Name: Taqman By Çocuk Tabureler gelen Noroviruses tespiti ve Genogrouping Tek aşamalı RT-PCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 16 s
Description: Öğrenin çocuk dışkılarından Norovirus tespiti ve genogrup belirleme için tek aşamalı RT-PCR yöntemini. TaqMan probları kullanan bu maliyet etkin analiz, klinik ve epidemiyolojik çalışmalarda güvenilir tanı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Kas için bir standart ve kontrol pozitiflerin tür hediye için Hastalık Kontrol ve Önleme Ulusal calicivirus Laboratuvarı Merkezi (CDC) teşekkür ve reaktiflerin sağlanması için Johns Hopkins Halk Sağlığı Okulu Laboratuvarları olacaktır.

1. Tabure Örnekleri <ol><li> Dışkı örnekleri RNA korumak için dondurularak saklanmalıdır. % 10 fekal süspansiyon yapmak için, çözülmüş dışkı örneği yaklaşık 0.1 gr almak ve PBS ile 1 ml'ye tamamlayın. </li><li> Önlemek için 200 ul olarak tablet dondurma ve çözme de ekledi. -70 ° C'de alikots depolamak </li><li> Çözülme ve ekstraksiyon kullanılmadan önce 10 dakika süreyle 4000 g alikotları santrifüjlenir. </li></ol> 2. Guanidin &amp; Silika ile Ekstraksiyon için Silika Parçacıklar hazırlanması <ol><li> RT anda, silikon dioksit, 30 gram askıya alma ve 250 mL dH 2 O ile tamamlayın. </li><li> Sedimantasyon 24 saat sonra emme ile süpernatantı 215 ml kaldırın. 250 mL dH 2 O ekleyin ve sallayarak silis pelet askıya. </li><li> Başka bir 24 saat sonra, emme süpernatan kaldırmak ve pH 2.0 'a silika süspansiyonun pH'ı ayarlamak, hidroklorik asit (HCI) kullanılarak. Cam bot kısım silika süspansiyonSu Isıtıcılar ve otoklav. </li></ol> 3. Guanidin &amp; Silika ile Ekstraksiyon için L6 Tampon Hazırlanması <ol><li> Oda sıcaklığında, 0.1 M Tris hidroklorür, pH 6,4, ve bir 0.2 M EDTA, pH 8.0 11 mL çözelti 50 mL X-100 guadinyum tiyosiyanat, 60 g (GuSCN) ve Triton 1.3 g çözülerek L6 tampon hazırlanır. </li></ol> 4. Guanidin &amp; Silika ile Ekstraksiyon için L2 Tampon Hazırlanması <ol><li> Oda sıcaklığında, 0.1 M Tris hidroklorür, pH 6.4 içinde, 150 mL guadinyum tiyosiyanat ile 180 g (GuSCN) eriterek L2 tampon hazırlanır. </li></ol> 5.. Ekstraksiyon Prosedürü <ol><li> Her iki ekstraksiyon bir Kas pozitif dışkı örneği, pozitif kontrol ve DEPC işlenmiş su olarak, negatif kontrol olarak dahil edilmelidir. </li><li> Bir mikro-santrifüj tüpünde aşağıdaki karışımı; tampon L6, silika parçacıkların 20 uL 1 mL, ve% 10 dışkı ekstre süspansiyonun 200 uL ekleyebilir. Vortex kısa ve 15 mi RT de bırakınn. </li><li> 10 sn için 6000 g'de santrifüje süspansiyonu ve% 70 etanol ile iki yıkama ve aseton ile bir kez ve ardından, iki kez 1 ml tampon L2 ile pelet yıkanır. 5 dakika süreyle 56 bir kuru ısıtma blok ° C pelet kurutun. </li><li> RNase içermeyen dH 2 0 ile 50 uL ilave edilerek silika pelet içinde hidrat RNA. 15 dakika boyunca RNasin 1 uL, 56 azından ters tüpü ve inkübe tarafından karışımı ° C ekleyin. </li><li> , Bir tezgah üstü santrifüj içinde, tam hızda 3 dk için santrifüje ve RNA içeren süpernatan 40 uL toplayabilir. </li><li> Nanodrop 2000 spektrofotometre (Termo bilimsel) kullanarak ayıklanan RNA kantifiye. Daha sonra -70 ° C'de saklayın kullanımı kadar, 6 aya kadar. (Not: bozulmamış toplam RNA korumak için daha iyi bir yolu cDNA dönüştürerek edilir). </li></ol> 6. Ticari RNA QIAamp viral RNA Kiti Kullanarak Alternatif Ekstraksiyon Tam talimatları kitapçık Prov bulunurQIAGEN kiti ile ided. Aşağıdaki gibi kısaca prosedür: <ol><li> Tampon AVL pipetleyin 560 uL 1.5 ml tüp içine taşıyıcı RNA içeren ve% 10 dışkı süspansiyonu 140 uL ekleyin. 15 sn için darbe vorteksleme karıştırın. 10 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> 15 sn için darbe vorteksleme tarafından örnek ve karıştırın etanol 560 L (96-100%) ekleyin, ardından kısa bir süre santrifüj. </li><li> Bir 2 mL toplama tüpü içine yerleştirilmiş bir dönme kolonuna Bu çözeltinin 630 uL geçerlidir. 