Roman kullanarak Spinal Kord Yaralanması sonra Fare Hind Ekstremite Kemik Kaybı Boyuna değerlendirilmesi, In vivo, Metodolojisi

Bu prosedür, omurilik yaralanması sonrası farelerde arka ekstremite kemik yoğunluğundaki zamana bağlı kaybın tespit edilmesi ve miktarının belirlenmesi için kullanılan yeni bir yöntemi göstermektedir. Bu işlem, öncelikle steril ve ALAC onaylı koşullar altında, anestezi uygulanmış bir farede spinal transection yaralanması gerçekleştirilerek yapılır. Ardından, bir iyileşme döneminden sonra hayvan tekrar anestezi altına alınır ve her iki arka ekstremitenin tibia ve fibula kemiklerinin X-ışını görüntüleri elde edilir.

Bu işlem, yaralanma sonrası 40 güne kadar haftalık olarak gerçekleştirilir. Ardından, röntgen taramalarının görüntü analizi yapılır. Son adım ise, çıkarılan arka ekstremite kemiklerinin kemik yoğunluğuna yönelik post-mortem değerlendirmesinin yapılmasıdır.

Nihayetinde sonuçlar, omurilik yaralanmasının farenin arka ekstremitelerinde hızlı ve ilerleyici bir kemik yoğunluğu kaybını nasıl tetiklediğini göstermektedir. Bu yeni yöntem, diğer görüntüleme modaliteleri tarafından kullanılanlardan daha düşük X-ışını dozları kullanarak güçlü uzamsal ve zamansal çözünürlük sağlamaktadır. Osteoporoz, omurilik yaralanmasıyla yaşayan kişileri etkileyen, yaşamı tehdit eden bir durumdur.

Önerdiğimiz yöntem, omurilik yaralanmasıyla ilgili hayvan çalışmalarında kullanılabilecek, araştırmacıya osteoporozla ilişkili kemik kaybını uzun zaman dilimleri boyunca boylamsal olarak takip etme imkanı tanıyan yeni bir yöntemdir. Bu durum iki nedenden dolayı önemlidir. Birincisi, bu yöntem osteoporozun gelişimini şekillendiren mekanizmaların incelenmesi için bir fırsat sağlayacaktır.

İkincisi ise, omurilik yaralanması olan hastalarda osteoporozun gelişimini önlemek veya belki de tersine çevirmek için tasarlanan yeni müdahaleleri test etmemize olanak sağlamasıdır. Bu yöntem, omurilik yaralanması kaynaklı osteoporoz hakkında bilgi sağlayabilse de, postmenopozal kadınlarda görülen yaşa bağlı kemik kaybı ve diğer travma kaynaklı kemik yoğunluğu azalmaları gibi diğer sistemlere de uygulanabilir; izolasyon, kırık veya diğer hasarlar sonrası gelişen ekstremite kullanılmazlıkları, iyileşme sürecinde önemli kemik kayıplarına yol açabilir. Tüm hayvan üzerinde boylamsal düşük doz X-ışını görüntülemesinin uygulanması, bu sorunları minimize etmek veya önlemek için tasarlanan tedavilerin geliştirilmesinde yeni yollar sunabilir.

Omurilik yaralanması cerrahisini, sander prosedürlerine ve yerel kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesi kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirin. Ardından, omurilik cerrahisinden sonraki 10. günde başlayarak 40. güne kadar 10 günlük aralıklarla devam edin. Yaşayan, anestezi altındaki transection omurilik yaralanmalı hayvanların ve yaralanmamış yaş eşleşmeli kontrollerin sağ ve sol femur ve tibialarını ivus Lumina XR sistemini kullanarak tarayarak değerlendirin; tarama işleminden önce, dahili kameranın eksi 90 degrees Celsius çalışma sıcaklığına ulaşmasını sağlamak için Lumina XR cihazını başlatın.

