Name: Taqman By Çocuk Tabureler gelen Noroviruses tespiti ve Genogrouping Tek aşamalı RT-PCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 16 s
Description: Öğrenin çocuk dışkılarından Norovirus tespiti ve genogrup belirleme için tek aşamalı RT-PCR yöntemini. TaqMan probları kullanan bu maliyet etkin analiz, klinik ve epidemiyolojik çalışmalarda güvenilir tanı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar Kas için bir standart ve kontrol pozitiflerin tür hediye için Hastalık Kontrol ve Önleme Ulusal calicivirus Laboratuvarı Merkezi (CDC) teşekkür ve reaktiflerin sağlanması için Johns Hopkins Halk Sağlığı Okulu Laboratuvarları olacaktır.

1. Tabure Örnekleri <ol><li> Dışkı örnekleri RNA korumak için dondurularak saklanmalıdır. % 10 fekal süspansiyon yapmak için, çözülmüş dışkı örneği yaklaşık 0.1 gr almak ve PBS ile 1 ml'ye tamamlayın. </li><li> Önlemek için 200 ul olarak tablet dondurma ve çözme de ekledi. -70 ° C'de alikots depolamak </li><li> Çözülme ve ekstraksiyon kullanılmadan önce 10 dakika süreyle 4000 g alikotları santrifüjlenir. </li></ol> 2. Guanidin &amp; Silika ile Ekstraksiyon için Silika Parçacıklar hazırlanması <ol><li> RT anda, silikon dioksit, 30 gram askıya alma ve 250 mL dH 2 O ile tamamlayın. </li><li> Sedimantasyon 24 saat sonra emme ile süpernatantı 215 ml kaldırın. 250 mL dH 2 O ekleyin ve sallayarak silis pelet askıya. </li><li> Başka bir 24 saat sonra, emme süpernatan kaldırmak ve pH 2.0 'a silika süspansiyonun pH'ı ayarlamak, hidroklorik asit (HCI) kullanılarak. Cam bot kısım silika süspansiyonSu Isıtıcılar ve otoklav. </li></ol> 3. Guanidin &amp; Silika ile Ekstraksiyon için L6 Tampon Hazırlanması <ol><li> Oda sıcaklığında, 0.1 M Tris hidroklorür, pH 6,4, ve bir 0.2 M EDTA, pH 8.0 11 mL çözelti 50 mL X-100 guadinyum tiyosiyanat, 60 g (GuSCN) ve Triton 1.3 g çözülerek L6 tampon hazırlanır. </li></ol> 4. Guanidin &amp; Silika ile Ekstraksiyon için L2 Tampon Hazırlanması <ol><li> Oda sıcaklığında, 0.1 M Tris hidroklorür, pH 6.4 içinde, 150 mL guadinyum tiyosiyanat ile 180 g (GuSCN) eriterek L2 tampon hazırlanır. </li></ol> 5.. Ekstraksiyon Prosedürü <ol><li> Her iki ekstraksiyon bir Kas pozitif dışkı örneği, pozitif kontrol ve DEPC işlenmiş su olarak, negatif kontrol olarak dahil edilmelidir. </li><li> Bir mikro-santrifüj tüpünde aşağıdaki karışımı; tampon L6, silika parçacıkların 20 uL 1 mL, ve% 10 dışkı ekstre süspansiyonun 200 uL ekleyebilir. Vortex kısa ve 15 mi RT de bırakınn. </li><li> 10 sn için 6000 g'de santrifüje süspansiyonu ve% 70 etanol ile iki yıkama ve aseton ile bir kez ve ardından, iki kez 1 ml tampon L2 ile pelet yıkanır. 5 dakika süreyle 56 bir kuru ısıtma blok ° C pelet kurutun. </li><li> RNase içermeyen dH 2 0 ile 50 uL ilave edilerek silika pelet içinde hidrat RNA. 15 dakika boyunca RNasin 1 uL, 56 azından ters tüpü ve inkübe tarafından karışımı ° C ekleyin. </li><li> , Bir tezgah üstü santrifüj içinde, tam hızda 3 dk için santrifüje ve RNA içeren süpernatan 40 uL toplayabilir. </li><li> Nanodrop 2000 spektrofotometre (Termo bilimsel) kullanarak ayıklanan RNA kantifiye. Daha sonra -70 ° C'de saklayın kullanımı kadar, 6 aya kadar. (Not: bozulmamış toplam RNA korumak için daha iyi bir yolu cDNA dönüştürerek edilir). </li></ol> 6. Ticari RNA QIAamp viral RNA Kiti Kullanarak Alternatif Ekstraksiyon Tam talimatları kitapçık Prov bulunurQIAGEN kiti ile ided. Aşağıdaki gibi kısaca prosedür: <ol><li> Tampon AVL pipetleyin 560 uL 1.5 ml tüp içine taşıyıcı RNA içeren ve% 10 dışkı süspansiyonu 140 uL ekleyin. 