6,000 gr az 1 dakika santrifüjleyin, sonra temiz bir 2 ml tüp içine spin kolon yerleştirin. </li><li> 1 dakika için 6,000 g Tampon AW1 ve santrifüj 500 uL ile bağlı RNA içeren sütunun yıkayın. Temiz 2 mL toplama tüpü yerleştirin sütun. </li><li> 3 dakika boyunca tam hızda (20.000 g veya 14.000 rpm) 500 Tampon AW2 arasında uL ve santrifüj ile sütun yıkayın. </li><li> Temiz bir 1.5 mL mikro-santrifüj tüpüne koyun spin kolon, 40 uL DEPC-işlenmiş su ekleyin ve tam hızda RNA Zehir. TekrarlayınYıkanan RNA son 80 uL için ce. </li><li> Nanodrop 2000 spektrofotometre (Termo bilimsel) kullanarak ayıklanan RNA kantifiye. Daha sonra -70 ° C'de saklayın kullanımı kadar, 6 aya kadar. (Not: bozulmamış toplam RNA korumak için daha iyi bir yolu cDNA dönüştürerek edilir). </li></ol> 7. Bir adım Real Time Özgül Taqman problar ile RT-PCR ile Çıkarılan RNA Norovirüs tespiti Enstrüman StepOnePlus Real Time PCR Sistemleri (Applied Biosystems). Metodoloji <ol><li> Wipe ve herhangi bir potansiyel RNaz kontaminasyonu gidermek için MESAFEDE RNaz tüm çalışma yüzeyleri, pipetler ve santrifüjler temizleyin. </li><li> Pipetleyin Kas GI ve GII tarama ana Tablo 1'e göre karıştırır. Astarlar ve TaqMan probları Tablo 2'de listelenmiştir. </li><li> Her reaksiyon tüpüne uygun ana karışımı kısım 10 uL. </li><li> Seyreltilmemiş bilinmeyen örneğin 5 uL ekleKarşılık gelen reaksiyon kuyucuklara sırasıyla RNA, DEPC işlenmiş-negatif kontrol olarak su, ya da gastrointestinal GII pozitif kontrol RNA. Tüm örnekleri çoğaltmak çalışması gerekiyor. Sırasıyla 300 mikrogram / uL ve 500 mikrogram / uL konsantrasyonu ile pozitif kontrol ve standartlara Hastalık Kontrol ve Önleme Ulusal calicivirus Laboratuvarı Merkezi (CDC) tarafından sağlandı. </li><li> 10 sn için 6000 g reaksiyon plaka santrifüjleyin. </li><li> Deney özellikleri ekranında; çalıştırmak için deneme türü tanımlamak ve seçin. TaqMan reaktifler reaktifler tipi ve bunun Ön-PCR okuma ve amplifikasyon seçili olarak görüntülenir emin olun. </li><li> Tablo 3'te termal profilini kullanılarak 15 uL reaksiyonları çalıştırın. </li><li> Sonuçları çözümleyin. </li></ol> 8. Konvansiyonel RT-PCR ve Dizileme kullanarak Kas GI ve GII Genotiplendirme (Bir ortak ve yaygın olarak kullanılan yöntem var çünkü bu video belirtilen değil.) Çalgı. Biyosistem StepOne ve Quantitec şablonu ile StepOnePlus Real Time PCR Sistemleri uygulanır. Metodoloji <ol><li> Genotipleme önce, numunelerin genogroup (GI ya GII) RT-PCR ile yukarıda anlatılan tarama ile tespit edilir. GI Kas RNA GII genotipleme ana karışımı ile GI genotipleme master miks ve GII Kas RNA ile amplifiye edilmelidir. </li><li> Pipetleyin Kas GI ve GII genotipleme ana Tablo 4'e göre karıştırır. Astarlar GI SKF / SKR ve G2 SKF / SKR Tablo 5'te listelenmiştir. </li><li> 0.2 ml reaksiyon tüpleri için uygun ana karışımı kısım 45 uL. </li><li> Her bir negatif kontrol tüpüne DEPC işlenmiş su-5 uL, ve ön-elenmiş, Ara (GI ve / veya GII) karşılık gelen reaksiyon tüpüne pozitif RNA'nın 5 uL ekleyin. </li><li> Tablo 6 Isı profili kullanılarak 50 uL reaksiyonları çalıştırın. </li><li> PCR ürünleri contai gönderen az 100 amplifiye kapsid bölgenin uL ng / arınma ve sıralama için Şirket Macrogen için ning. (Sekans başına 9700 Büyük Seneca Hwy. Rockville, MD 20850 ve örnek başına 10 $). </li></ol> 9. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/3232/3232fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 Taqman ishalli çocukların gaita örnekleri çıkarılan RNA tayini için kullanılan One-Step RT-PCR temsili sonuçlarını gösterir. Olumlu bir örnek için eşik (Ct) GII için GI ve Ct 39 daha az veya CT 37 eşit kabul edildi. Pozitif kontrol için Ct-değerleri 27 ve sırasıyla GI ve GII için ORF1-ORF2 bileşkenin 18 daha az bulunmuştur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3232/3232fig1large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img src="/files/ftp_upload/3232/3232fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 <table border="1"><tbody><tr><td> Master Mix </td><td> Final Conc </td><td> Hacim (uL) </td></tr><tr><td> H 2 0 PCR </td><td></td><td> 2.875 </td></tr><tr><td> Quantitect RT-PCR Master Mix </td><td> 1x </td><td> 6.250 </td></tr><tr><td> RT Mix </td><td> 1x </td><td> 0.125 </td></tr><tr><td> 50 uM Cog R astar </td><td> 1 uM </td><td> 0.250 </td></tr><tr><td> 50 uM Cog F astar </td><td> 1uM </td><td> 0.250 </td></tr><tr><td> 10 uM Yüzük prob </td><td> 1 uM </td><td> 0.125/0.250 * </td></tr><tr><td></td><td></td><td> 10.00 </td></tr></tbody></table> Her bir prob 0,125 uL GII testleri için kullanılan süre her bir prob * 0,250 uL, GI test için kullanılmıştır. Tarama GI ve GII için Tablo 1. Qiagen Quantitect master miks (Trujillo ve ark., 2006). 