </li></ol> Yaklaşık. süresi = 20 dakika 5. Gemi basınçlandırma <ol><li> Geminin herhangi bir bükülme veya streç sağlamak için kanül sahipleri ayarlayın. </li><li> P1 ve P2 odasının kapalı basınç servo manuel otomatik geçiş yapar. 10 saniye içinde basıncı sürekli bir azalma var basınç servo kontrol edin. Varsa, bir sızıntı meydana geliyor ve bağlantıları ve dönüştürücüler yerde güvenli olması gerekir. </li><li> Geri basınç odasına otomatik olarak sonra açık P2 servo ayarlayın. Mikroskop altında odasına musluk açıldığında damar genişler gözlemliyoruz. </li><li> Kılavuzuna basınç servo geçin. 10 saniye içinde basıncı sürekli bir düşüş için tekrar kontrol edin. Bir sızıntı varsa sonra sistem sıkı baskı ve geminin bir delik olması muhtemel değildir. </li><li> Otomatik açık P1 odasına geri dönün. Manuel ayar basıncı sabit kalır olduğunu kontrol edin. </li><li> Eğer herhangi bir sızıntı, manuel ayar artış kadran 2 (40 mmHg). </li><li> Otomatik olarak ayarlayın ve mikroskop altında damar dikkat. Gerekirse, manuel ayar sızıntıları vessel.Check hiçbir bend sağlamak için kanül sahibinin ayarlayın. </li><li> 5.7 istenen basınç ulaşana kadar 3 (60 mmHg), 4 (80 mmHg) ve çevirmeli artan adımları 5.6 tekrarlayın. </li></ol> Yaklaşık. süresi = 15 - 30 dakika 6. Basınçlı gemi kuluçka <ol><li> Sıcaklık kontrolörü seti - 37 ° C bağlayın </li><li> Damar odasının banyo içine ikinci bir peristaltik pompa serpmek Krebs tampon (1 ml / dk). </li><li> Banyo sadece üst katmanı sağlamak odasına aspiratör kaldırılır bağlayın. </li><li> Basınçlı kap, otomatik olarak ayarlanan basınç ile 1 saat 37 ° C'de inkübe edin. </li><li> Basıncı periyodik olarak (otomatik geçiş) sızıntı değildir kontrol edin. </li><li> Sadece inkübasyon sırasında banyo bileşik ekleyerek çeşitli farmakolojik müdahalelerin etkileri görülebilir. </li></ol> Yaklaşık. süresi = 1 saat 7. Basınçlı kap tam kan ile perfüze <ol><li> İnkübasyon sırasında en az 7.5 ml insan tam kan / 40 U heparin / ml kan toplanan gemi edinin. 50 ml şahin kuluçkaya 37 ° C. </li><li> T 10 dakika önce37 ° de 10 dakika VybrantDil (1:1000) ile kuluçka etiket kan ° C karanlıkta. </li><li> 10 dakika sonra, bir şırınga kabarcıkları temizleyerek, kan toplama ve 37 olarak belirlenmiş bir ısı ceketi ° C ile bir şırınga pompası üzerine eklemek </li><li> P1 transdüser Kapatma odası / gemi ve şırınga ve atık tüp bağlayın. </li><li> 1000 mcL / atık boru aracılığıyla herhangi bir kabarcıkları dakika Temizle kan. </li><li> P1 odasına açın. Basınç servo istenen basıncı sağlamak için otomatik olarak ayarlanır. </li><li> 100 mcL / dak kan serpmek. </li><li> Bir dijital kamera kayıt 1 perfüze geminin 15 saniye boyunca iki alan, 3, 5, 7.5 ve 10 dakika birleştiğinde bir floresan mikroskop kullanarak. </li><li> Perfüzyon endotel bütünlüğü ve fonksiyonu gibi inflamatuvar yanıtı daha doğrulamak için myograph ve adezyon molekülü ekspresyonu immünohistokimyasal olarak tespit edilebilir gibi farmakolojik teknikler ile tespit edilebilir. </li></ol> Yaklaşık. süresi = 15 dakika 8. Temsilcisi Sonuçlar: Basınç odasının kurulum şematik diyagramı Şekil 1'de gösterilmiştir. Floresan mikroskop sonuçları bir dijital kamera canlı video kayıtları üzerinden anında görüntülenebilmekte. Temsilcisi video görüntüleri lökosit 10 saniye boyunca sabit kaldı endotel yapışık olarak kabul edilir Şekil 3'te görülmektedir. Sürekli bir döngü yapıştırılır hücreleri üzerinde video kayıtları ile bir başına ortalama alanı olarak sayılabilir. , Hem de düşük (Şekil 3A) ve yüksek basınç (Şekil 3B) yapışma bir miktar neden olsa da yüksek intraluminal basınç lökosit adezyonu önemli bir artış görülür ve bu da kantitatif olarak gösterilmiştir (Şekil 4) . <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Basınçlı ex vivo geminin kamara şematik bir proksimal (P1), damar içinde manipüle kan basıncı sağlayan bir dönüştürücü ve distal (P2) dönüştürücüler bağlı kanüle bir gemi . Perfüzyon P1 dönüştürücü ve basınç yoluyla P2 transdüser ile korunur. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Bağları olan Cannuala Siyah polyester bağları her kanül bağlıdırlar. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Temsilci video görüntüleri 80 mmHg (A) ve 120 mmHg altında floresans Dinamik hücre adezyon (kırmızı ok) (B) perfüzyon 10 dakika sonra. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4, 1 saat düşük inkübasyon (80 mmHg) ve yüksek basınç (120 mmHg) sonra Sprague Dawley Lökosit yapışma arterler karotid . *** P &lt;0.001, Bonferroni post hoc testi kullanılarak 2-yönlü tekrarlayan ölçümler ANOVA ile analiz gibi.

