Sıçanlarda Kabul edilmiş Gecikmeli-Tipi aşırı duyarlılık indüksiyonu ve İzleme

Ben Christine Beaton. California Üniversitesi Irvine'deki Fizyoloji ve Biyofizik Bölümü'nde, George Chen'in laboratuvarında araştırma asistanıyım. Önümüzdeki birkaç gün boyunca size Lewis sıçanlarında adaptif DTH oluşturma ve ölçme prosedürünü göstereceğim.

Bu prosedür beş gün sürmektedir ve size burada; antijen spesifik T hücrelerinin nasıl aktive edileceğini ve ardından iki gün sonra bu hücrelerin naif sıçanlara nasıl enjekte edileceğini göstereceğim. İki gün sonra, sıçanların kulaklarına, söz konusu T hücrelerinin spesifik olduğu antijenle challenge uygulayacağız. Bir gün sonra ise bu sıçanlardaki inflamasyon derecesini ölçeceğiz.

Doku kültürüme serum elde etmek için kan almam gerekiyor. Bunun için kardiyak ponksiyon yapıyorum. Sol işaret parmağımı solar pleksus üzerine yerleştiriyorum ve iğnemle kaburgaların arasından kalbe ulaşıp mümkün olduğunca fazla kan aspire ediyorum.

Ve tek bir çekimde, güne ve verimliliğe bağlı olarak, belirli bir sıçandan 2 ile 10 ml arasında kan alabiliriz. Kültürde seruma ihtiyaç duymamızın nedeni, syngeneic olan Louis sıçan hücrelerini serum içinde büyütmek istememizdir. Bu nedenle bunlar Louis sıçan serumu olacaktır.

Ardından kanı bir tüpe aktarıyorum, ancak doku kültürümde daha sonra kullanmak istediğim serumda hemoliz oluşmaması için şırıngadaki iğneyi çıkarmaya dikkat ediyorum. Kalbin atışı durduğu ve sıçan öldüğü için şimdi timusu çıkaracağım.

Öncelikle, doku kültürü için kullanacağım organın içine tüy kaçmadığından ve etrafta uçuşmadığından emin olmak için %70 ethanol ile sprey sıkıyorum. Diseksiyonu gerçekleştirmek için otoklavlanmış aletler kullanıyorum. İlk olarak deriyi kesip çıkarıyorum.

Deriyi çıkardıktan sonra, kalbin hemen üzerinde yer alan timusa zarar vermediğimden emin olmak için göğüs kafesinin her iki yanını dikkatlice keserim. Timus, burada kalbin hemen üzerinde yer alan soluk, neredeyse beyaz bir organ olarak görülebilir. Organın tamamını aldığından emin olarak timusu çıkarırım; ancak daha sonra steril kabinde temizleyeceğim için çıkarma işlemini çok titiz yapmama gerek yoktur.

Ardından örneği, içeriğine penisilin ve streptomisin eklediğim PBS içeren bir tüpe yerleştiriyorum. Herhangi bir bakteriyel büyümeyi önlemek için şimdi hücrelerimden tek hücre süspansiyonu hazırlayacağım. Bunun için 70 mikronluk bir hücre süzgeci kullanacağım.

Ve elbette, tüm steril ekipmanları kullanacağım. Timusu bir Petri kabına aktarıyorum. Ve görebileceğiniz üzere, pek temiz değil.

Timus beyazımsı organdır ve üzerinde lenf düğümleri ile kan pıhtıları bulunmaktadır. Bu yüzden bunları temizleyeceğim. Timus temizlendikten sonra onu almak için hücre süzgecime antibiyotiklerle desteklenmiş yaklaşık 10 mL PBS koyacağım.

Temizlemek için, timusumdaki tüm kontaminanları basitçe uzaklaştırıyorum. Şu an timusum neredeyse tamamen temiz, bu yüzden cımbızla alıp hücre süzgecinin üzerinde makasla küçük parçalara böleceğim ve timusun tüm küçük parçalarını hücre süzgecinin içine yerleştireceğim. Bunu tamamladıktan sonra, parçaları hücre süzgecinden bastırarak tek hücre süspansiyonu oluşturmak için, elbette steril olan 1 mL'lik bir şırınga pistonu kullanacağım.

