Video-rate Tarama Konfokal Mikroskop ve Mikroendoskopi

Bu video, standart hazır bileşenleri kullanarak bir video hızı taramalı konfokal mikroskobun nasıl oluşturulacağını gösterir. Bir taramalı konfokal mikroskop, ışını raster düzlem boyunca çevirmek için iki tarama aynasının koordineli hareketine dayanır: birinci aynadan gelen ışık, birinci röle merceği seti boyunca yatay olarak taranır ve bu da onu ikinci tarama aynası üzerindeki sabit bir noktaya geri odaklar. Aynı tarama hareketi daha sonra tarama ve tüp lensleri aracılığıyla çevrilir ve şimdi genişletilmiş ışık huzmesi objektif lensin arka açıklığına yerleştirilir.

Hareketi birinci aynaya kıyasla yavaş olan ikinci ayna, aynı anda Y eksenini tarayarak gösterilen düzlemin üstünde ve altında tarama eylemine izin verir ve örnek yüzeyinde dikdörtgen bir raster oluşturur. Bu protokolün ticari olarak temin edilebilen bir mikroskop satın almaya göre ana avantajı, düşük maliyet ve cihazı bir görüntüleme projesinin özel ihtiyaçlarına göre özelleştirme yeteneğidir. Herhangi bir lazerle çalışırken, gözün yaralanmasını önlemek için uygun güvenlik önlemlerini almak hayati önem taşır.

Mümkün olduğunda uygun lazer koruyucu gözlükleri taktığınızdan emin olun. Işını aktif olarak hizalamayan veya ışınla çalışmayan izleyiciler ve/veya araştırmacılar her zaman gözlük takmalıdır. Tüm parlak ve yansıtıcı saatleri veya mücevherleri çıkarın.

En önemlisi, bir kiriş bloğu veya monte edilmiş bir kartvizit kullanarak yolunu sonlandırarak kirişi her zaman takip ettiğinizden ve kontrol ettiğinizden emin olun. Bu, özellikle aynaları astarlarken önemlidir, çünkü ışının yolunu tahmin etmek zor olabilir. Ayrıca, gözlerinizi asla ışın yolu ile aynı hizada yapmayın.

Mikroskobu monte etmeden önce ışın düzlemini geçmeniz gerekiyorsa lazeri kapatın. Optik devre tahtası ve 90 derecelik braketler, tüm aynalar, lensler ve dikroik dahil olmak üzere inşaat için gerekli tüm ekipmanın yanı sıra uygun kelepçeler ve montaj donanımı, hem tarama aynaları hem de fotoğraf dedektörü dahil olmak üzere mevcut olduğundan emin olun. Tarama eylemini test etmek ve hizalama sırasında aynaları manipüle etmek için kullanışlı bir fonksiyon üretecine sahip olmak da yararlıdır.

Stabilite için devre tahtasının cıvatalanması da şiddetle tavsiye edilir. Pigtail fiber ator'ı optik yuvaya yerleştirerek ve bu düzeneği optik devre tahtasının ortasına yerleştirerek mikroskobun yapımına başlayın. Bu, burada gösterildiği gibi mavi ışının kaynağına karşılık gelir.

Işık kaynağını açın. Kirişi hem yatay hem de dikey olarak düz bir çizgide hareket edecek şekilde kabaca ayarlamak için ayar vidalarını kullanın. Fiber harmanlayıcının önüne bir iris yerleştirin.

Ardından, irisin yüksekliğini, kiriş merkezden geçecek şekilde ayarlayın. Ardından irisi ışın yolu boyunca atordan uzaklaştırın. Kirişin hizalamasını kontrol edin.

Gerekirse kirişi iris üzerinde yeniden konumlandırmak için iki ayar vidasını kullanın. Monte edilmiş diic aynayı, lazer ışını aynanın ortasına gelecek şekilde ışın yoluna yerleştirin. Işını yaklaşık 90 derece yansıtmak için ayna tutucuyu döndürün ve ışının yüksekliğinin değişmediğinden emin olun.

Montaj aparatındaki vidaları sıkarak aynayı masaya sıkıştırın. Ardından, monte edilmiş rezonans galvanizli metrik aynayı lazer ışını yoluna yerleştirin. Lazer ışınının ayna yüzeyinin tam yatay merkezine yerleştirildiğinden emin olun.

Lazer ışınını 90 derecelik bir açıyla yansıtmak için ayna montajını döndürün. Ardından, aynı lazer ışını dikey yüksekliğini korumak için aynadan yansımayı kabaca ayarlayın. Ardından, iki süsen alın ve bunları doğrudan rezonans galonun önüne yerleştirin.