7 <table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Geno grup </td><td> Kullanmak </td><td> Dizisi (5 'den 3') </td></tr><tr><td> Cog 1R </td><td> GI </td><td> Astar boya </td><td> CTT AGA CGC CAT CAT TYA C </td></tr><tr><td> Cog 1F </td><td> GI </td><td> Astar boya </td><td> CGY TGG ATG CGN TTY CAT GA </td></tr><tr><td> Cog 2R </td><td> GII </td><td> Astar boya </td><td> TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA </td></tr><tr><td> Cog 2F </td><td> GII </td><td> Astar boya </td><td> ARAÇ GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG </td></tr><tr><td> Halka 1A </td><td> GI </td><td> Sonda </td><td> FAM-AGA TYG CGA TCY SKK GTC CA-BHQ-1 </td></tr><tr><td> Halka 1B </td><td> GI </td><td> Sonda </td><td> FAM-AGA TCG CGG TCT SKK GTC CA-BHQ-1 </td></tr><tr><td> Ring2-TP </td><td> GII </td><td> Sonda </td><td> FAM-TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT-BHQ-1 </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Primer ve genogroups I, II (Kageyama ve ark. Için gerçek zamanlı kantitatif RT-PCR için kullanılmıştır prob oligonükleotidler,2003). 8 <table border="1"><tbody><tr><td> Adım </td><td> Sıcaklık (° C) </td><td> Süresi (dk) </td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 50 </td><td> 30:00 </td><td> cDNA sentezi </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 95 </td><td> 15:00 </td><td> HotStart Taq polimerazı aktive </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 95 </td><td> 00:15 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 60 </td><td> 01:00 </td><td> 45X döngüleri </td></tr></tbody></table> Tablo3. Için termal profilini Tek aşamalı Taqman Gerçek zamanlı RT-PCR (Trujillo ve ark., 2006). 7 <table border="1"><tbody><tr><td> Master Mix </td><td> Final Conc </td><td> Hacim (uL) </td></tr><tr><td> H 2 0 PCR </td><td></td><td> 29.50 </td></tr><tr><td> 5X Qiagen RT-PCR Tamponu </td><td> 1x </td><td> 10.00 </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP Karışım </td><td> 0.4 mM </td><td> 2.00 </td></tr><tr><td> Enzim Mix </td><td></td><td> 2.00 </td></tr><tr><td> 40 U / uL RNAsin </td><td> 20 U / uL </td><td> 0.50 </td></tr><tr><td> 10 uM SKF </td><td> 0.1 uM </td><td> 0.50 </td></tr><tr><td> 10 uM SKR </td><td> 0.1 uM </td><td> 0.50 </td></tr></tbody><tbody><tr><td></td><td></td><td> 45.00 </td></tr></tbody></table> Tablo 4. Qiagen genotipleme GI ve GII için Tek Adım RT-PCR master miks. <table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Geno grup </td><td> Kullanmak </td><td> Dizisi (5 'den 3') </td></tr><tr><td> G1SKF </td><td> GI </td><td> Astar boya </td><td> 5'-CTG CCC GAA TTY GTA AAT GA - 3 </td></tr><tr><td> G1SKR </td><td> GI </td><td> Astar boya </td><td> 5'-CCA ACC ARAÇ CCA TTR TAC A - '3 </td></tr><tr><td> G2SKF </td><td> GII </td><td> Astar boya </td><td> 5'-CNT GGG AGG KHK ATC DHA A - 3 </td></tr><tr><td> G2SKR</td><td> GII </td><td> Astar boya </td><td> 5'-CCR CCN DHA TRH CCR TTR TA CAT-3 </td></tr></tbody></table> Tablo 5. Primerler kapsid Bölge Bölge C (Kojima ve ark., 2002) ve amplifikasyonu için kullanılır. 5 <table border="1"><tbody><tr><td> Adım </td><td> Sıcaklık (° C) </td><td> Süresi (dk) </td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 60 </td><td> 30:00 </td><td> cDNA sentezi </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 96 </td><td> 15:00 </td><td> HotStart Taq polimerazı aktive </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 94 </td><td> 00:030 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 52 </td><td> 01:00 </td><td> 40X döngüleri </td></tr><tr><td></td><td> 72 </td><td> 00:30 </td><td></td></tr><tr><td> 4 </td><td> 72 </td><td> 10:00 </td><td> Tavlama </td></tr></tbody></table> Tablo 6. Taqman Tek Adım RT-PCR için termal profili.

