Roman kullanarak Spinal Kord Yaralanması sonra Fare Hind Ekstremite Kemik Kaybı Boyuna değerlendirilmesi, In vivo, Metodolojisi

Bu prosedür, spinal kord yaralanması sonrası farede arka ekstremite kemik yoğunluğundaki zamana bağlı kaybın saptanması ve miktarlarının belirlenmesi için kullanılan yeni bir yöntemi göstermektedir. Bu işlem, öncelikle steril ve ALAC onaylı koşullar altında, anestezi altındaki bir fareye spinal transection yaralanması uygulanarak gerçekleştirilir. Ardından, bir iyileşme döneminden sonra hayvan tekrar anesteziye alınır ve her iki sağ ve sol arka ekstremitenin tibia ve fibula X-ray görüntüleri elde edilir.

Bu işlem, yaralanma sonrası 40 güne kadar haftalık olarak gerçekleştirilir. Ardından, röntgen taramalarının görüntü analizi yapılır. Son adım ise, çıkarılan arka ekstremite kemiklerinde post-mortem kemik yoğunluğu değerlendirmesi yapmaktır.

Sonuçlar, omurilik yaralanmasının farenin arka ekstremitelerinde hızlı ve ilerleyici bir kemik yoğunluğu kaybına nasıl yol açtığını göstermektedir. Bu yeni yöntem, diğer görüntüleme modaliteleri tarafından kullanılanlardan daha düşük X-ışını dozları kullanarak güçlü bir uzamsal ve zamansal çözünürlük sağlar. Osteoporoz, omurilik yaralanmasıyla yaşayan kişileri etkileyen, yaşamı tehdit eden bir durumdur.

Önerdiğimiz yöntem, omurilik yaralanmasıyla ilgili hayvan çalışmalarında kullanılan ve araştırmacıya osteoporozla ilişkili kemik kaybını uzun zaman dilimleri boyunca boylamsal olarak takip etme imkanı tanıyan yeni bir yaklaşımdır. Bu durum iki nedenden dolayı önemlidir. Birincisi, bu yöntem osteoporoz gelişimini şekillendiren mekanizmaların incelenmesi için bir fırsat sağlayacaktır.

İkincisi, omurilik yaralanması olan hastalarda osteoporoz gelişimi önlemek veya belki de geri çevirmek için tasarlanmış yeni müdahaleleri test etmemiz için bize bir yol sunmasıdır. Bu yöntem, omurilik yaralanması kaynaklı osteoporoz hakkında bilgi sağlayabilse de, postmenopozal kadınlarda görülen yaşa bağlı kemik kaybı gibi diğer sistemlerin yanı sıra, travma kaynaklı kemik yoğunluğu azalmalarıyla da uygulanabilir; izolasyon sonucu gelişen ekstremite kullanılamamaları, kırıklar veya diğer hasarlar iyileşme sürecinde ciddi kemik kaybına yol açabilir. Tüm hayvana yönelik boylamsal düşük doz X-ışını görüntülemesinin uygulanması, bu sorunları minimize etmek veya önlemek için tasarlanan tedavilerin geliştirilmesinde yeni yollar sunabilir.

Omurilik yaralama cerrahisini sander prosedürlerine ve yerel kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesi kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirin. Ardından, omurilik cerrahisinden sonraki 10. günde başlayarak 40. güne kadar 10 günlük aralıklarla devam edin. Canlı anestezi altındaki transeksiyona maruz kalmış omurilik yaralanmalı hayvanların ve yaralanmamış yaş eşleşmeli kontrollerin sağ ve sol femur ve tibialarını ivus Lumina XR sistemi ile tarayarak değerlendirin; tarama işleminden önce, dahili kameranın -90 °C çalışma sıcaklığına ulaşmasını sağlamak için Lumina XR cihazını başlatın.