Ardından, rezonans gal aynasından yansıyan lazer ışınını referans olarak kullanarak, dikey yüksekliklerini daha önce olduğu gibi ayarlayın. Şimdi, optik devre tahtası üzerindeki vida deliklerini göze kılavuz olarak kullanarak, iki süseni düz bir çizgide sıkıştırın. Işını ilk iris üzerinde ortalamak için dikroik olan yoldaki ilk aynayı ayarlayın.

Ardından yoldaki ikinci aynayı ayarlayın. Işını ikinci iris üzerinde ortalamak için rezonans gal. Işın her iki irisen boyunca hizalanana kadar bu iki aynayı yinelemeli olarak ayarlayın.

Rezonans gal aynasından yansıyan lazer ışınının yaklaşık ayna merkezinden hala yansıtıldığından emin olun. Işın sapmışsa, fiber harmanlayıcı yuvasını ayarlayın ve ışın her iki açık iris üzerinde ortalanmış durumdayken ayarlamaları tekrarlayın. Bir sonraki adım, birinci sabit tele sentrik düzlemi görüntüleyecek iki röle lensini ikinci sabit tele merkezli düzleme yerleştirmektir.

Bu özel mikroskop için, ilk rölede seçilen mercekler aynı odak uzaklığına F sahiptir, bu nedenle buradaki iki ayna arasındaki mesafe sadece dört F'dir. Bu kurulum için, F 90 milimetreye eşittir, bu nedenle dört F konumu tarama aynasından 360 milimetre uzakta olacaktır. Lenslerin ışın yolunda tam olarak ortalandığından emin olmak için, ilk lensi ışın yoluna yerleştirin ve ışın yolundaki bir sonraki iris üzerindeki lazer ışını noktasına bakın. Merceği takiben, mercek yüksekliğini, ışının dikey merkezi iris merkezinde olacak şekilde ayarlayın.

Ardından, ışını iris üzerinde ortalamak için yatay ışın konumunu ayarlayın. Bu işlemi ikinci lensle tekrarlayın. Daha sonra, tarama aynası kurulacak ve mikroskop, aksi takdirde dikey olarak ayarlanması gereken parçaların basit bir şekilde yerleştirilmesini ve hizalanmasını kolaylaştırmak için döndürülecektir.

İkinci telesentrik düzlemin tam konumunu bulmak için, rezonans gal O'yu tarama ünitesine takın ve açın. Tarama ışınının iki mercekten geçen yolunu takip etmek için bir kartvizit kullanın. İkinci telesentrik düzlem, yerleşik gal O'dan yaklaşık dört F uzakta bulunacaktır ve tarama ışınının sabit göründüğü konum olarak tanımlanabilir.

Bu konumun altındaki devre tahtasını bir kalemle işaretleyin. Telesentrik düzlem tanımlandıktan sonra, tarama aynası girişini sıfır volta ayarlayın ve aynanın nötr konumuna yerleşmesi için ayna kontrol donanımına güç verin. Ardından standart taramalı galil aynasını tele düzlemin tam konumuna yerleştirin.

Ayna konumunu, tele düzlemdeki ışın tarama aynasının tam merkezine çarpacak şekilde ayarlayın ve ayna montajını sıkın. Şimdi gal aynasını tutan kilitleme vidasını gevşetin ve döndürün, kirişin dikey olarak yayıldığından emin olun. Şimdi lazeri ve tarama elektroniğini kapatın.

Fiberin bağlantısını kesin ve tarama aynalarının bağlantısını kesin. Daha sonra 90 derecelik breadboard montaj braketleri kullanarak. İkinci breadboard'u birinciye sabitleyin.

Son olarak, yeni breadboard düz duracak şekilde tüm mikroskobu dikkatlice döndürün ve mikroskobu yerine sabitlemek için kelepçeyi kullanın. Gal O ve lazeri buraya yeniden bağlayın ve gal O'yu sıfır volta döndürmeyi unutmayın. Daha önce dikey olan kurulumun geri kalanı, düz breadboard üzerinde kolayca gerçekleştirilebilir.

Ardından, resmi olarak tarama lensi ve tüp lensi olarak adlandırılan ikinci röle lensi setini kuracağız. Doğru lens kombinasyonunu seçme konusunda çok önemli bilgiler için lütfen ekteki yazılı protokole bakın. Lensleri ayarlayarak başlayın.

İlk olarak, ışını objektif merceğe yönlendirmek için gereken aynaları yerleştirin. İlk büyük iki inçlik aynayı devre tahtasının kenarına yakın bir yere yerleştirin ve lazer ışınını yaklaşık 90 derece kabaca yansıtacak şekilde ayna montajını döndürün. Aynı dikey ışın yüksekliğini korumak için aynadan yansımayı ayarlayın.