<ol><li>Lopez, A. D., Mathers, C. D., Ezzati, M., Jamison, D. T., Murray, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+and+regional+burden+of+disease+and+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global and regional burden of disease and risk factors.</a> Lancet. 367, 1747-1757 (2001).</li>
<li>Szczech, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+kidney+injury+and+cardiovascular+outcomes+in+acute+severe+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Acute kidney injury and cardiovascular outcomes in acute severe hypertension.</a> Circulation. 121, 2183-2191 Forthcoming.</li>
<li>Rodriguez-Garcia, J. L., Botia, E., de La Sierra, A., Villanueva, M. A., Gonzalez-Spinola, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+elevated+blood+pressure+and+its+management+on+the+short-term+outcome+of+patients+with+acute+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Significance of elevated blood pressure and its management on the short-term outcome of patients with acute ischemic stroke.</a> Am J Hypertens. 18, 379-384 (2005).</li>
<li>Levy, D., Larson, M. G., Vasan, R. S., Kannel, W. B., Ho, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+progression+from+hypertension+to+congestive+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">The progression from hypertension to congestive heart failure.</a> JAMA. 275, 1557-1562 (1996).</li>
<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).</li>
<li>Riou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+pressure+promotes+monocyte+adhesion+to+the+vascular+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">High pressure promotes monocyte adhesion to the vascular wall.</a> Circ Res. 100, 1226-1233 (2007).</li>
<li>Ley, K., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial%2C+not+hemodynamic%2C+differences+are+responsible+for+preferential+leukocyte+rolling+in+rat+mesenteric+venules.+Circ+Res%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Endothelial, not hemodynamic, differences are responsible for preferential leukocyte rolling in rat mesenteric venules. Circ Res.</a> 69, 1034-1041 (1991).</li>
<li>Bernhagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIF+is+a+noncognate+ligand+of+CXC+chemokine+receptors+in+inflammatory+and+atherogenic+cell+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment.</a> Nat Med. 13, 587-596 (2007).</li>
<li>Woollard, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+levels+of+soluble+P-selectin+mediate+adhesion+of+leukocytes+to+the+endothelium+through+Mac-1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological levels of soluble P-selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-1 activation.</a> Circ Res. 103, 1128-1138 (2008).</li>
<li>Eberth, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+pulsatility+in+hypertensive+carotid+artery+growth+and+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Importance of pulsatility in hypertensive carotid artery growth and remodeling.</a> J Hypertens. 27, 2010-2021 (2009).</li>
<li>Cooke, J. P., Rossitch, E., Andon, N. A., Loscalzo, J., Dzau, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+activates+an+endothelial+potassium+channel+to+release+an+endogenous+nitrovasodilator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Flow activates an endothelial potassium channel to release an endogenous nitrovasodilator.</a> J Clin Invest. 88, 1663-1671 (1991).</li>
</ol>

Çalışma protokolü Alfred Tıbbi Araştırma ve Eğitim Precinct Hayvan Etik Kurulu ve Alfred Hastanesi Etik Komitesi tarafından onaylandı.