Ve tek hücreler geçerek hücre süzgecinin dışındaki PBS'ye aktarılacak. Böylece hücrelerimi hücre süzgecinden geçirmiş oldum ve PBS'nin artık berrak olmadığını görebilirsiniz. PBS, buz üzerinde tuttuğum 50 ml'lik bir tüpe aktaracağım tek hücre süspansiyonumla dolmuş durumda.

Hücre süzgecini PBS ile tekrar doldurup şırınga pistonunu daha fazla bastırarak, tüpümde 30 ile 40 ml arasında PBS olana kadar işlemi birkaç kez tekrarlayacağım. İşlem tamamlandığında hücre süzgeci bu şekilde görünür. Tüm hücreleri topladığımıma göre, şimdi onları 1200 RPM'de yaklaşık 10 dakika boyunca santrifüj edeceğim.

Süper santrifüjden çıkardığım hücreler burada ve beklediğim gibi pelet oldukça büyük, çünkü şu an supernatantı uzaklaştırıyorum. Dolayısıyla pelet elbette tüpün dibinde kalmaya devam ediyor. Süspansiyon oluşturmayı kolaylaştırmak için, peleti henüz neredeyse kuruymuşken parçalayacağım.

Bunun için, PT tamamen dağılana ve tekrar tek hücre süspansiyonuna dönene kadar parmağımla üzerine oldukça sertçe vuruyorum. Şimdi hücrelerimi steril PBS içinde yeniden süspanse edeceğim ve her timer başına 5 mL PBS ekliyorum. Yalnızca bir timer'ım olduğu için sadece 5 mL ekliyorum.

Ve bu, irigatöre aktaracağım süspansiyondur. Hücrelerin hâlâ canlı olduğundan ancak birkaç saat içinde öleceklerinden emin olmak için 30 °C irrigasyon seviyesini kullanıyorum. Böylece antijeni hâlâ işleyebilirler ancak kültürümü kontamine etmezler.

Aktive etmek istediğimiz T hücrelerine baktığımızda, hiç sağlıklı görünmediklerini görüyoruz. Bazıları ölmeye başlamış. Şekilleri tuhaflaşmış, artık eski hallerinde değiller.

Böylece bu hücreler aktive edilmeye hazır hale gelir. Aslında, bekleme süresinden sonra antijene oldukça ihtiyaç duyarlar. Bazıları ölmüş olacağı ve çözeltiye toksik bileşikler salacağı için onları hızlıca yıkamak son derece önemlidir.

Böylece, tüpü PBS çözeltimle 50 ml'ye tamamlıyorum. Aynı zamanda, uyarılmayı bekleyen T-hücrelerini başka bir 50 ml'lik tüpe aktaracağım; böylece her iki tüpü aynı anda santrifüje gönderebilirim.

İşte bir süre önce topladığım kan; bunu 10 dakika boyunca 37 derecede beklettim ve ardından buza koydum. Gördüğünüz gibi, kan tamamen pıhtılaşmış durumda. Bu kandan serumu elde etmem gerekiyor.

Böylece, ilk adımda steril bir pasta pipeti kullanarak, pıhtıyı tüpten ayıracağım ve ilgilendiğim serumu içeren tüm sıvıyı toplayacağım. Ayrıca pıhtıya yakalanmayan bazı hücreler de burada olacaktır. Bu sıvıyı başka bir tüpe aktaracağım; aktarım sırasında bazen küçük pıhtı parçaları da beraberinde gelir, ancak bu pek sorun teşkil etmez çünkü zaten bu sıvıda hâlâ bulunan hücreleri uzaklaştırmam gerekecektir.

Sıvının bulunduğu küçük tüpü santrifüj edeceğim. Bu işlem hücreleri ve beraberinde gelen herhangi bir pıhtı parçasını uzaklaştıracaktır; hücreleri serumdan ayırmak için kanın sıvı kısmını döndüreceğim. İki dakika boyunca döndürmek yeterli olacaktır.