15 sn için darbe vorteksleme karıştırın. 10 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> 15 sn için darbe vorteksleme tarafından örnek ve karıştırın etanol 560 L (96-100%) ekleyin, ardından kısa bir süre santrifüj. </li><li> Bir 2 mL toplama tüpü içine yerleştirilmiş bir dönme kolonuna Bu çözeltinin 630 uL geçerlidir. 6,000 gr az 1 dakika santrifüjleyin, sonra temiz bir 2 ml tüp içine spin kolon yerleştirin. </li><li> 1 dakika için 6,000 g Tampon AW1 ve santrifüj 500 uL ile bağlı RNA içeren sütunun yıkayın. Temiz 2 mL toplama tüpü yerleştirin sütun. </li><li> 3 dakika boyunca tam hızda (20.000 g veya 14.000 rpm) 500 Tampon AW2 arasında uL ve santrifüj ile sütun yıkayın. </li><li> Temiz bir 1.5 mL mikro-santrifüj tüpüne koyun spin kolon, 40 uL DEPC-işlenmiş su ekleyin ve tam hızda RNA Zehir. TekrarlayınYıkanan RNA son 80 uL için ce. </li><li> Nanodrop 2000 spektrofotometre (Termo bilimsel) kullanarak ayıklanan RNA kantifiye. Daha sonra -70 ° C'de saklayın kullanımı kadar, 6 aya kadar. (Not: bozulmamış toplam RNA korumak için daha iyi bir yolu cDNA dönüştürerek edilir). </li></ol> 7. Bir adım Real Time Özgül Taqman problar ile RT-PCR ile Çıkarılan RNA Norovirüs tespiti Enstrüman StepOnePlus Real Time PCR Sistemleri (Applied Biosystems). Metodoloji <ol><li> Wipe ve herhangi bir potansiyel RNaz kontaminasyonu gidermek için MESAFEDE RNaz tüm çalışma yüzeyleri, pipetler ve santrifüjler temizleyin. </li><li> Pipetleyin Kas GI ve GII tarama ana Tablo 1'e göre karıştırır. Astarlar ve TaqMan probları Tablo 2'de listelenmiştir. </li><li> Her reaksiyon tüpüne uygun ana karışımı kısım 10 uL. </li><li> Seyreltilmemiş bilinmeyen örneğin 5 uL ekleKarşılık gelen reaksiyon kuyucuklara sırasıyla RNA, DEPC işlenmiş-negatif kontrol olarak su, ya da gastrointestinal GII pozitif kontrol RNA. Tüm örnekleri çoğaltmak çalışması gerekiyor. Sırasıyla 300 mikrogram / uL ve 500 mikrogram / uL konsantrasyonu ile pozitif kontrol ve standartlara Hastalık Kontrol ve Önleme Ulusal calicivirus Laboratuvarı Merkezi (CDC) tarafından sağlandı. </li><li> 10 sn için 6000 g reaksiyon plaka santrifüjleyin. </li><li> Deney özellikleri ekranında; çalıştırmak için deneme türü tanımlamak ve seçin. TaqMan reaktifler reaktifler tipi ve bunun Ön-PCR okuma ve amplifikasyon seçili olarak görüntülenir emin olun. </li><li> Tablo 3'te termal profilini kullanılarak 15 uL reaksiyonları çalıştırın. </li><li> Sonuçları çözümleyin. </li></ol> 8. Konvansiyonel RT-PCR ve Dizileme kullanarak Kas GI ve GII Genotiplendirme (Bir ortak ve yaygın olarak kullanılan yöntem var çünkü bu video belirtilen değil.) Çalgı. Biyosistem StepOne ve