Anestezize edilmiş hayvanı Lumina xr içindeki platforma yerleştirin. Ardından, hem femur hem de tibia bölgelerine odaklanmayı sağlamak için yüksek büyütmeli bir lens takın. Deneğin görüş alanında uygun şekilde konumlandığını kontrol edin.

Gerekirse kapıyı açın ve hayvanın konumunu yeniden düzenleyin. Hayvanın doğru konumlandırılması burada gösterilmiştir. Doğru şekilde konumlandırıldıktan sonra röntgen fonksiyonu yürütülebilir.

Enerji açılır listesinden hayvanlar için uygun olan seçeneği belirleyin. Ardından kontrol panelini açın. X-ray seçeneğini işaretleyerek x-ray özelliğini etkinleştirin ve x-ray görüntüsünü elde edin.

Burada görüldüğü gibi, femur ve tibia kemiklerinin tamamı görünür olmalıdır. Canlı görüntüleme yazılımı varsayılan olarak dönüştürülmüş röntgen görüntülerini gösterdiğinden, düzeltme filtreleme araçları menüsüne girip röntgen absorbsiyonu yanındaki onay işaretini kaldırarak ham röntgen görüntülerinin görüntülendiğinden emin olun. Ham görüntü verileri otomatik olarak sabit sürücüye kaydedilir.

Temsili TIFF dosyaları da kaydedilir. Görüntüleme işleminden sonra fare, kendi kafesine geri götürülür ve araştırmacı gözetiminde iyileşmesine izin verilir. İşlem daha sonra bir sonraki fare ile tekrarlanır.

Öncelikle, karşınıza çıkan iletişim kutusundaki living image simgesine çift tıklayarak yazılımı açın. İlgili klasörü seçin ve tamam'a tıklayın. Gözat butonuna tıklayarak bir röntgen görüntüsü yükleyin.

Canlı görüntü tarayıcı, seçilen verileri kullanıcı kimliği ile birlikte görüntüler. Etiket bilgileri ve kamera yapılandırma bilgileri. Verileri açmak için veri satırına çift tıklayın. Görüntü ve araç paleti görüntülenir.

Açık veri tarayıcıda mavi ile vurgulanmıştır. Ardından, ROI araçlarına tıklayın. ROI araçlarındaki araç paletinde, tip açılır listesini açın ve ölçüm ROI'sini seçin.

Bu deneyde kullanılan üç ROI'yi yüklemek için kare simgesine tıklayın ve kareleri yükleyin. Bir cetvel kullanarak femur uzunluğunu ölçün, iki karenin uzunluğunu toplam femur uzunluğunun sekizde biri olacak şekilde ayarlayın. Karelerin genişliğini toplam femur uzunluğunun yirmi dörtte biri olacak şekilde ayarlayın.

Şimdi cetvel yardımıyla, proksimal femur ucundan itibaren mesafenin sekizde birini ölçün ve bir dikdörtgeni bu konumun merkezine gelecek şekilde yerleştirin. İkinci dikdörtgeni distal femur ucuna taşıyın ve dizin trabeküler bölgesinin merkezinde olacak şekilde konumlandırın. Ardından tibia uzunluğunu ölçün.

Kutunun uzunluğunu toplam tibia uzunluğunun sekizde birine ayarlayın. Genişliği toplam tibia uzunluğunun otuzda birine ayarlayın. Son olarak, kutuyu burada görüldüğü gibi merkezlenecek ve proksimal tibia ucundan toplam tibia uzunluğunun sekizde biri kadar uzaklıkta olacak şekilde yerleştirin.

Ardından ölçüm simgesine tıklayın; ROI yoğunluk ölçümleri röntgen görüntüsünde görünür ve ROI ölçüm tablosu açılır. Bu tabloyu istenen konuma noktalı CSV dosyası olarak dışa aktarın. Bu işlem, tablonun Excel kullanılarak açılmasını sağlayacaktır.