Bu, gerçek zamanlı olarak basınçlı koşullar altında bozulmadan izole kan damarlarının endotele lökosit adezyonu incelemek için modifiye edilmiş bir yöntemdir. Perfüzyon yalnız geminin odası, büyük fare ve sıçan damarları pro-inflamatuar suşlarının hızlı bir doğrulama sağlar. Etkinleştirilmesi basınç manipülasyon dinamik hücre etkileşimleri böylece daha iyi taklit-fizyolojik çok yüksek intraluminal basıncı ve fizyopatolojik koşullardaki düşük uyulması gereken sağlar. Damarların çapı da yeterli hücre görüntüleme programı kullanarak ve bu nedenle kayma akışı ve hızı belirlenir ve bu yüzden manipüle edilebilir ölçülebilir. Kendi myograph yetenekleri ile, banyo yerleştirilir farmakolojik müdahaleler, mekanik ve sinyalizasyon yolaklar çalışmaları sağlayan bu model ile deneysel koşullar altında mümkün olan başka bir boyut ekleyin. Endotel korunması basınç manipülasyon sırasında teyit mümkün olmasa bile, ACh ve PE yanıtları yazılan perfüzyon 9 yapılabilir. Bu kurulum hücre-hücre etkileşimleri pulsatil kan akımı, ne de sistolik ve diyastolik kan basıncı etkileri intraluminal basınç etkilerini göstermektedir dikkat edilmelidir. Ayrıca, lökosit adezyonu akut basınç değişiklikleri gözlenirken, bu kurulum da kronik basınç etkileri (yani artan inkübasyon sürelerinde ve kronik basınç hayvan modeli kullanarak) bakmak için kullanılan olabilir. Sprague Dawley karotis arterler bu set göstermiştir ama diğer suşları ve tür kanül boyutuna uygun düzenlemeler ile kullanılıyor olabilir. Gerçekten de, hayvanların yaş ve ağırlık seti kadar her gemi için bireyselleştirilmiş gerektiğini, böylece damar çapı etkiler ve dikkat etmek önemlidir. Bağ dokusu yakın ve dikkatli bir diseksiyon derece lökositlerin görselleştirme artırabilir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif / ekipman Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Mikroskop </td><td> Carl Zeiss, Inc. </td><td> Stereo Discovery V.20 </td><td></td></tr><tr><td> PHD 2000 Şırınga Pompa </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 70-2016 </td><td></td></tr><tr><td> Dijital Kamera ve Denetleyici </td><td> Hamamatsu ORCA-ER </td><td> C4742-95 </td><td></td></tr><tr><td> Floresan Aydınlatma Sistemi </td><td> Lümen Dynamics </td><td> X-Cite 120 </td><td></td></tr><tr><td> Gemi Odası </td><td> Oturma Sistemleri Enstrümantasyon </td><td> CH/1/SH </td><td></td></tr><tr><td> Basınç Servo Controller ve Peristaltik Pompa </td><td> Oturma Sistemleri Enstrümantasyon </td><td> PS-200 </td><td></td></tr><tr><td> Perfüzyon basıncı Monitor </td><td> Oturma Sistemleri Enstrümantasyon </td><td> PM - 4 </td><td></td></tr><tr><td> 2 x Basınç Transducer </td><td> Oturma Sistemleri Enstrümantasyon </td><td> PT - F </td><td></td></tr><tr><td> Sıcaklık Kontrolör </td><td> Oturma Sistemleri Enstrümantasyon </td><td> TC-01 </td><td></td></tr><tr><td> Peristaltik Pompa </td><td> Instech Laboratories, Inc. </td><td> P720 </td><td></td></tr><tr><td> VybrantDil hücre-etiketleme çözümü </td><td> Invitrogen </td><td> V-22885 </td><td> 1:1000 kullanın. </td></tr></tbody></table>