<ol><li>Medici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+epidemiology+of+Norovirus+infections+in+sporadic+cases+of+viral+gastroenteritis+among+children+in+Northern+Italy%5BTitle%5D)+AND+%22L.+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Molecular epidemiology of Norovirus infections in sporadic cases of viral gastroenteritis among children in Northern Italy.</a> L. Medical Virology. 78, (2006).</li>
<li>Vidal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+recombinant+Norovirus+causing+outbreaks+of+gastroenteritis+in+Santiago%2C+Chile%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clinica+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Novel recombinant Norovirus causing outbreaks of gastroenteritis in Santiago, Chile.</a> J. Clinica Microbiology. 4, (2006).</li>
<li>Xavier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+caliciviruses+associated+with+acute+infantile+gastroenteritis+in+Salvador%2C+an+urban+center+in+Northeast+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Braz.+J.+Med.+Biol.+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of caliciviruses associated with acute infantile gastroenteritis in Salvador, an urban center in Northeast Brazil.</a> Braz. J. Med. Biol. Res. 42, (2009).</li>
<li>Boom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).</li>
<li>Kojima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genogroup-specific+PCR+primers+for+detection+of+Norwalk-like+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Genogroup-specific PCR primers for detection of Norwalk-like viruses.</a> J. Virol. Methods. 100, 107-114 (2002).</li>
<li>Mattison, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicenter+comparison+of+two+norovirus+ORF2-based+genotyping+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multicenter comparison of two norovirus ORF2-based genotyping protocols.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 3927-3932 (2009).</li>
<li>Trujillo, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+TaqMan+real-time+reverse+transcription-PCR+for+rapid+detection%2C+quantification%2C+and+typing+of+norovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of TaqMan real-time reverse transcription-PCR for rapid detection, quantification, and typing of norovirus.</a> J. Clin. Microbiol. 44, 1405-1412 (2006).</li>
<li>Kageyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+broadly+reactive+and+highly+sensitive+assay+for+Norwalk-like+viruses+on+real-time+quantitative+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A broadly reactive and highly sensitive assay for Norwalk-like viruses on real-time quantitative RT-PCR.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 1548-1557 (2003).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Dışkı örneklerinden nükleik asit izolasyonu için yöntem içi ekonomik kullanarak, Qiagen gelen ticari QIAmp viral RNA kiti ile eşit sonuçlar elde ve birlikte TaqMan RT-PCR Laboratuvarımızda geliştirilen ile biz Kas geniş bir algılayabilir GI ve GII genogroup ait genotipler. Bölgenin C protokolünün yeni bir yayın% 78 6 genotipleme oranları bildirdi. Çağdaş Kas suşların çeşitliliğin önceki yıllarda artan bu yana, başarı oranı test edilen numuneler için bölgede C primerlerin uyumsuzluklarını bağlıdır. Böylece zam...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Guanidin izotiyosiyanat </td><td> Sigma-Adrich </td><td> G9277 </td><td></td></tr><tr><td> Tris HCI </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T5941 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> Silis </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5631 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> BDH Kimyasallar </td><td> 14530 </td><td></td></tr><tr><td> Diethylpyrocarbonate </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D-5758 </td><td></td></tr><tr><td> Viral RNA Mini Kit (250) QIAamp </td><td> QIAGEN </td><td> 52906 </td><td></td></tr><tr><td> QuantiTec Probe RT-PCR kiti (200) </td><td> QIAGEN </td><td> 204443 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen Bir Adım RT-PCR kiti (200) </td><td> QIAGEN </td><td> 210212 </td><td></td></tr><tr><td> RNaz İnhibitör 2000 adet </td><td> A.Biosystems </td><td> N808-0119 </td><td> 2000 unids / flakon </td></tr><tr><td> Non-Stick Rnae serbest mikrofuge&#39;de Tüpler </td><td> Ambion </td><td> AM12450 </td><td></td></tr><tr><td> Ultra Saf Agaroz 1000 </td><td> Invitrogen </td><td> 16550-100 </td><td></td></tr></tbody></table>