Şu anda serum santrifüj edildi, bu yüzden serumu hücrelerden ayıracağım. Bu mükemmel bir örnek değil çünkü serumun sarımsı olması gerekirken, buradaki kırmızımsı renk hemoliz gerçekleştiğini gösteriyor. Yani bu kesinlikle kusursuz değil, ancak yine de size bunu nasıl filtrelediğimi göstereceğim.

0.2 µm şırınga adaptörlü filtre kullanarak serumu steril olduğundan emin olmak için filtreleyeceğim. Ancak hemoliz meydana geldiği için, serumun bu kısmını stimülasyon için kullanmayacağım. Önceki bir deney sırasında dondurulmuş olan Louis sıçan serumunu kullanacağım.

Soldaki T hücrelerinin ve sağdaki antijen sunan hücrelerin PT'leri burada yer alıyor. Şimdi her iki tüpteki süpernatantı uzaklaştıracağım. Ve daha önce yaptığım gibi, hücrelerin tekrar tek hücre süspansiyonu haline geldiğinden emin olmak için pelletleri parmağımla vurarak dağıtacağım.

Bu işlemi hem T hücreleri hem de antijen sunan hücreler için gerçekleştireceğim. Ardından, hücreleri süspansiyon haline getirip sayacağım. Daha sonra 3 milyon T hücresini 150 milyon antijen sunan hücre ile karıştırıp 10 santimetre çapındaki petri kaplarına yerleştireceğim.

Ve toplam 10 ml hacminde, burada iki serum tüpü yer alıyor. Sağdaki, bugün hazırladığım tüp ve hemoliz nedeniyle kırmızımsıdır; soldaki ise birkaç gün önce hazırlayıp dondurulmuş halde sakladığım tüptür. Sarımsıdır, hemoliz yoktur ve çok daha iyi durumdadır.

Bugün doku kültürüm için bunu kullanacağım. Altı Petri kabını stimüle edecek kadar hücrem var, bu yüzden antijen sunan hücrelere 30 ml medium ve T hücrelerine de aynı mediumdan 30 ml ekleyeceğim. Ardından, antijen sunan hücre tüpüne antijen olan ovalbumin'i ekleyeceğim.

Stok çözeltim 1 mg/mL konsantrasyonunda ve Petri kaplarında 10 µg/mL nihai konsantrasyon elde etmek istiyorum. T-hücrelerine Louis sıçan serumu ekleyeceğim. Petri kaplarında sonuç olarak %1 sıçan serumu olacak şekilde yeterli miktarda ekleme yapacağım.

Antijen sunan hücre süspansiyonumu homojenize edeceğim ve ardından bu hücre süspansiyonundan her bir Petri kabına 5 mL aktaracağım. Antijen sunan hücre süspansiyonunuzu çıkardığınızda, her zaman küçük bir yağ ve fibröz doku kütlesi olduğunu fark edeceksiniz. Bu durum tamamen normaldir.

Saha hazırlıklarımızın tamamında buna rastlıyoruz. Endişelenecek bir durum yok. Bu yüzden, eğer başarabilirsem onu temizliyorum, aksi takdirde Petri kabında bırakıyorum.

Hücre kültürümü hiçbir şekilde etkilemiyor. Tüm APC'leri Petri kaplarına aktardıktan sonra, aynı prosedürü T-hücreleri ile tekrarlayacağım. Bu nedenle, her bir Petri kabına beş mL T-hücresi süspansiyonu ekleyeceğim.

Şu anda tüm hücrelerim Petri kaplarında ve tüm T-hücrelerinin bir antijen sunan hücreyle temas etme şansına sahip olması için onları çok iyi karıştırmak oldukça önemlidir. Bu nedenle, Petri kaplarını üst üste dizerim ve kaplarla görünmez sekizler çizerek karıştırma işlemini gerçekleştiririm. Tüm hücrelerin iyi karıştığından emin olmak için bunu birkaç kez tekrarlarım.