vasküler endotel yüksek lumen basıncı görüntüleme lökosit adezyon

Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Dünya çapında, hipertansiyon, nüfusun yaklaşık dörtte biri olması için bildirilen ve mortalite dünya çapında önde gelen biyomedikal risk faktörü. Vasküler hipertansiyon, endotel disfonksiyonu ve ateroskleroz ve 2 kronik böbrek hastalığı, felç 3 ve 4 kalp yetmezliği gibi çeşitli hastalık durumlarında önde gelen artış inflamasyon ile ilişkili . Bir ilk adım aterogenez yol açan vasküler inflamasyon, endotel ile yuvarlanma, bağlama, bağlılık ve lökositlerin sonraki göçüne içeren yapışma kaskad. İşe Alım ve lökositlerin endotele birikimi vasküler hücre adezyon molekülü-1 (VCAM-1), hücre içi hücre adezyon molekülü-1 (ICAM-1) ve E-selektin gibi artar gibi adezyon moleküllerinin bir upregülasyonu aracılı sitokin ve kemokin serbest bırakılması ve reaktif oksijen türlerinin bir upregülasyonu 5 in vitro yöntemleri gibi statik yapışma deneyleri, hücre-hücre adezyon yer mekanizmalarının yanı sıra hücre adezyon moleküllerinin analiz belirlemek için yardımcı olur . In vitro çalışmalar önceki istihdam Yöntemleri endotel üzerindeki akut basınç artar monosit adezyonu, adezyon molekülleri ve inflamatuvar belirteçler 6 Bununla birlikte, in vitro tayinlerde çok benzer, bu bulgular, gerçek zamanlı olarak yapılmış değil bir upregülasyonu yol açabileceğini göstermiştir fizyolojik akış koşulları altında, ne de tam kan. Bu nedenle, in vivo testleri giderek vasküler inflamasyon ve plak gelişimi göstermek için hayvan modellerinde kullanılmaktadır. Intravital mikroskopi artık yaygın lökosit adezyonu, haddeleme, göç ve göçüne 7-9 değerlendirmek için kullanılır. In vivo çalışmalar, endotelyal adezyon lökosit üzerinde basınç etkilerini birleştirerek daha geniş. Böyle bir çalışmada sadece 10 immünhistokimya ile değerlendirildi arteriyel büyüme ve remodeling ama inflamatuvar belirteçler kayma akışı ve gerçek zamanlı etkileri inceler. Burada bozulmamış basınçlı kan damarları tam kan perfüzyon kullanarak gerçek zamanlı lökosit adezyonu kayıt için bir model sunuyoruz. Metodolojisi, sağlam damarlarında lökosit-endotel yapıştırıcı etkileşimleri gerçek zamanlı analiz sağlayan bir ex vivo geminin kamara perfüzyon modeli 9 bir değişiklik . Bizim değişiklik intraluminal basınç 200 mmHg sadece fizyolojik akış koşulları değil, aynı zamanda basınç şartları altında çalışması için izin manipülasyon sağlar. Basıncı kasılmaların kâğıda çizilmesi sistemleri daha önce damar duvar ve lümen çapı 11 gibi damar daralma gözlemlemek için gösterilmiş olsa da bu gerçek zamanlı olarak lökosit leşimlerini gösteren ilk kez . Burada sıçanlardan alınan hasat ve floresan mikroskop birleştiğinde bir ölçüye göre akış odasına kanüle karotid arterler kullanılarak tekniği göstermektedir. Geminin kamara görüntü gemi kısa çalışma mesafesi ile geniş çaplı bir objektif lens sağlayan büyük bir alt coverglass ile donatılmıştır. Ayrıca, seçilen agonist ve / veya antagonistleri daha fazla hücre adezyon kontrol mekanizmalarının araştırılması için kullanılabilir. Intravital mikroskopi üzerinden bu yöntemin avantajları invaziv cerrahi hiçbir ilgisi ve bu nedenle daha yüksek bir verim elde edilebilir. Intravital sadece sistemik inhibitörü tedavisi sağlar iken Bu yöntem aynı zamanda istenen gemi lokalize inhibitörü tedavisi kullanımını mümkün kılar.