taqman by Çocuk tabureler gelen noroviruses tespiti ve genogrouping tek aşamalı rt-pcr

Detection and Genogrouping of Noroviruses from Children's Stools By Taqman One-step RT-PCR

Noroviruses (NoVs) her yaştaki insanlarda dünya çapında sporadik akut gastroenterit salgınlarının önde gelen nedenidir. Onlar Rotavirüs benzer bir halk sağlığı etkisi olan çocuklarda hastaneye yatış önemli nedenlerindendir. NoVs büyük genetik çeşitlilik RNA virüsleri vardır ve yeni suşlar sürekli bir görünümü vardır. Beş genogroups tanınır; GI ve GII onların birçok genotip ve insan enfeksiyonu için en önemli olan alt tipleri ile. Bununla birlikte, bu iki genotiplerinin tan teşhis ve tedavi geciktirilmesi, bir problem teşkil etmektedir. 1, 2, 3 Dışkı örneklerinden RNA ekstraksiyonu için en sık kullanılan yöntem Qiagen gelen QIAmp viral RNA ticari kiti. Bu yöntem, tamponlar, bir silika jel membran bağlanma özelliklerini birleştiren bir kontrol RNases ve microspin hızı ile birlikte kolonuna RNA bağlama optimum sağlar. Bu yöntem basit, hızlı ve güvenilir ve Carr iseüretici tarafından sağlanan açıklama ayrıntılı olarak bir kaç adımda ied. Norovirüs ishalin en sık nedeni olarak rotavirüs sadece ikinci. Norovirüs tanı ishal patogenezinde tüm çalışmaların yanı sıra salgınlar ya da bireysel ishal vakası mevcut olmalıdır. Şu anda ancak norovirüs tanı tanı basit bir yöntem olmaması nedeniyle sadece birkaç merkezde sınırlıdır. Bu gecikme teşhis ve tedavi 1, 2, 3. Buna ek olarak, ülke içinde ve arasındaki maliyet ve korozif tamponların düzenlenmiş ulaşım nedeniyle lojistik problemler ortaya çıkarır, bu mamul kitleri kullanın. Sonuç olarak, bu protokolde, orijinal Bom dayalı bir alternatif, ekonomik, in-house yöntemi tarif ark guadinyum tiyosiyanat ile anti-nükleaz özellikleri ile birlikte silika partiküllerinin nükleik asit bağlama özellikleri kullanır. Yöntemi 4 . <p class=Dışkı örnekleri, farklı hedefler kullanıldığı birkaç RT-PCR protokollerden NoVs izolatlarının tespiti ve genogrouping (GI ve GII) için &quot;jove_content&quot;&gt; geliştirilmiştir. Uzlaşma yüksek duyarlılık, özgüllük ve yüksek verimlilik ve kullanım kolaylığı ile tekrarlanabilirliği birleştirir çünkü TaqMan kimya kullanarak bir RT-PCR, tanı için en iyi moleküler teknik olacağını olmasıdır. Burada, açık okuma çerçevesinin 1 (ORF1)-ORF2 bileşke bölgeye yönelik bir deneyde tarif; teşhisi için böylece en korunmuş Ara genomunun bölgesi ve en çok uygundur. Daha da gen analizinde kapsid (Bölge C) aslen Kojima ve arkadaşları tarafından tarif primerler kullanılarak. 5 büyük protein son derece değişken N-terminal-kabuk hedef geleneksel bir RT-PCR için ayrıntılı olarak verilmiştir. Konvansiyonel PCR ile PCR ürün Sekanslayan GI ve GII genogroups ait genotiplerinin farklılaşma sağlar.

Astar ve açık okuma çerçevesi 1 (ORF1)-ORF2 kavşak bölgesidir Norovirüs genomunun en korunmuş bölgeye özgü TaqMan probları kullanan çocuk tabureleri, gelen algılama ve Norovirüs izolatların genogroup belirlenmesi için Tek Adım RT-PCR nitelendirdi. Bir ticari olmayan, maliyet-etkin RNA ekstraksiyon yöntemi ayrıntılı olarak verilmiştir.

Taqman By Çocuk Tabureler gelen Noroviruses tespiti ve Genogrouping Tek aşamalı RT-PCR

Norovirüsler (NoV'ler), dünya genelinde her yaştan insanda meydana gelen sporadik akut gastroenterit salgınlarının önde gelen nedenidir. Bunlar, ...'nın önemli bir nedenidir.