Ardından, kirişi 90 derecelik bir açıyla yönlendirmek için diğer iki inçlik aynayı devre tahtasının karşı kenarına yerleştirin ve yerine sabitlemek için ayar vidalarını kullanın. Ardından, iki süsen ayarlayın ve ışını ortalamak için iki aynayı daha önce olduğu gibi ayarlayın. Ardından tarama merceğini, ışın yolundaki galden odak uzaklığına yerleştirin ve yatay ve dikey konumunu ayarlayın.

Lazer noktasını iki ayna arasındaki ilk iris üzerinde ortalamak için. Büyük iki inçlik tüp lensi tarama merceğinden uygun mesafeye dikkatlice yerleştirin ve ışını ilk iris üzerinde ortalamak için yatay ve dikey konumunu ayarlayın. Bu kurulumda, tüp lens tüm bileşenler yerindeyken 75 milimetre artı 300 milimetre mesafeye yerleştirilir.

Gal O'yu standart bir elektrik fonksiyon üretecinin veya kontrol devresinin çıkışına takın ve tepeden tepeye voltajları bir ila üç volta ayarlayın. Ardından bir kartvizit kullanarak iki aynayı taramaya başlayın. Lazer ışınını, tüp merceğinden 300 milimetre sonra, sabit düzlemde bulun.

Objektif merceğini ışın yoluna yerleştirin ve objektif merceğinin arka diyafram açıklığını sabit düzleme mümkün olduğunca yakın konumlandırdığınızdan emin olun. Çevrilebilir Z ekseni montajının, menzili boyunca çevrilirken objektif lens montajına çarpmadığından emin olarak örnekleme aşamasını ayarlayın. Konfokal, iğne deliği ve dedektörü kurmak için tüm güç kaynaklarının ve fiber optiklerin bağlantısını keserek başlayın.

Mikroskop düzeneğini, rezonans tarama aynasını tutarak tekrar devre tahtası üzerinde duracak şekilde döndürün. Fiberi kolimatöre ve standart tarama aynasına, güç, besleme ve kontrol kablolarına yeniden bağladıktan sonra, standart tarama galini daha önce olduğu gibi sahneye sürerek kontrol voltajına sıfır volt yerleştirin, iki kapak fişi arasına parlak bir boya sandviç örneği yerleştirin. Ardından lazer kaynağını açın ve boyayı odak noktasına getirin.

Bir kartvizit kullanarak floresansı olabildiğince parlak hale getirmek için lazer gücünü ayarlayın. Numuneden gelen floresan emisyonunu, tarama sistemi aracılığıyla objektif mercek aracılığıyla, lazer ışınını yansıtan ve floresan emisyonunu iletecek olan dikroik aynaya kadar izleyin. Bu floresan sinyali dikroik aynanın diğer tarafında bulun.

Şimdi oda ışıklarını kısın. Emisyonu 90 derecelik bir açıyla yansıtmak için dikroik aynanın arkasına bir ayna yerleştirin. Daha sonra aynalı bir iris kullanarak, floresan ışınını mümkün olduğunca düz ve paralel olarak devre tahtasına yönlendirin.

Daha sonra, konfokal iğne deliği ünitesi, Thor Labs'ın uzamsal filtre kafesi montaj düzeneği kullanılarak kurulacaktır. Bu diyagramda kurulum özetlenmektedir. Tarama aynası, sabit bir objektife sahip tele olan sabit düzlemlerde oturur.

Sabit düzlemler arasındaki merceklerin arka açıklık düzlemi çiftleri, taranan ışınları iletmek için hareket eder. İlk lens çifti, bire bir teleskop oluşturan eşit odaklı lense sahiptir. Resmi olarak tarama merceği ve tüp merceği olarak bilinen ikinci mercek çiftinin eşit ve odak uzaklığına sahip olması gerekmez ve genellikle objektif arka açıklığın aşırı doldurulmasını sağlamak için ışın genişleten bir teleskop görevi görür.

Numuneden yayılan ışık, tarama sisteminden geri döner ve dikroik aynadan geçirilir. Kısa odaklı bir lens veya bir objektif lens, emisyon ışığını konfokal iğne deliğinden odaklar ve bu daha sonra bir lens tarafından harmanlanır. Son bir lens, konfokal filtrelenmiş emisyonu bir foto çarpan tüpüne odaklar.

Uzamsal filtre ünitesini, ilk odaklama lensi yuvasını emisyon huzmesi üzerinde ortalamaya dikkat ederek emisyon huzmesi yolu ile aynı hizaya getirin. Bu örnekte, iğne deliği boyutu 100 mikron olan bir uzamsal filtre ünitesi seçilmiştir. Ardından, üniteye kısa bir odak uzaklığına sahip lens takın ve iğne deliği yüzeyinde net bir odak gözlemlenene kadar Z çeviri yuvasını kaydırın.