Bu hasat basınçlı kaplar endotele lökosit yapışma görselleştirmek için bir yöntemdir. Bu teknik, bu nedenle yüksek kan basıncı fizyopatolojik koşullardaki taklit-200 mmHg intralüminal basınca kadar farklı kayma akışı altında vasküler yapışma eğitimi sağlar.

Vasküler Endotel Yüksek Lumen Basıncı Görüntüleme Lökosit Adezyon

Dünya genelinde hipertansiyonun nüfusun yaklaşık dörtte birinde görüldüğü bildirilmektedir ve bu durum, dünya çapında mortalite için önde gelen biyomedikal risk faktörüdür. ...

Bu prosedürün genel amacı, toplanmış basınçlı damarlarda lökositlerin endotelyuma bağlanmasını görselleştirmektir. Bu işlem, öncelikle bir sıçan veya fareden karotis arterinin izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, damar basınçlı bir hazneye monte edilir.Ardından kap basınçlandırılır ve istenen basınçta bir saat boyunca inkübe edilir. Son olarak, işaretlenmiş tam kan, basınçlandırılmış kaptan geçirilir. Nihayetinde, bir hassas pompa, servo motor ve floresan mikroskobuna bağlı özelleştirilmiş bir ex vivo damar odası aracılığıyla, lökositlerin endotelyuma gerçek zamanlı yapışmasını gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu tekniğin statik adezyon deneyleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, lökosit adezyonunun tam kan kullanılarak sağlam, fonksiyonel arterlerde gözlemlenebilmesidir. Bu yöntem, yüksek intralüminal basıncın inflamasyon üzerindeki etkisi ve bunun ateroskleroza nasıl katkıda bulunduğu gibi hipertansiyon çalışmalarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. 10 haftalık, spread dolly sıçanlarından karotis arterlerini izole edip perfüzyon haznesini hazırlayıp basınçlandırdıktan sonra, önce her bir kanül üzerine siyah polyester bağlar yerleştirerek, ardından damarı banyoya taşıyıp damarın dörtte birini P1 kanülüne sabitleyerek damarı bir diseksiyon mikroskobu altında monte edin.Krebs tamponuyla dolu bir şırınga kullanarak damarı yırtmamaya dikkat edin. Fazla kanı P1 transduseri aracılığıyla damardan nazikçe uzaklaştırın. P1'in kamaraya olan bağlantısını kapatın.Polyester bağ ile damarı P one kanülüne sabitleyin. Kanülleri ve kanül tutucuları, P two kanülüne monte etmek için yaklaştırın. Damarın distal çeyrek ucunu P two kanülüne monte edin.Kabı basınçlandırmaya başlamak için bir polyester bağ ile sabitleyin. P bir ve P iki hazneye kapalıyken, kapta herhangi bir bükülme veya gerilme olmadığından emin olmak için kanül tutucuları ayarlayın. Basınç servosunu otomatik moddan manuel moda getirin.10 saniye içinde basınçta bir düşüş olmadığını doğrulamak için basınç servosunu kontrol edin. Basınçtaki bir azalma, bir sızıntı olduğunu gösterir ve basınç sızdırmazlığını sağlamak için bağlantıların ve transduserin yerine sabitlenmesi gerekir. Basınç servosunu tekrar otomatiğe ayarlayın, ardından P iki'yi mikroskop altındaki kamaraya açın ve damarın genişlemesini gözlemleyin.Musluk hazneye açıkken basınç servosunu manuel moda getirin. Basınçta herhangi bir düşüş olup olmadığını tekrar kontrol edin.Basınç düşüşü devam ediyorsa sistem basınç sızdırmaz değildir ve kapta muhtemelen bir delik vardır. Tekrar otomatik moda geçin ve P1'i hazneye açın. Manuel ayarda basıncın stabil kaldığını kontrol edin.Kararlı ise, kadranı ikiye getirerek kabı 40 millimeter of mercury basınçlandırın. Otomatik moda geçin ve kabı mikroskop altında gözlemleyin. Gerektiğinde, manuel ayarda kabın bükülmediğinden emin olmak için kanül tutucusunu ayarlayın.Sızıntıları kontrol edin. Ardından, istenen basınca ulaşana kadar kabı mikroskop altında gözlemlemek için, arada otomatiğe geçerek kadranı birer birer artırın. İstenen basınca ulaşıldığında, hazneyi stereo mikroskoba taşıyın.37 °C'ye ayarlanmış sıcaklık kontrol cihazını bağlayın. Ardından, banyodaki Krebs tamponunun taze kalmasını sağlamak için peristaltik pompayı ve aspiratörü bağlayın. Basınçlı kabı 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin.Sızıntıları periyodik olarak kontrol edin. Karanlık ortamda, canlı boya ile toplanmış 7,5 milliliters tam kan içeren tüpleri etiketleyin. Ardından 37 degrees Celsius sıcaklıkta 10 dakika boyunca inkübe edin.Kanı bir şırınga ile toplayın, varsa hava kabarcıklarını temizleyin ve şırıngayı 37 °C'ye ayarlanmış bir ısıtıcı ceketli şırınga pompasına yerleştirin. P1 transduserinin hazneye giden yolunu kapatın ve şırınga ile atık tüpünü bağlayın. Hava kabarcıklarını gidermek için kanı atık tüpünden 1000 µL/dakika hızla purge edin ve ardından P1'in hazneye giden yolunu açın.Basınç servosu, istenen basıncı korumak için otomatik olarak ayarlanacaktır; kan, dakikada 100 microliters hızında perfüze edilirken dijital kameraya bağlı floresan mikroskop kullanılarak perfüze edilen damarın iki alanı çeşitli zaman noktalarında 15 saniye boyunca kaydedilir. Lökositlerin temsilci görüntüleri burada gösterilmiştir; lökositler 10 saniye boyunca hareketsiz kaldıklarında endotelyuma yapışmış olarak kabul edilirler. Sürekli döngü halindeki video kayıtlarıyla, hücreler alan başına ortalama olarak sayılabilir; hem düşük hem de yüksek basınç bir miktar adezyona neden olacaktır.Daha yüksek intralüminal basınçta lökosit adezyonunda belirgin bir artış gözlenmektedir. Bu durum, 120 mmHg basınçta alan başına daha fazla hücrenin, 80 mmHg'ye kıyasla adhezyon gösterdiği bu grafikte nicel olarak kanıtlanmıştır. Bu prosedürün ardından, adezyon moleküllerinin gen ve protein ekspresyonu gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla PCR ve immünohistokimya gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