Bu adımı, analiz edilecek tüm kaydedilmiş görüntüler için tekrarlayın. Son olarak, tüm verileri tek bir Excel sayfasında birleştirin. İstatistiksel anlamlılık, Microsoft Excel veya Sigma Plot 11.0 gibi bir yazılım kullanılarak student's T-testi ile belirlenir; istenirse sonuçlar, bu yöntem için standart protokoller kullanılarak çift enerjili x-ışını absorbe geometrisi ile yapılan postmortem kemik yoğunluğu analizinden elde edilen sonuçlarla karşılaştırılabilir.

Farelerin spinal kord yaralanması sonrası tibia ve femurundaki göreceli kemik yoğunluğu kaybı, naif farelerle karşılaştırıldığında yukarıdaki yöntem kullanılarak tespit edilebilir. Bu şekil, spinal kord yaralanmasından 10, 20, 30 ve 40 gün sonra proksimal tibiadaki kemik yoğunluğu kaybını göstermektedir. Yaşa uygun naif farelerle karşılaştırıldığında, sadece 10 gün sonra tibiada kemik yoğunluğunda %12 oranında anlamlı bir azalma görülmekte ve 40. günde kemik yoğunluğu kaybı %15'e kadar çıkmaktadır.

Burada, omurilik yaralanması sonrası proksimal femurda yaralanmadan 10, 20, 30 ve 40 gün sonraki kemik yoğunluğu kaybını görüyoruz. Yaşa uygun kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, yaralanmadan 40 gün sonra proksimal femurda kemik yoğunluğunda %7'lik bir azalma gözlemlenmiştir. Bu grafik, omurilik yaralanması sonrası distal femurda yaralanmadan 10, 20, 30 ve 40 gün sonraki kemik yoğunluğu kaybını göstermektedir.

Yaşa uygun naif kontrollerle karşılaştırıldığında, distal femurda kemik yoğunluğu kaybı, yaralanmadan sonraki 10. gün kadar erken bir dönemde gözlemlenebilmiş ve deneyin geri kalanı boyunca devam etmiştir. Çift enerjili X-ışını absorpsiyon geometrisi verilerinin bu temsili görüntüsü, kemik mineral içeriği ve kemik mineral yoğunluğu çıktılarını göstermektedir. Eksize edilen femurlar, omurilik yaralanmasından 40 gün sonra analiz edilmiştir.

Bu protokolde gösterilen yöntemin etkinliğini mevcut diğer yöntemlerle karşılaştırmak amacıyla, bu şekil; omurilik yaralanması geçiren farelerin femurlerinde, cerrahi işlemden 40 gün sonraki kemik mineral içeriğinin (gram cinsinden) yaşa uygun kontrol grubuyla karşılaştırıldığı çift enerjili x-ışını absorpsiyon geometrisi analizini göstermektedir. Omurilik yaralanması olan farelerde, kontrol grubuna kıyasla kemik mineral içeriğinde anlamlı bir %12 kayıp gözlemlenmiştir.

Burada, spinal kord yaralanmalı farelerin femurinde, yaralanmadan 40 gün sonrası ile yaşa uygun kontrol farelerinin karşılaştırıldığı, miligram/santimetrekare cinsinden kemik mineral yoğunluğunun çift enerjili, ekstra abor geometri analizini görüyoruz. Kemik mineral yoğunluğu kaybı anlamlı düzeyde değişmemiştir, ancak kemik mineral içeriği ile benzer bir eğilim izlemiştir. Bu işlem tekniğe hakim olunduğunda 20 ila 30 dakika içinde tamamlanabilir; ancak arka ekstremitelerin doğru şekilde konumlandırılmasının önemli olduğunu unutmayın.

Bu videoyu izledikten sonra, Caliper Instruments Lumina XR cihazını kullanarak omurilik yaralanması sonrası canlı hayvanlarda kemik yoğunluğunun boylamsal değerlendirmesinin nasıl yapılacağı konusunda fikir sahibi olmalısınız.