Kan örneklerinden Bakteriyel Patojen Algılama ve Antimikrobiyal Direnç Testi için bir günlük iş akışı şeması

Bu prosedürün genel amacı, kan kültürü izolatlarının antibiyotik duyarlılığını konvansiyonel yöntemlerden daha kısa sürede belirlemek ve değerlendirmektir. Bu işlem, öncelikle kan kültürü izolatının yeni bir 16 s ribozomal DNA MultiPro PCR testi kullanılarak tanımlanmasıyla gerçekleştirilir.

Ardından izolat, bir dizi antibiyotik ile altı saat boyunca inkübe edilir. Bir sonraki adım, kantitatif 16 s ribosomal D-N-A-P-C-R testi kullanarak, antibiyotiğin varlığında izolatın büyümesini veya büyüme inhibisyonunu belirlemektir. Sonuç olarak, kan kültürü izolatının tanımlanmasının ve antibiyotik duyarlılık testinin, kültür ve PCR kombinasyonu aracılığıyla daha hızlı bir şekilde elde edilebileceği görülmektedir.

Bu tekniğin, otomatik phoenix veya IIC sistemleri kullananlar gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, önceden herhangi bir kültürleme durumu gerektirmemesi ve tanımlama ile antibiyotik duyarlılık testi sonuçlarının aynı gün içinde alınabilmesidir. Prosedürü laboratuvarımızdan doktora öğrencileri Vandy Hanson ve GID ing gerçekleştirecektir. Mikrobiyal büyüme açısından pozitif olan 100 µL kan kültürünü, 900 µL %0.9 sodyum klorür içeren bir reaksiyon tüpünde seyreltin. Ardından, bakterileri çöktürmek için örneği 13.400 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Reese, peleti 100 µL steril demiyeeralize su içinde süspande et. Örneği, tekrar kullanana kadar 4 °C'de sakla. Tüm örnekler hazır olduğunda, hedeflenen bakterilerin spesifik 16 s ribozomal DNA'sını amplifiye etmek için gerçek zamanlı PCR reaksiyon karışımlarını hazırla.

Hacimleri reaksiyon başına 20 µL'ye ayarlamak için demiyeralize su kullanın. 96 kuyucuklu bir PCR plakasına kuyucuk başına 20 µL PCR karışımı paylaştırın. Ardından her kuyucuğa beş µL numune ekleyin ve PCR plakasını kapatın.

Ardından, sonuçları analiz etmek için PCR'ı A BI Prism 7, 900 HT gerçek zamanlı PCR sisteminde çalıştırın; PCR tamamlandığında, önce analiz ayarları sekmesini kullanarak CT analizini 0.1 olarak ayarlayın. Daha sonra taban çizgisi konfigürasyonlarını altıncı döngüde başlayacak ve 15. döngüde bitecek şekilde daraltın. Her örnek için CT değerini kaydedin.

Bir PCR sonucunun pozitif kabul edilmesi için eşik değer genellikle 35 CT değeri olarak belirlenebilir. Bu örnekte, e coli ile enfekte olmuş bir kan kültürünün tanımlama profili iki reaksiyon karışımında gösterilmiştir. Universal 16 s ribozomal DNA primerleri eklenmiş ve 25.2 ve 25.95 CT değerlerinde iki amplifikasyon eğrisi oluşturulmuştur.

Üçüncü amplifikasyon eğrisi, Coli için spesifik olan probdan elde edilmiştir. Diğer spesifik problar tespit edilebilir sinyaller üretmemiştir. Patojen tanımlandıktan sonra antibiyotik testi gerçekleştirilebilir.

Pozitif bir kan kültüründen beş mililitre besiyerini bir serum ayırıcı tüpe aktararak başlayın. Örneği 2000 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin; santrifüj işleminin ardından tüpteki üst fazı boşaltın. Daha sonra, steril bir pamuklu sürücü yardımıyla, tüpün jel tabakasındaki bakterileri, 0.5 McFarland standardı bulanıklığında bir çözelti elde edilene kadar %0.9 sodyum klorür içerisine aktarın.

Bu, mililitre başına yaklaşık 1,5 × 10⁸ koloni oluşturan birime karşılık gelir. Ardından, yaklaşık 5 × 10⁵ koloni oluşturan birim/ml konsantrasyon elde etmek için süspansiyonu çift konsantrasyonlu Muller Hinton Besiyeri ile seyreltin.

Halihazırda her kuyucuğunda 50 µL seçilmiş antibiyotik içeren bir mikrotiter plakaya, her kuyucuğa 50 µL süspansiyon ekleyin. Antibiyotikler yerine su içeren kuyucuklar kullanarak her örnek için pozitif büyüme kontrolleri eklediğinizden emin olun. İşlem tamamlandığında plağın üzerini kapatın.

Ardından, bakteriyel büyümenin gerçekleşmesi için plakayı 37 °C'de altı saat boyunca inkübe edin. Negatif büyüme kontrolü olarak bakteriyel süspansiyondan bir alikotu 4 °C'de sakladığınızdan emin olun. Altı saatlik inkübasyonun ardından, her kuyucuğun içeriğini ve negatif kontrol örneğini ayrı steril tüplere aktarın.

16,000 ×g'de beş dakikalık santrifüj işleminin ardından, 80 µL süpernatan alın ve peletleri 80 µL steril demiyeralize su içerisinde yeniden süspanse edin. Örnekleri, 16s ribozomal DNA gerçek zamanlı PCR'da kullanmadan önce su ile 1:10 oranında seyreltin.

IQ cyber green super mix ve 16 s ribozomal DNA primerlerini kullanarak PCR karışımını hazırlayın ve 96 kuyucuklu bir PCR plakasındaki her kuyucuğa 20 µL şeklinde paylaştırın. Ardından, her kuyucuğa her örneğin 5 µL'sini ekleyin ve plakayı kapatın.

Ardından, sonuçları analiz etmek için PCR'ı çalıştırın. Öncelikle, eşik CT değerini hesaplayın. Genel olarak eşik CT, pozitif büyüme kontrolünün CT değerine, negatif büyüme kontrolünün CT değerinin 0,5 katı eklenip büyüme kontrolünün CT değeri çıkarılarak hesaplanır.

Bununla birlikte, gram-negatif basillerde piperasilin-tazobaktam ve seftazidim için olduğu gibi, Staphylococcus aureus'ta amoksisilin, oksasilin ve trimetoprim-sülfametoksazol için veya Enterococcus spp.'de amoksisilin için 0,5 olan çarpım faktörü 0,25'e düşürülmelidir. Her bir örnekteki suşların duyarlılığı veya direnci, örneğin CT değeri ile eşik ct değeri karşılaştırılarak belirlenebilir.

Eşik değerinin üzerindeki bir CT değeri duyarlılığı, eşik değerinin altındaki bir CT değeri ise direnci gösterir. Burada, bir antibiyotik duyarlılığı amplifikasyon grafiği örneği verilmiştir. Daha önce tanımlanan E. coli suşu, her biri ayrı bir eğri ile temsil edilen birkaç farklı antibiyotiğe karşı duyarlılık açısından test edilmiştir.

Düşük CT değerine sahip örnekler, test edilen antibiyotiğe direnç olduğunu gösteren, antibiyotik varlığında büyümenin gerçekleştiği örneklerdir. Aksine, yüksek bir CT değeri, test edilen antibiyotiğe duyarlılık olduğunu gösteren, büyümenin gerçekleşmediği bir örneği temsil eder. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, uygun şekilde yürütüldüğü takdirde işlem dokuz saat içinde tamamlanabilir.