imaging-leukocyte-adhesion-to-vascular-endothelium-at-high

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Burada, fare Kapkaççı lökosit homing çalışmada non-invaziv bir iki foton (2P) mikroskopi yaklaşımı açıklar. Biz, bizim doku görüntüleme hazırlık teknik yönlerini tartışmak ve yürütme ve veri toplama için kurulmuş ilk tipik bir deney yoluyla okuyucu yürümek.

Lökosit Homing Göç ve non-invaziv Görüntüleme In vivo</em

Biz aydınlık intravital mikroskopi, in vivo olarak nötrofil kemoatraktan kaynak yanıt nötrofil göçünü sırasında dinamik nötrofil-endotel hücre etkileşimleri ölçmek için bir protokol tanımlamaktadır. Nötrofil intraluminal tarama, fare Cremaster'ın kas dokusu transendoteliyal göç ve kemotaksis zaman lapsed video ImageJ ile fotoğraf ve takip ile görüntülendi.

Takip Nötrofil Lumen Crawling, intravital video Mikroskopi Doku transendoteliyal Göç ve Kemotaksis

Bu video, lökositlerin ve endotel hücreleri gibi hücresel ortakların etkileşimini karakterize etmek için laminer akış tabanlı bir testi göstermektedir. Bu yöntem, sağlam ve birleşik bir vasküler hücre tabakası üzerine perfüze edildiğinde lökositlerin yapışması, adezyonu ve transmigrasyonu hakkında dinamik bilgiler sağlar.