Quantitec şablonu ile StepOnePlus Real Time PCR Sistemleri uygulanır. Metodoloji <ol><li> Genotipleme önce, numunelerin genogroup (GI ya GII) RT-PCR ile yukarıda anlatılan tarama ile tespit edilir. GI Kas RNA GII genotipleme ana karışımı ile GI genotipleme master miks ve GII Kas RNA ile amplifiye edilmelidir. </li><li> Pipetleyin Kas GI ve GII genotipleme ana Tablo 4'e göre karıştırır. Astarlar GI SKF / SKR ve G2 SKF / SKR Tablo 5'te listelenmiştir. </li><li> 0.2 ml reaksiyon tüpleri için uygun ana karışımı kısım 45 uL. </li><li> Her bir negatif kontrol tüpüne DEPC işlenmiş su-5 uL, ve ön-elenmiş, Ara (GI ve / veya GII) karşılık gelen reaksiyon tüpüne pozitif RNA'nın 5 uL ekleyin. </li><li> Tablo 6 Isı profili kullanılarak 50 uL reaksiyonları çalıştırın. </li><li> PCR ürünleri contai gönderen az 100 amplifiye kapsid bölgenin uL ng / arınma ve sıralama için Şirket Macrogen için ning. (Sekans başına 9700 Büyük Seneca Hwy. Rockville, MD 20850 ve örnek başına 10 $). </li></ol> 9. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/3232/3232fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 Taqman ishalli çocukların gaita örnekleri çıkarılan RNA tayini için kullanılan One-Step RT-PCR temsili sonuçlarını gösterir. Olumlu bir örnek için eşik (Ct) GII için GI ve Ct 39 daha az veya CT 37 eşit kabul edildi. Pozitif kontrol için Ct-değerleri 27 ve sırasıyla GI ve GII için ORF1-ORF2 bileşkenin 18 daha az bulunmuştur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3232/3232fig1large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img src="/files/ftp_upload/3232/3232fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 <table border="1"><tbody><tr><td> Master Mix </td><td> Final Conc </td><td> Hacim (uL) </td></tr><tr><td> H 2 0 PCR </td><td></td><td> 2.875 </td></tr><tr><td> Quantitect RT-PCR Master Mix </td><td> 1x </td><td> 6.250 </td></tr><tr><td> RT Mix </td><td> 1x </td><td> 0.125 </td></tr><tr><td> 50 uM Cog R astar </td><td> 1 uM </td><td> 0.250 </td></tr><tr><td> 50 uM Cog F astar </td><td> 1uM </td><td> 0.250 </td></tr><tr><td> 10 uM Yüzük prob </td><td> 1 uM </td><td> 0.125/0.250 * </td></tr><tr><td></td><td></td><td> 10.00 </td></tr></tbody></table> Her bir prob 0,125 uL GII testleri için kullanılan süre her bir prob * 0,250 uL, GI test için kullanılmıştır. Tarama GI ve GII için Tablo 1. Qiagen Quantitect master miks (Trujillo ve ark., 2006). 7 <table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Geno grup </td><td> Kullanmak </td><td> Dizisi (5 'den 3') </td></tr><tr><td> Cog 1R </td><td> GI </td><td> Astar boya </td><td> CTT AGA CGC CAT CAT TYA C </td></tr><tr><td> Cog 1F </td><td> GI </td><td> Astar boya </td><td> CGY TGG ATG CGN TTY CAT GA </td></tr><tr><td> Cog 2R </td><td> GII </td><td> Astar boya </td><td> TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA </td></tr><tr><td> Cog 2F </td><td> GII </td><td> Astar boya </td><td> ARAÇ GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG </td></tr><tr><td> Halka 1A </td><td> GI </td><td> Sonda </td><td> FAM-AGA TYG CGA TCY SKK GTC CA-BHQ-1 </td></tr><tr><td> Halka 1B </td><td> GI </td><td> Sonda </td><td> FAM-AGA TCG CGG TCT SKK GTC CA-BHQ-1 </td></tr><tr><td> Ring2-TP </td><td> GII </td><td> Sonda </td><td> FAM-TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT-BHQ-1 </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Primer ve genogroups I, II (Kageyama ve ark. Için gerçek zamanlı kantitatif RT-PCR için kullanılmıştır prob oligonükleotidler,2003). 