Anestezize edilmiş hayvanı Lumina xr içindeki platforma yerleştirin. Ardından, hem femur hem de tibia bölgelerine odaklanabilmek için yüksek büyütmeli bir lens takın. Deneğin görüş alanı içerisinde doğru şekilde konumlandığını kontrol edin.

Gerekirse kapıyı açın ve hayvanın konumunu yeniden ayarlayın. Hayvanın doğru konumlandırılması burada gösterilmiştir. Doğru şekilde konumlandırıldıktan sonra x-ray fonksiyonu çalıştırılabilir.

Enerji açılır listesinden hayvanlar için uygun olan seçeneği belirleyin. Ardından kontrol panelini açın. x-ray seçeneğini işaretleyerek x-ışını özelliğini etkinleştirin ve x-ışını görüntüsünü alın.

Burada görüldüğü gibi, femur ve tibanın tamamı görünür olmalıdır. Canlı görüntüleme yazılımı varsayılan olarak dönüştürülmüş röntgen görüntülerini gösterdiğinden, düzeltme filtreleme araçları menüsüne girip röntgen absorbsiyonu seçeneğinin yanındaki onay işaretini kaldırarak ham röntgen görüntülerinin görüntülendiğinden emin olun. Ham görüntü verileri otomatik olarak sabit sürücüye kaydedilir.

Temsili TIFF dosyaları da kaydedilir. Görüntüleme işleminden sonra fare, kendi kafesine geri götürülür ve araştırmacının gözlemi altında iyileşmesine izin verilir. İşlem daha sonra bir sonraki fare ile tekrarlanır.

Öncelikle, karşınıza çıkan iletişim kutusundaki living image simgesine çift tıklayarak yazılımı açın. İlgili klasörü seçin ve tamam'a tıklayın. Gözat butonuna tıklayarak bir röntgen görüntüsü yükleyin.

Canlı görüntü tarayıcısı, seçilen verileri kullanıcı kimliği ile birlikte görüntüler. Etiket bilgileri ve kamera yapılandırma bilgileri yer alır. Verileri açmak için veri satırına çift tıklayın. Görüntü ve araç paleti görüntülenir.

Açık veri tarayıcıda mavi ile vurgulanmıştır. Ardından, ROI araçlarına tıklayın. ROI araçlarındaki araç paletinde, tür açılır listesini açın ve ölçüm ROI seçeneğini belirleyin.

Bu deneyde kullanılan üç ROI'yi yüklemek için kare simgesine tıklayın ve kareleri yükleyin. Bir cetvel kullanarak femur uzunluğunu ölçün, iki karenin uzunluğunu toplam femur uzunluğunun sekizde biri olacak şekilde ayarlayın. Karelerin genişliğini toplam femur uzunluğunun 24'te biri olacak şekilde ayarlayın.

Şimdi cetvel ile proksimal femur ucundan itibaren mesafenin sekizde birini ölçün ve bir dikdörtgeni bu konuma merkezlenecek şekilde yerleştirin. İkinci dikdörtgeni distal femur ucuna taşıyın ve dizin trabeküler bölgesi içinde merkezlenecek şekilde konumlandırın. Ardından tibia uzunluğunu ölçün.

Kutunun uzunluğunu, toplam tibia uzunluğunun sekize birine göre ayarlayın. Genişliğini ise toplam tibia uzunluğunun otuzda birine göre ayarlayın. Son olarak, burada görüldüğü gibi kutuyu merkezleyerek proksimal tibia ucundan toplam tibia uzunluğunun sekizde biri kadar uzaklığa yerleştirin.

Ardından, ölçüm simgesine tıklayın; ROI Yoğunluk ölçümleri röntgen görüntüsünde belirir ve ROI ölçüm tablosu açılır. Bu tabloyu, nokta CSV dosyası olarak istenen konuma aktarın. Bu işlem, tablonun Excel kullanılarak açılmasını sağlayacaktır.