Tüm karıştırma işlemleri bittikten sonra, bu plakları 37 °C ve %5CO2 içeren nemli bir atmosfere sahip inkübatöre yerleştireceğim. 48 saat boyunca inkübatörde beklettikten sonra, besiyerinin rengi hafifçe değişti, şu an daha turuncu görünüyor ve hücreler iyice aktive oldu.

Böylece tüm Petri kaplarını mikroskop altında tek tek kontrol ediyorum. Çok büyük hücreler aktive olmuş T-hücreleri, çok küçük olanlar ise ölü antijen sunan hücrelerdir. T-hücrelerinin devasa olduğu görüldüğünden, stimülasyon gerçekten başarılıdır.

Ve Petri kabını biraz hareket ettirirsem, şurada sol tarafta gördüğünüz, şimdi merkeze gelen, büyük bir hücre kümesi var ve bunlar aktif olarak bölünen hücrelerdir. Şimdi, tüm hücreleri çöktürmek, saymak ve ardından sıçanlara 10 milyon tane enjekte edebilmek için santrifüj tüplerine koyacağım. Stimülasyon o kadar iyiydi ki, bir sıçana enjekte etmek için tüm bu T hücrelerine ihtiyacım yok.

Şimdi yapacağım şey, sadece iki petri kabındaki hücreleri kullanmak olacak. Böylece 10 milyon hücreyi enjekte etmek için onları santrifüjle ayıracağım ve geri kalan hücreleri birkaç gün içinde dondurmak üzere kültüre alacağım.

Kültür ortamı, T-hücre büyüme faktörü ve at serumu eklenmiş standart T-hücresi kültür ortamıdır. T-hücreleri nonadherent (yapışmayan) yapıda olduğundan, fazla bir işlem yapmama gerek yoktur. Sadece hücrelerin çoğunun ortamla birlikte geldiğinden emin olurum.

Ardından, tüm hücreleri topladığından emin olmak için tüm petri kaplarını yeni besiyeri ile durulayacağım. Stimülasyon için kullandığım besiyerinin aynısından 10 mL kullanacağım; bence her petri kabındaki T hücreleri zaten ilk kez besiyerini aldığımda gelmiştir. Besiyeri normalde petri kaplarından çıkar, bu işlem kesinlikle gerekli değildir ancak bu hücreler değerli olduğu için hiçbirini kaybetmek istemiyorum.

Bu yüzden onları santrifüjle çöktüreceğim. Bu işlem ölü hücrelerin bir kısmını uzaklaştıracak ve çoğunlukla bu hücrelerle başlayacaktır. Ayrıca onlara taze bir besiyeri vermek istiyorum.

Bu yüzden, 1.500 RPM'de yaklaşık sekiz dakika boyunca tekrar santrifüj yapacağım. Hücreleri çöktürdüğüm için freni hâlâ açık bırakıyorum. Ardından her iki tüpü de aşağı doğru eğiyoruz ve tüplerden birinde küçük peletler görüyorum.

Bunlar iki Petri kabından geliyor. Burada ise dört Petri kabından elde edilen pelet var. Peletler oldukça büyük çünkü sadece aktive edilmiş T hücrelerini değil, aynı zamanda antijen sunan hücreleri de içeriyorlar.

Şimdi süpernatanı boşaltacağım ve buraya enjekte edeceğim hücrelere, enjeksiyon için kullanacağım bir mililitre besiyeri ekleyeceğim. Diğer hücreleri ise T-hücresi büyüme faktörü ve at serumu içeren yüz mililitre kültür besiyerinde süspanse edeceğim. Enjekte edeceğim hücreler bunlardır.

Bu hücreleri, her biri 50 ml olan iki plastik flaska koyacağım. Her flaska, kemik iliği kaynaklı olan T-hücresi büyüme faktörünün %10'unu ekleyeceğim. Ayrıca %10 ısı ile aktive edilmiş at serumu ekleyeceğim.