8 <table border="1"><tbody><tr><td> Adım </td><td> Sıcaklık (° C) </td><td> Süresi (dk) </td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 50 </td><td> 30:00 </td><td> cDNA sentezi </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 95 </td><td> 15:00 </td><td> HotStart Taq polimerazı aktive </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 95 </td><td> 00:15 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 60 </td><td> 01:00 </td><td> 45X döngüleri </td></tr></tbody></table> Tablo3. Için termal profilini Tek aşamalı Taqman Gerçek zamanlı RT-PCR (Trujillo ve ark., 2006). 7 <table border="1"><tbody><tr><td> Master Mix </td><td> Final Conc </td><td> Hacim (uL) </td></tr><tr><td> H 2 0 PCR </td><td></td><td> 29.50 </td></tr><tr><td> 5X Qiagen RT-PCR Tamponu </td><td> 1x </td><td> 10.00 </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP Karışım </td><td> 0.4 mM </td><td> 2.00 </td></tr><tr><td> Enzim Mix </td><td></td><td> 2.00 </td></tr><tr><td> 40 U / uL RNAsin </td><td> 20 U / uL </td><td> 0.50 </td></tr><tr><td> 10 uM SKF </td><td> 0.1 uM </td><td> 0.50 </td></tr><tr><td> 10 uM SKR </td><td> 0.1 uM </td><td> 0.50 </td></tr></tbody><tbody><tr><td></td><td></td><td> 45.00 </td></tr></tbody></table> Tablo 4. Qiagen genotipleme GI ve GII için Tek Adım RT-PCR master miks. <table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Geno grup </td><td> Kullanmak </td><td> Dizisi (5 'den 3') </td></tr><tr><td> G1SKF </td><td> GI </td><td> Astar boya </td><td> 5'-CTG CCC GAA TTY GTA AAT GA - 3 </td></tr><tr><td> G1SKR </td><td> GI </td><td> Astar boya </td><td> 5'-CCA ACC ARAÇ CCA TTR TAC A - '3 </td></tr><tr><td> G2SKF </td><td> GII </td><td> Astar boya </td><td> 5'-CNT GGG AGG KHK ATC DHA A - 3 </td></tr><tr><td> G2SKR</td><td> GII </td><td> Astar boya </td><td> 5'-CCR CCN DHA TRH CCR TTR TA CAT-3 </td></tr></tbody></table> Tablo 5. Primerler kapsid Bölge Bölge C (Kojima ve ark., 2002) ve amplifikasyonu için kullanılır. 5 <table border="1"><tbody><tr><td> Adım </td><td> Sıcaklık (° C) </td><td> Süresi (dk) </td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 60 </td><td> 30:00 </td><td> cDNA sentezi </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 96 </td><td> 15:00 </td><td> HotStart Taq polimerazı aktive </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 94 </td><td> 00:030 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 52 </td><td> 01:00 </td><td> 40X döngüleri </td></tr><tr><td></td><td> 72 </td><td> 00:30 </td><td></td></tr><tr><td> 4 </td><td> 72 </td><td> 10:00 </td><td> Tavlama </td></tr></tbody></table> Tablo 6. Taqman Tek Adım RT-PCR için termal profili.