Spesifik TECHMAN probları kullanılarak tek basamaklı gerçek zamanlı R-T-P-C-R ile ekstrakte edilmiş RNA'da nörovirüs saptama. Ancak bugün nörovirüs hakkında konuşacağız. Burası Lima, Peru'da bulunan bir üniversite grubu ve ayrıca Johns Hopkins Üniversitesi'dir.Norovirüsün, muhtemelen ishalin en çok ihmal edilen nedenlerinden biri olduğu ortaya çıkmıştır. Grubumuz, çocukların ishal nedeniyle hastaneye yatışları ve popülasyon tabanlı ishal insidans sayıları açısından norovirüsün koronavirüsten sonra ikinci sırada yer aldığını saptamıştır. Öyleyse NOROVİRÜS neden daha önce teşhis edilmedi?Bunun nedeni, söz konusu virüsün bir RNA virüsü olması ve kültürlenememesi nedeniyle tanı koymak için özel moleküler biyolojik yöntemlerin gerekmesidir. Kullandığımız bu yöntemler RT-PCR'dır ve bu çalışma, norovirüs tanısı koymak için RT-PCR'ın nasıl kullanılacağını gösterecektir. Kurum içi Ciag GUINE yöntemi (boom et al. 1989); dışkı örneklerinden viral RNA ekstraksiyonu için kurum içi G guine ATE yöntemini kullandık.Bu yöntem, ticari ca amp viral RNA kitine alternatif bir yöntemdir. Her iki yöntem de silika partiküllerinin nükleik asit bağlama özelliklerine dayanmaktadır. G Guad Dium Bio NA'nın anti nükleaz özellikleri ile birleştiğinde, RNA ekstraksiyonu için silika süspansiyonu hazırlığı sağlanır.Silika partiküllerini hazırlamak için 30 gram silikon dioksit alın, 250 mililitre demiyaralize su ekleyin ve silikonu çalkalayarak süspanse edin. 24 saatlik çökelmeden sonra, süpernatantın 215 mililitresini uzaklaştırın, vakumla 250 mililitre demiyaralize su ekleyin ve silikonu tekrar çalkalayarak süspanse edin. 24 saat sonra, süpernatantı vakumla uzaklaştırın ve silika süspansiyonunun pH değerini hidroklorik asit kullanarak pH 2.0'a ayarlayın. Cam şişelerdeki silika süspansiyonunu, g guin ve silika ile birlikte otoklavda ekstrakte edin.Şimdi, önceki adımda hazırlanan silika partikülleri kullanılarak viral RNA ekstraksiyonuna bakacağız. Kullanıma kadar -70 °C'de saklayın. %10'luk fekal süspansiyon hazırlamak için, ekstraksiyondan önce yaklaşık 0.1 gram dışkı alın ve bir mililitre PBS ile tamamlayın.Alt yükleme örneklerini beş saniye boyunca vorteksleyin ve ardından 4.000 RPM'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Her reaksiyonda, pozitif kontrol olarak nörovirüs pozitif bir dışkı örneği ve bir mikro santrifüj tüpünde DEPC işlem görmüş su kullanın. Bir mililitre L6 tamponu, 20 µL hazırlanmış silika partikülü ve 200 µL fekal ekstraktı karıştırın.Kısa süre vortexleyin ve örnekleri 15 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin. 15 saniye boyunca santrifüjleyin. Ardından peleti iki kez buffer L two ile yıkayın, sonra iki kez %70 ethanol ile ve bir kez acid on ile yıkayın.Pelleti kuru bir ısıtma bloğunda 56 °C'de beş dakika boyunca kurutun. Silica pelletindeki RNA'yı 50 µL RNA içermeyen distile su ekleyerek hidrate edin. Bir µL RNA sin ekleyip vortekslendirin ve 56 °C'de 15 dakika boyunca bekletin.Tam hızda üç dakika boyunca santrifüjleyin ve RNA içeren süpernatantı toplayın. Örnekleri non-drop tekniği ile miktar belirleme işlemine tabi tutun ve ekstre edilen RNA'yı -70 °C'de saklayın. Kullanana kadar viral RNA'nın ticari ekstraksiyonunu gerçekleştirin.Şimdi, ticari olarak mevcut kay amp viral RNA kullanarak dışkıdan RNA ekstraksiyonunu uygulamalı olarak göstereceğiz. Kit şu içeriklere sahiptir: silika jel MinPin kolonu, tamponlar A-V-L-A-W one, W2, A VE ve taşıyıcı RNA. Kısaca prosedür şu şekildedir.Bir miktar buffer A VL'yi taşıyıcı RNA ile karıştırın ve vorteksleyin. Çözeltiden 114 µL'yi, 1,5 mL'lik tüplerdeki dışkı süspansiyonuna ekleyin ve kısa süreli vorteksleyerek karıştırın. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Numuneleri kısa süreli santrifüjleyin.