Bu adımı, analiz edilecek tüm kaydedilmiş görüntüler için tekrarlayın. Son olarak, tüm verileri tek bir Excel sayfasında birleştirin. İstatistiksel anlamlılık, Microsoft Excel veya Sigma Plot 11.0 gibi yazılımlar kullanılarak yapılan bir t-testi ile belirlenir; istek üzerine sonuçlar, bu yöntem için standart protokoller kullanılarak çift enerjili X-ışını absorbsiyometrisi ile yapılan postmortem kemik yoğunluğu analizinden elde edilen sonuçlarla karşılaştırılabilir.

Omurilik yaralanması sonrası bir farenin tibia ve femurundaki göreceli kemik yoğunluğu kaybı, naif farelerle karşılaştırıldığında yukarıdaki yöntemle tespit edilebilmektedir. Bu şekil, yaralanmadan sonraki 10, 20, 30 ve 40. günlerde proksimal tibiadaki kemik yoğunluğu kaybını göstermektedir. Yaşla eşleştirilmiş naif farelerle karşılaştırıldığında, sadece 10 gün sonra tibiada kemik yoğunluğunda anlamlı bir %12 azalma görülmekte ve 40. günde kemik yoğunluğu kaybı %15'e kadar çıkmaktadır.

Burada, omurilik yaralanmasından sonra proksimal femurda, yaralanmanın 10, 20, 30 ve 40. günlerinde meydana gelen kemik yoğunluğu kaybını görüyoruz. Yaşa uygun kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, yaralanma sonrası 40. günde proksimal femurda kemik yoğunluğu kaybında %7'lik bir azalma gözlemlenmiştir. Bu grafik, omurilik yaralanmasından sonra distal femurda, yaralanmanın 10, 20, 30 ve 40. günlerinde meydana gelen kemik yoğunluğu kaybını göstermektedir.

Yaşa uygun naif kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, distal femurda kemik yoğunluğunun kaybı, yaralanmadan sonraki 10. gün kadar erken bir dönemde gözlemlenmiş ve deneyin geri kalanında devam etmiştir. Çift enerjili x-ışını absorpsiyon geometrisi verilerinin bu temsilci görüntüsü, kemik mineral içeriği ve kemik mineral yoğunluğu çıktılarını göstermektedir. Eksize edilen femurlar, spinal kord yaralanmasından 40 gün sonra analiz edilmiştir.

Bu protokolde gösterilen yöntemin etkinliğini şu an mevcut olan diğer yöntemlerle karşılaştırmak için, bu şekil, omurilik yaralanması olan farelerin femurunda, ameliyat sonrası 40. günde, yaşa uygun kontrol grubuyla karşılaştırıldığında gram cinsinden kemik mineral içeriğinin çift enerjili X-ışını absorpsiyon geometrisi analizini göstermektedir. Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, omurilik yaralanması olan farelerde kemik mineral içeriğinde %12'lik anlamlı bir kayıp gözlemlenmiştir.

Burada, omurilik yaralanmalı farelerin femurunda, yaralanma sonrası 40. günde, yaşa uygun kontrol grubu farelere kıyasla miligram/santimetre kare cinsinden kemik mineral yoğunluğunun çift enerjili X-ışını absorbsiyometre (DEXA) geometri analizini görüyoruz. Kemik mineral yoğunluğu kaybı anlamlı bir değişiklik göstermemiş, ancak kemik mineral içeriği ile benzer bir eğilim izlemiştir. Bu işlem, yöntem uzmanlaşıldığında 20 ila 30 dakika içinde tamamlanabilir; ancak arka ekstremitelerin doğru konumlandırılmasının önemli olduğunu unutmayın.

Bu videoyu izledikten sonra, Caliper Instruments Lumina XR cihazı kullanarak omurilik yaralanması sonrası kemik yoğunluğunun canlı hayvanlarda boylamsal değerlendirmesinin nasıl yapılacağı konusunda fikir sahibi olmalısınız.