<ol><li>Medici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+epidemiology+of+Norovirus+infections+in+sporadic+cases+of+viral+gastroenteritis+among+children+in+Northern+Italy%5BTitle%5D)+AND+%22L.+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Molecular epidemiology of Norovirus infections in sporadic cases of viral gastroenteritis among children in Northern Italy.</a> L. Medical Virology. 78, (2006).</li>
<li>Vidal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+recombinant+Norovirus+causing+outbreaks+of+gastroenteritis+in+Santiago%2C+Chile%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clinica+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Novel recombinant Norovirus causing outbreaks of gastroenteritis in Santiago, Chile.</a> J. Clinica Microbiology. 4, (2006).</li>
<li>Xavier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+caliciviruses+associated+with+acute+infantile+gastroenteritis+in+Salvador%2C+an+urban+center+in+Northeast+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Braz.+J.+Med.+Biol.+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of caliciviruses associated with acute infantile gastroenteritis in Salvador, an urban center in Northeast Brazil.</a> Braz. J. Med. Biol. Res. 42, (2009).</li>
<li>Boom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).</li>
<li>Kojima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genogroup-specific+PCR+primers+for+detection+of+Norwalk-like+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Genogroup-specific PCR primers for detection of Norwalk-like viruses.</a> J. Virol. Methods. 100, 107-114 (2002).</li>
<li>Mattison, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicenter+comparison+of+two+norovirus+ORF2-based+genotyping+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multicenter comparison of two norovirus ORF2-based genotyping protocols.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 3927-3932 (2009).</li>
<li>Trujillo, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+TaqMan+real-time+reverse+transcription-PCR+for+rapid+detection%2C+quantification%2C+and+typing+of+norovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of TaqMan real-time reverse transcription-PCR for rapid detection, quantification, and typing of norovirus.</a> J. Clin. Microbiol. 44, 1405-1412 (2006).</li>
<li>Kageyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+broadly+reactive+and+highly+sensitive+assay+for+Norwalk-like+viruses+on+real-time+quantitative+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A broadly reactive and highly sensitive assay for Norwalk-like viruses on real-time quantitative RT-PCR.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 1548-1557 (2003).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Dışkı örneklerinden nükleik asit izolasyonu için yöntem içi ekonomik kullanarak, Qiagen gelen ticari QIAmp viral RNA kiti ile eşit sonuçlar elde ve birlikte TaqMan RT-PCR Laboratuvarımızda geliştirilen ile biz Kas geniş bir algılayabilir GI ve GII genogroup ait genotipler. Bölgenin C protokolünün yeni bir yayın% 78 6 genotipleme oranları bildirdi. Çağdaş Kas suşların çeşitliliğin önceki yıllarda artan bu yana, başarı oranı test edilen numuneler için bölgede C primerlerin uyumsuzluklarını bağlıdır. Böylece zam...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Guanidin izotiyosiyanat </td><td> Sigma-Adrich </td><td> G9277 </td><td></td></tr><tr><td> Tris HCI </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T5941 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> Silis </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5631 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> BDH Kimyasallar </td><td> 14530 </td><td></td></tr><tr><td> Diethylpyrocarbonate </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D-5758 </td><td></td></tr><tr><td> Viral RNA Mini Kit (250) QIAamp </td><td> QIAGEN </td><td> 52906 </td><td></td></tr><tr><td> QuantiTec Probe RT-PCR kiti (200) </td><td> QIAGEN </td><td> 204443 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen Bir Adım RT-PCR kiti (200) </td><td> QIAGEN </td><td> 210212 </td><td></td></tr><tr><td> RNaz İnhibitör 2000 adet </td><td> A.Biosystems </td><td> N808-0119 </td><td> 2000 unids / flakon </td></tr><tr><td> Non-Stick Rnae serbest mikrofuge&#39;de Tüpler </td><td> Ambion </td><td> AM12450 </td><td></td></tr><tr><td> Ultra Saf Agaroz 1000 </td><td> Invitrogen </td><td> 16550-100 </td><td></td></tr></tbody></table>