Örneklere etanol ekleyin ve 15 saniye boyunca vortexleyerek karıştırın. Ardından kısa süreli santrifüjleyin ve çözeltiyi 2 mL'lik bir toplama tüpü içindeki spin kolona uygulayın. Santrifüjleyin.Ardından spin kolonunu yeni bir toplama tüpüne yerleştirin. Kolonu, taşıyıcı RNA içermeyen tampon A W 1 kullanarak bağlı RNA'yı yıkamak için santrifüjleyin. Kolonu temiz bir 2 mL'lik toplama tüpüne yerleştirin ve kolonu tamponla yıkayın.W2 santrifüjünü tam hızda çalıştırın, pin kolonunu temiz bir 1,5 mililitre mikro santrifüj tüpüne yerleştirin ve tam hızda santrifüjleyin. RNA'yı tampon A VE kullanarak ekstrakte edin; viral RNA'yı kullanıma kadar -70 °C'de saklayın. Ekstrakte edilen RNA'daki norovirüs tespiti, spesifik TaqMan probları ile tek basamaklı gerçek zamanlı PCR yapılarak gerçekleştirilir. Genogrup 1 ve genogrup 2 için master miks hazırlayın; analiz sırasında enzim RT miksini buz üzerinde tutun. Kit şu bileşenleri içerir: PCR suyu, master miks, 2x primerler ve problar.Birinci grup primerleri ve Dina İkinci Grup için prob. Ve son olarak, enzim RT karışımı, kullanmadan önce vortexleyin; PCR suyu ve 2X master mix, COG G1 ileri ve geri primerleri ve UniGroup için prob ring 1 A ve 1 B. Birinci grup master mix ve VA ters yönlü COG G2 primerleri ve prob.İkinci tüpü Theo Grup iki master mix için hazırlayın. Son olarak, her iki INO grup master mix'ine enzyme artix ekleyin. Vorteksleyin ve uygun master mix'ten 10 µL'yi reaksiyon kuyucuklarına ekleyin.Başka bir tüpe, beş mikrolitre seyreltilmemiş RNA, beş mikrolitre G1 ve G2 pozitif kontrol RNA'sı ve beş mikrolitre negatif kontrolü ilgili reaksiyon disklerine ekleyin. 6.000 g'de 10 saniye boyunca santrifüjleyin. Adım bir yazılımı gelişmiş kurulumu göstermektedir.Deney özellik ekranında, deney norovirüs olarak tanımlanmıştır. Deney türü, hedef ekranında varlık veya yokluk olarak belirtilmiştir. PCR reaksiyon plakasında tespit etmek istediğiniz hedefin adını giriniz.Örnek ve tekrar ekranında, grup bir ve iki raporlayıcı ailesini ve söndürücü Tamara'yı belirleyin. Reaksiyon plakasına dahil edilen örneklerin, pozitif ve negatif kontrollerin sayısını girin ve ardından çalıştırma yönteminde hangi örneklerin veya hedef yönünün ayarlanacağını seçin. İlk olarak, tamamlayıcı DNA sentezi için 50 °C'de ters transkripsiyon gerçekleştirin.Ardından, hot start polimerazı aktive etmek için sıcaklığı 95 °C'ye yükseltin. Döngüyü 95 °C'de belirli bir süre tutarak başlatın ve bunu 60 °C'de birleşik bir denatürasyon ve amplifikasyon adımıyla takip edin. Bu döngüyü dört ila beş kez tekrarlayın ve plaka kurulumuna geri dönün.Bir şablonu kaydede tıklayın ve deneyi kaydedin. Çalışmayı başlat'a tıklayın. Amplifikasyon grafik ekranı, cihazınız bir çalışma sırasında donmuş verileri toplarken numune amplifikasyonunu ve grafik kontrastını görüntülemenize olanak tanır.Normalize edilmiş dalış floresansı ve döngü sayısı. PCR'ın başlangıç döngülerinde, floresan sinyalinde çok az değişiklik olur. Bu durum baz hattını belirler.Baz çizgisinin üzerinde meydana gelen floresan artışı, birikmiş hedefin tespit edildiğini gösterir. Baz çizgisinin üzerine sabit bir floresan eşiği belirlenmelidir. CT eşik döngüsü parametresi, floresanın sabit eşiği geçtiği kesirli döngü sayısı olarak tanımlanır.Amplifikasyon grafiği ekranı, negatif kontrol kuyucuklarındaki artmış floresans ve beklenen döngüde tespit edilebilir floresansın yokluğu gibi anormal amplifikasyonların belirlenmesi ve incelenmesi için kullanışlıdır. Kit yöntemi güvenilirdir ancak çok fazla zaman ve kaynak gerektirir. Burada, maliyet etkin olan ve yurt dışından satın alınan malzemelere olan bağımlılığı ortadan kaldıran, ülke içinde kolayca temin edilebilen reaktifleri kullanan ve aynı derecede güvenilir bir yöntem gösterdik; tüm bunlar nihayetinde çocuklarda gastroenteritin en yaygın viral nedenlerinin daha erişilebilir teşhisine ve hızlı tedavisine yol açacaktır. Nükleik asitleri izole etmek için, benzer sonuçlar elde edilen ekonomik kurum içi yöntemi kullanarak.Kerogen şirketinden temin edilen ticari kit ile laboratuvarımızda geliştirilen TAC MAN, R-T-P-C-R kullanılarak elde edilmiştir. Geniş bir nörovirüs enfeksiyonu yelpazesini tespit edebilmekteyiz. Analiz, amplifikasyon sonrası ürün işlemesini ortadan kaldırarak analiz süresini kısalttığı için rutin tanı uygulamalarında yararlı olduğunu kanıtlamıştır.Teşhisin yanı sıra protokol, nörovirüs enfeksiyonunun epidemiyolojisini netleştirmek için de kullanılabilir ve böylece bu hastalığın halk sağlığı kontrolünde faydalı olabilir.