Ardından, ihtiyacım olan besiyerinin çoğunu ekleyeceğim. T hücreleri çok fazla pipetlenmekten hoşlanmadıkları için sıvıyı yukarı aşağı çekmiyorum. Bu yüzden onları, kesinlikle gerekli olan minimum miktarlarda pipetliyorum, çünkü bunu sevmezler ve ardından işlemi tamamlıyorum, böylece hazır hale geliyorlar.

İnkübatöre girmeye hazırlar, onları her gün kontrol ediyorum. Muhtemelen 24 saat sonra, eğer olmazsa 40 veya kesinlikle 48 saat sonra bölmem gerekecek. Ancak onları her gün kontrol edeceğim.

T-hücresi büyüme faktöründe çok hızlı büyüme eğilimindedirler. Bu nedenle en az 48 saatte bir, hatta muhtemelen daha sık bölünmeleri gerekir. Kültür ortamının rengini de kontrol edeceğim.

Şu an aktive oldular, yani tamamen aktive durumdalar. Fareye enjekte etmek için en uygun zaman budur. İki gün sonra farenin kulağından challenge uygulayacağız.

Hücrelerin dinlenme durumuna dönmesi için birkaç gün beklersek, inflamasyon bölgesine o kadar hızlı geri dönmek isteyeceklerdir. Bu nedenle şimdi hücreleri 37 °C sıcaklıkta ve %5CO2 içeren inkübatöre yerleştireceğim; sıçanla enjekte etmek için 25 gauge bir iğne kullanacağım. Hücreler intratrakeal olarak enjekte edildikten sonra, sıçanı burada bırakacağım ve 48 saat sonra kulaklardan challenge uygulayacağım.

Birkaç gün önce, bir sıçan modeline GFP etiketli albumin spesifik T hücreleri enjekte ettim. Bugün, aynı sıçanı kulaktan challenge edeceğim. Bu nedenle, sağ kulağa albumin enjekte edeceğim.

Sol kulağa ise sadece biraz PBS enjekte edeceğim. Enjekte ettiğim volin dozu, 20 µL içinde 20 µg'dır. Kullandığım albümin, Texas red işaretli albümin ile işaretlenmemiş albüminin bir bir oranındaki karışımıdır.

Sizlere enjeksiyonu nasıl yapacağımı göstereceğim bölge burasıdır. Sağ elimi kullandığım için sol elimle işlem yapıyorum. Cildi gerebilmek için sol elimdeki eldiveni çıkardım; böylece bir parmağımı kulağın altına, diğerini ise üstüne yerleştirerek cildi gerebilir, iğnenin tam olarak nerede olduğunu görebilir ve iki deri tabakası arasındaki çok ince olan hava boşluğuna girebilirim.

Bu nedenle, oraya girebilecek kadar son derece ince bir şey olması için 27 gauge iğneler kullanıyorum. Böylece ters çevirdiğimde, Texas red'in nereye ve PBS'nin nereye gittiğini kesin olarak görebilirsiniz. Şu an kulaktaki challenge işleminden 42 saat sonrasındayız ve kulak kalınlığını ölçmek için yaylı bir mikrometre kullanacağım.

Bu nedenle, hem albümin ile uyarılmış olan sağ kulağı hem de uyarılmamış olan sol kulağı ölçeceğim. Kulak kalınlığı arasındaki fark, inflamasyonun şiddeti hakkında bize bir fikir verecektir. Böylece burada sizlere, sıçanlarda adaptif DTH uygulamak için gerçekleştirilen tüm prosedürü göstermiş oldum.

Böylece size antijen spesifik T hücrelerinin in vitro ortamda nasıl aktive edileceğini, bunların sıçanlara adaptif olarak nasıl transfer edileceğini ve ardından bu sıçanların nasıl challenge edileceğini ve inflamasyon derecesinin nasıl ölçüleceğini gösterdim. Chand laboratuvarında, sıçanlardaki inflamasyon üzerinde potasyum kanalı blokerlerinin etkisini test etmek için bu prosedürü rutin olarak kullanıyoruz.