taqman by Çocuk tabureler gelen noroviruses tespiti ve genogrouping tek aşamalı rt-pcr

Detection and Genogrouping of Noroviruses from Children's Stools By Taqman One-step RT-PCR

Noroviruses (NoVs) her yaştaki insanlarda dünya çapında sporadik akut gastroenterit salgınlarının önde gelen nedenidir. Onlar Rotavirüs benzer bir halk sağlığı etkisi olan çocuklarda hastaneye yatış önemli nedenlerindendir. NoVs büyük genetik çeşitlilik RNA virüsleri vardır ve yeni suşlar sürekli bir görünümü vardır. Beş genogroups tanınır; GI ve GII onların birçok genotip ve insan enfeksiyonu için en önemli olan alt tipleri ile. Bununla birlikte, bu iki genotiplerinin tan teşhis ve tedavi geciktirilmesi, bir problem teşkil etmektedir. 1, 2, 3 Dışkı örneklerinden RNA ekstraksiyonu için en sık kullanılan yöntem Qiagen gelen QIAmp viral RNA ticari kiti. Bu yöntem, tamponlar, bir silika jel membran bağlanma özelliklerini birleştiren bir kontrol RNases ve microspin hızı ile birlikte kolonuna RNA bağlama optimum sağlar. Bu yöntem basit, hızlı ve güvenilir ve Carr iseüretici tarafından sağlanan açıklama ayrıntılı olarak bir kaç adımda ied. Norovirüs ishalin en sık nedeni olarak rotavirüs sadece ikinci. Norovirüs tanı ishal patogenezinde tüm çalışmaların yanı sıra salgınlar ya da bireysel ishal vakası mevcut olmalıdır. Şu anda ancak norovirüs tanı tanı basit bir yöntem olmaması nedeniyle sadece birkaç merkezde sınırlıdır. Bu gecikme teşhis ve tedavi 1, 2, 3. Buna ek olarak, ülke içinde ve arasındaki maliyet ve korozif tamponların düzenlenmiş ulaşım nedeniyle lojistik problemler ortaya çıkarır, bu mamul kitleri kullanın. Sonuç olarak, bu protokolde, orijinal Bom dayalı bir alternatif, ekonomik, in-house yöntemi tarif ark guadinyum tiyosiyanat ile anti-nükleaz özellikleri ile birlikte silika partiküllerinin nükleik asit bağlama özellikleri kullanır. Yöntemi 4 . <p class=Dışkı örnekleri, farklı hedefler kullanıldığı birkaç RT-PCR protokollerden NoVs izolatlarının tespiti ve genogrouping (GI ve GII) için &quot;jove_content&quot;&gt; geliştirilmiştir. Uzlaşma yüksek duyarlılık, özgüllük ve yüksek verimlilik ve kullanım kolaylığı ile tekrarlanabilirliği birleştirir çünkü TaqMan kimya kullanarak bir RT-PCR, tanı için en iyi moleküler teknik olacağını olmasıdır. Burada, açık okuma çerçevesinin 1 (ORF1)-ORF2 bileşke bölgeye yönelik bir deneyde tarif; teşhisi için böylece en korunmuş Ara genomunun bölgesi ve en çok uygundur. Daha da gen analizinde kapsid (Bölge C) aslen Kojima ve arkadaşları tarafından tarif primerler kullanılarak. 5 büyük protein son derece değişken N-terminal-kabuk hedef geleneksel bir RT-PCR için ayrıntılı olarak verilmiştir. Konvansiyonel PCR ile PCR ürün Sekanslayan GI ve GII genogroups ait genotiplerinin farklılaşma sağlar.