Lökositler ve endotel hücreleri arasındaki etkileşimleri incelemek için laminer akış tabanlı bir test

Karaciğer lökosit işe özgü karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri ile kaplı olan hepatik sinüzoidler özel kanallar içinde gerçekleşir. Fizyolojik kesme stresi koşulları altında, insan karaciğer sinüzoidal endotelyumda lökosit işe faz kontrast mikroskopisi bu işlemi altında yatan moleküler mekanizmaların açıklanması kolaylaştırabilir.

Kayma Stres İnsan Karaciğer Sinüzoidal Endoteline altında Koşullarına Lökositer İşe Alım Eğitim için Bir Akış Adezyon Deneyi

Lökositler paraselüler veya transselüler yolu kullanarak endotel tek tabaka çapraz. Biz endojen junctional dağıtım VE-kaderin ve PECAM-1 lökosit transendotelyal göç sırasında fizyolojik akış altında iki âlemden yolları arasında ayrım için takip basit bir deney geliştirildi.

Nötrofil Hicret altında Fizyolojik Akış sırasında endotel hücre-hücre Eklemlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

Burada, biz araştırmacı bir fare dolaşım sistemine endotel kaynaklı yapışma molekülleri ile kaplanmış bir odayı bağlayarak lökosit işe dinamikleri ex vivo değerlendirmek için izin veren bir protokol mevcut. Göreceli biyolojik şartlar altında lökosit değerlendirme sağlar, bu yöntem önemli avantajlar sunar.

Bir Flow Koşullarında lökosit-endotel Etkileşimleri değerlendirilmesi Ex vivo Autoperfused Microflow Odası Deneyi

Farelerde mezenter damarlarının intravital mikroskopisinin bu basitleştirilmiş uygulaması, lökosit-endotel ve trombosit-lökosit etkileşimlerini gözlemlemek için farklı inflamasyon modellerinde kullanılabilir.

Farelerde mesenteriumda Damarlardaki intravital Mikroskopi Lökosit-endotelyal ve Trombosit-lökosit Etkileşimleri

Bu el yazması transgenik muhabir fare kullanımı ve bağışıklık hücrelerinin aktivasyonu değerlendirmek için kan damarlarının intravital video mikroskobu kullanılarak Anjiyotensin II kaynaklı hipertansiyonda floresan boyalar farklı yönetim yollarını açıklar ve onların yetenek rulo ve endotel için uygun.

Lökosit haddeleme ve yapışma Anjiyotensin II-infüzyon farelerde görselleştirme: teknikleri ve Püf noktalar

Lökosit heyecanla damar hücreleri ve trombositlerin damar duvar yaralanma sonra veya enflamasyon sırasında etkileşim. Burada, lökosit ve hücresel eşleri arasındaki etkileşimler altında yatan moleküler mekanizmaları karakterize etmek için basit bir laminar akış tabanlı tahlil açıklayın.

Lökosit işe kültürlü damar hücreleri ve yapışık trombositler üzerinde araştırmak için Laminar akış tabanlı deneyleri

Adım adım bu iletişim kuralı deneysel kurulum ve inflamatuar hiPSC ECs yanıt-e doğru değerlendirilmesi için veri analizi ve lökosit yapışma fizyolojik akış altında analiz ayrıntılı açıklamasını sağlar.

Mikrosıvısal tahlil endotel hücrelere (hiPSC-ECs) insan indüklenen Pluripotent kök hücre kaynaklı lökosit yapışma değerlendirme için

Bu protokolde, fizyolojik olarak ilgili bir mikrovasküler ortamı yeniden üretebilen ve tüm lökosit adezyon / migrasyon kaskadını yeniden üretebilen bir biyomimetik mikroakışkan testi, inflamatuar hastalıkta lökosit-endotel hücre etkileşimlerini incelemek için kullanılmaktadır.

Enflamasyon Sırasında Lökosit-Endotelyal Hücre Etkileşimini İnceleyen Mikrofizyolojik Bir Sistem

Öğrenin, yüksek basınçlı damarlarda lökosit adezyonunu canlı görüntüleme yöntemini. Fare veya sıçan karotis arterleri kullanılarak inflamasyon ve hipertansiyon mekanizmaları incelenir.

Vasküler Endotel Yüksek Lumen Basıncı Görüntüleme Lökosit Adezyon

Daha fazla video keşfet