Tüm ünitenin floresan ışın tarafından ayarlanan düz çizgi boyunca yönlendirildiğinden emin olun. Üniteyi devre tahtasına sıkıştırın. Şimdi çeviri aşamasındaki ayar düğmelerini kullanarak, iğne deliğinden geçen floresan sinyalin maksimize edildiği noktayı bulmak için iğne deliği montaj yüzeyi üzerinde 2D arama yapmak için iki ekseni ayarlayın.

Ardından, kaplama merceğini kafes yuvasına yerleştirin Bir kartvizit kullanarak iğne deliğinden sonra, konfokal üniteden geçen floresan iyonu bulun ve yayılan floresan mümkün olduğunca harmanlanana kadar kaplama merceğini direkler boyunca kaydırın. Fotoğraf çarpanı tüp düzeneğini ayarlayın. Floresan emisyon huzmesi yoluna 50 milimetre odak uzaklığına sahip bir lens yerleştirin ve odak noktasını bulun.

Bu konumu devre tahtasında işaretleyin. Şimdi lazeri tamamen kapatın ve fotoğraf çarpan tüpünü, penceresi işaretli odak noktasına mümkün olduğunca yakın olacak şekilde konumlandırın. Ardından ayarlanabilir lens tüpleri kullanarak düzeneği odaklama merceğine bağlayın.

İğne deliğini takip eden açıkta kalan tüm ışın yollarının etrafına koyu bant sarın, lazeri açın ve gücünü son derece düşük tutun. Osiloskop üzerindeki voltajını dikkatlice okuyarak fotoçoğaltıcı tüpü açın. Lazer yoğunluğu arttıkça, osiloskop ekranında okuma ve/veya DC ofseti gibi bir ani yükselme görülene kadar voltajı artırın.

Sinyal kaybını gözlemlemek için lazer gücünü kapatarak veya ışın yolunu bloke ederek bu sinyalin gerçekten floresandan kaynaklandığını onaylayın. Son olarak, osiloskopta maksimum sinyal için iğne deliğini yinelemeli olarak hizalayın. Önce odaklama lensi Z konumunu manipüle ederek ve ardından YZ çeviri aşamasını ayarlayarak, video hızı mikroskobu donanımı tamamlanır.

İlk olarak, fotoğraf çarpan tüpünü kapatın. Şimdi aynaları, özel kontrol panolarını ve bilgisayarı ekteki yazılı protokolde belirtildiği gibi bağlayın. Bu sistem konfokal taramalı mikro endoskopi yapmak için uyarlanabilir.

Sahneyi bir fiber tutma aşaması ile değiştirerek, lütfen ekteki metne veya ayrıntılara bakın. Bitmiş dik konfokal tarama mikroskobu ve mikro endoskop burada gösterildiği gibi görünmelidir. Lazer ve emisyon ışınları göze kılavuz olarak çizilmiştir.

Mikro endoskopi işlemi sırasında, bir fiber montajı, deneyler için görüntü fiberini yerinde tutar. Bu fiber montaj, kullanımlar için kolayca bir XY aşaması ile değiştirilebilir. Burada gösterilen dik bir mikroskop platformu, gelen sinyalden görüntüler oluşturmak için bir video hızı kare yakalayıcı kartı kullanılarak beyaz bir kartvizit üzerine basılmış küçük harfli bir M'nin alınan temsili bir test görüntüsüdür. Ağartılmış.

Beyaz kağıt, UV ve mavi ışıkla kolayca uyarılan ve karanlığın arkasındaki parlak arka plana neden olan Fluor kuvveti içerir. Bu floresan emisyonu toplamak için M harfi ve 515 nanometre merkezli emisyon filtresi seçildi. Görüntüde küçük bir bozulma, özellikle görüntü çerçevesinin yan kenarlarının yakınında görülebilir.

Bu bozulma, sekiz kilohertz gvo aynasının sinüzoidal tarama modelinden kaynaklanır ve ekteki belgede ayrıntılı olarak tartışılmaktadır. Bu filmde, bir kartvizitin taranmasıyla elde edilen örnek video hızı verileri gösterilmektedir. Bu videoyu izledikten sonra, artık bir video hızlı konfokal tarama mikroskobunun nasıl oluşturulacağını ve hizalanacağını iyi anlamış olmalısınız.

Lazer ışığı ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman tüm yansıtıcı takıların çıkarılması ve ışın hattı ile göz hizanızda çalışmaktan kaçınılması gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.