Astar ve açık okuma çerçevesi 1 (ORF1)-ORF2 kavşak bölgesidir Norovirüs genomunun en korunmuş bölgeye özgü TaqMan probları kullanan çocuk tabureleri, gelen algılama ve Norovirüs izolatların genogroup belirlenmesi için Tek Adım RT-PCR nitelendirdi. Bir ticari olmayan, maliyet-etkin RNA ekstraksiyon yöntemi ayrıntılı olarak verilmiştir.

Taqman By Çocuk Tabureler gelen Noroviruses tespiti ve Genogrouping Tek aşamalı RT-PCR

Norovirüsler (NoV'ler), dünya genelinde her yaştan insanda meydana gelen sporadik akut gastroenterit salgınlarının önde gelen nedenidir. Bunlar, ...'nın önemli bir nedenidir.

Spesifik TECHMAN probları kullanılarak tek basamaklı gerçek zamanlı R-T-P-C-R ile ekstrakte edilmiş RNA'da nörovirüs saptama. Ancak bugün nörovirüs hakkında konuşacağız. Burası Lima, Peru'da bulunan bir üniversite grubu ve ayrıca Johns Hopkins Üniversitesi'dir.Norovirüsün, muhtemelen ishalin en çok ihmal edilen nedenlerinden biri olduğu ortaya çıkmıştır. Grubumuz, çocukların ishal nedeniyle hastaneye yatışları ve popülasyon tabanlı ishal insidans sayıları açısından norovirüsün koronavirüsten sonra ikinci sırada yer aldığını saptamıştır. Öyleyse NOROVİRÜS neden daha önce teşhis edilmedi?Bunun nedeni, söz konusu virüsün bir RNA virüsü olması ve kültürlenememesi nedeniyle tanı koymak için özel moleküler biyolojik yöntemlerin gerekmesidir. Kullandığımız bu yöntemler RT-PCR'dır ve bu çalışma, norovirüs tanısı koymak için RT-PCR'ın nasıl kullanılacağını gösterecektir. Kurum içi Ciag GUINE yöntemi (boom et al. 1989); dışkı örneklerinden viral RNA ekstraksiyonu için kurum içi G guine ATE yöntemini kullandık.Bu yöntem, ticari ca amp viral RNA kitine alternatif bir yöntemdir. Her iki yöntem de silika partiküllerinin nükleik asit bağlama özelliklerine dayanmaktadır. G Guad Dium Bio NA'nın ant

detection-genogrouping-noroviruses-from-children-s-stools-taqman-one

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

EPA Metod 1615, çevre ve içme sularındaki enterovirüsleri ve norovirüsleri konsantre etmek için elektropozitif bir filtre kullanır. Bu el yazması, Yöntem 1615 analizleri için numune toplama prosedürünü açıklamaktadır.

Enterovirus Kültür ve RT-qPCR Su Norovirüs Oluşum EPA Metot 1615 Ölçüm. Virüs Örneklerinin I. Koleksiyonu

Burada, Buffalo Green Monkey böbrek hücresi hattını kullanarak toplam kültürlenebilir virüsleri ölçmek için bir prosedür sunuyoruz. Prosedür, çevresel ve içme sularında bulaşıcı virüslerin oluşumunu ölçmek için standartlaştırılmış bir araç sağlar.

Enterovirus Kültür ve RT-qPCR Su Norovirus Oluşum EPA Metot 1615 ölçülmesi. II. Toplam kültürlenebilir virüs Deneyi

Burada, ters transkripsiyon-kantitatif PCR kullanarak çevresel ve içme sularında enterovirüs ve norovirüsü ölçmek için bir prosedür sunuyoruz. EPA Metodu 1615'ten alınan bu standardize prosedürle yeraltı sularından ortalama virüs geri kazanımı, poliovirüs için %20 ve murin norovirüsü için %30 idi.