detection-genogrouping-noroviruses-from-children-s-stools-taqman-one

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

EPA Metod 1615, çevre ve içme sularındaki enterovirüsleri ve norovirüsleri konsantre etmek için elektropozitif bir filtre kullanır. Bu el yazması, Yöntem 1615 analizleri için numune toplama prosedürünü açıklamaktadır.

Enterovirus Kültür ve RT-qPCR Su Norovirüs Oluşum EPA Metot 1615 Ölçüm. Virüs Örneklerinin I. Koleksiyonu

Burada, Buffalo Green Monkey böbrek hücresi hattını kullanarak toplam kültürlenebilir virüsleri ölçmek için bir prosedür sunuyoruz. Prosedür, çevresel ve içme sularında bulaşıcı virüslerin oluşumunu ölçmek için standartlaştırılmış bir araç sağlar.

Enterovirus Kültür ve RT-qPCR Su Norovirus Oluşum EPA Metot 1615 ölçülmesi. II. Toplam kültürlenebilir virüs Deneyi

Burada, ters transkripsiyon-kantitatif PCR kullanarak çevresel ve içme sularında enterovirüs ve norovirüsü ölçmek için bir prosedür sunuyoruz. EPA Metodu 1615'ten alınan bu standardize prosedürle yeraltı sularından ortalama virüs geri kazanımı, poliovirüs için %20 ve murin norovirüsü için %30 idi.

Enterovirüs Kültür ve RT-qPCR Su Norovirus Oluşum EPA Method 1615 Ölçümü. Bölüm III. RT-qPCR Virüs Algılama

Çevresel sert yüzeylerde norovirüsün tespiti ve miktarının belirlenmesi için makro köpük tabanlı bir örnekleme metodolojisi geliştirilmiş ve değerlendirilmiştir.

Yüzeyler İnsan Norovirus Tespiti sürüntü Örnekleme Yöntemi

Viral genom amplifikasyon kullanan rutin algılama yöntemleri bulaşıcı olmayan parçacıklar bulaşıcı ayırımcılık için kendi yetersizlik tarafından sınırlıdır. Bu makalenin amacı, aptamer bağlama, dinamik ışık saçılma ve transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak bulaşıcı norovirus parçacıkların ayrımcılık yardım etmek alternatif yöntemler detaylı protokollerde sağlamaktır.

Viral kapsid yapısal bütünlük belirlenmesi için alternatif Vitro yöntemleri

Ters transkripsiyon (RT-qPCR) ile birlikte gerçek zamanlı nicel polimeraz zincir reaksiyonu analiz RNA virüs enfeksiyonları düzeyini ölçmek için yaygın olarak kullanılmış. Burada dang virüs dahil olmak üzere birkaç RNA virüsleri miktar için geliştirilen bir RNA arıtma adım gerekli değildir doğrudan bir RT-qPCR tahlil mevcut.

Dang virüs RNA kültür süpernatant gerçek zamanlı nicel polimeraz zincir reaksiyonu tarafından enfekte hücre içinde ölçme

Bu iletişim kuralı Tilapia Gölü virüs (TiLV) RT-PCR yöntemlerini kullanarak tilapia dokularda tanılar. Tüm yöntemi doku diseksiyon toplam RNA emme, ardından cDNA sentezi ve TiLV geleneksel PCR veya kantitatif PCR dsDNA bir floresan bağlama boya bağlama kullanarak tarafından algılanması için tanımlanır.

Tilapia Gölü virüs kullanarak geleneksel RT-PCR ve SYBR yeşil RT-qPCR

Burada belirli büyüme oranı ve diğer Rotavirüs plak tahlil ve RT-qPCR kullanarak hücre bağlama yeteneği ölçmek için iki protokol mevcut. Bu protokoller fenotipleri farklılıkları Rotavirüs suşları arasında teyit için kullanılabilir.

Belirli büyüme oranı ve hücre-bağlama yeteneği Rotavirüs deneyleri

Protokol, Helicobacter pylori enfeksiyonu ve klaritromisin ve kinolonlara direnci için uygun ve hızlı bir tanı yöntemi sunmak için kantitatif bir polimeraz zincir reaksiyonu ile birlikte invaziv olmayan bir dışkı örneklemesi kullanır.

Helicobacter pylori Enfeksiyonu ve Antibiyotik Direncinin Dışkı ile Saptanması Kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu Analizi

Kantitatif Real Time PCR (qPCR) tümör örneklerinde çeşitli mikroRNA ifade seviyeleri (miRNA) molekülleri araştırmak için hızlı ve duyarlı bir yöntemdir. Farklı miRNA moleküller yüzlerce bu yöntem ifadesi kullanılarak, amplifiye miktarı, ve aynı cDNA şablon ile analiz edilebilir.

Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR (qPCR) tarafından Prostat tümörlerinde mikroRNA Algılama

Öğrenin çocuk dışkılarından Norovirus tespiti ve genogrup belirleme için tek aşamalı RT-PCR yöntemini. TaqMan probları kullanan bu maliyet etkin analiz, klinik ve epidemiyolojik çalışmalarda güvenilir tanı sağlar.

Taqman By Çocuk Tabureler gelen Noroviruses tespiti ve Genogrouping Tek aşamalı RT-PCR

Daha fazla video keşfet