Enterovirüs Kültür ve RT-qPCR Su Norovirus Oluşum EPA Method 1615 Ölçümü. Bölüm III. RT-qPCR Virüs Algılama

Çevresel sert yüzeylerde norovirüsün tespiti ve miktarının belirlenmesi için makro köpük tabanlı bir örnekleme metodolojisi geliştirilmiş ve değerlendirilmiştir.

Yüzeyler İnsan Norovirus Tespiti sürüntü Örnekleme Yöntemi

Viral genom amplifikasyon kullanan rutin algılama yöntemleri bulaşıcı olmayan parçacıklar bulaşıcı ayırımcılık için kendi yetersizlik tarafından sınırlıdır. Bu makalenin amacı, aptamer bağlama, dinamik ışık saçılma ve transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak bulaşıcı norovirus parçacıkların ayrımcılık yardım etmek alternatif yöntemler detaylı protokollerde sağlamaktır.

Viral kapsid yapısal bütünlük belirlenmesi için alternatif Vitro yöntemleri

Ters transkripsiyon (RT-qPCR) ile birlikte gerçek zamanlı nicel polimeraz zincir reaksiyonu analiz RNA virüs enfeksiyonları düzeyini ölçmek için yaygın olarak kullanılmış. Burada dang virüs dahil olmak üzere birkaç RNA virüsleri miktar için geliştirilen bir RNA arıtma adım gerekli değildir doğrudan bir RT-qPCR tahlil mevcut.

Dang virüs RNA kültür süpernatant gerçek zamanlı nicel polimeraz zincir reaksiyonu tarafından enfekte hücre içinde ölçme

Bu iletişim kuralı Tilapia Gölü virüs (TiLV) RT-PCR yöntemlerini kullanarak tilapia dokularda tanılar. Tüm yöntemi doku diseksiyon toplam RNA emme, ardından cDNA sentezi ve TiLV geleneksel PCR veya kantitatif PCR dsDNA bir floresan bağlama boya bağlama kullanarak tarafından algılanması için tanımlanır.

Tilapia Gölü virüs kullanarak geleneksel RT-PCR ve SYBR yeşil RT-qPCR

Burada belirli büyüme oranı ve diğer Rotavirüs plak tahlil ve RT-qPCR kullanarak hücre bağlama yeteneği ölçmek için iki protokol mevcut. Bu protokoller fenotipleri farklılıkları Rotavirüs suşları arasında teyit için kullanılabilir.

Belirli büyüme oranı ve hücre-bağlama yeteneği Rotavirüs deneyleri

Kantitatif Real Time PCR (qPCR) tümör örneklerinde çeşitli mikroRNA ifade seviyeleri (miRNA) molekülleri araştırmak için hızlı ve duyarlı bir yöntemdir. Farklı miRNA moleküller yüzlerce bu yöntem ifadesi kullanılarak, amplifiye miktarı, ve aynı cDNA şablon ile analiz edilebilir.

Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR (qPCR) tarafından Prostat tümörlerinde mikroRNA Algılama

Preklinik kanser tedavisi izlenmesi için Cerenkov Lüminesans Görüntüleme (CLI) kullanımı burada açıklanmıştır. Bu yöntem Cerenkov Radyasyon (CR) ve radyoaktif probları görselleştirmek için optik görüntüleme (OI) yararlanır ve böylece preklinik terapötik izleme ve ilaç tarama PET için bir alternatif sunuyor.

Kanser Tedavisi İzleme Cerenkov Lüminesans Görüntüleme (CLI)

Öğrenin çocuk dışkılarından Norovirus tespiti ve genogrup belirleme için tek aşamalı RT-PCR yöntemini. TaqMan probları kullanan bu maliyet etkin analiz, klinik ve epidemiyolojik çalışmalarda güvenilir tanı sağlar.

Taqman By Çocuk Tabureler gelen Noroviruses tespiti ve Genogrouping Tek aşamalı RT-PCR

Daha fazla video keşfet