Name: Kan örneklerinden Bakteriyel Patojen Algılama ve Antimikrobiyal Direnç Testi için bir günlük iş akışı şeması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Öğrenin, kan kültürü izolatlarındaki bakteriyel patojenleri ve antibiyotik duyarlılıklarını hızlıca belirlemek için PCR tabanlı tanı yöntemini. Bu teknik, aynı gün içinde sonuç vererek klinik kararları hızlandırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Profileringsfonds Azm (PF245) tarafından desteklenmiştir.

BÖLÜM I: Patojen TANIMLANMASI 1. Numune Hazırlama Not: aşağıdaki protokol açıklandığı gibi tüm moleküler iş akışı moleküler tanı kalite güvencesi 3 önerileri doğrultusunda yapılmalıdır. <ol><li> A 1:10 seyreltilmiş örnek olmak için 1.5 ml'lik tepkime tüp içine% 0.9 NaCl 0.9 ml kan bir kültür 0.1 ml bir örnek ekleyin. (Seyreltilir qPCR inhibisyonu önlemek için). </li><li> Pelet 5 dk bakteriyel DNA 13400 xg'de örnek santrifüjleyin. </li><li> 100 ul steril demineralize H 2 O bakteri pelletini </li><li> 4 ° C ye kadar daha fazla kullanımda DNA örneği saklayın. </li></ol> 2. Tanımlama Testi: Real-time PCR 16s rDNA <ol><li> Aşağıdaki gibi reaksiyon karışımı hazırlayın. Assay numune başına dört ayrı reaksiyonlar meydana gelir. Her karışım 12.50 ul ana içerirkarışım, 0.9 uM ileri astar (5-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3) 7, 0.6 uM ters astar (5-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3) 8 ve probları bir panel. Prob miktarı aşağıda yer alan dört ayrı reaksiyonların her biri için verilmiştir. </li><li> İlk tepki içerir: <ul><li> 0.2 uM evrensel bir sonda (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1) 8 </li><li> 0.2 uM P. aeruginosa prob (5-JOE-CCAAAACTACTGAGCTAGAGTACG-3-BHQ1) </li></ul></li><li> İkinci reaksiyon içerir: <ul><li> 0.2 uM E. coli prob (5-JOE-GGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATT-3-BHQ1) </li><li> 0.2 uM Pseudomonas spp. Sondaya (5-NED-CCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTT-3-MGBNFQ) </li></ul></li><li> Üçüncü reaksiyonu içerir: <ul><li> 0.2 uM Staphylococcus spp. Sondaya (5-NED-AATCTTCCGCAATGGGCGAAAGC-3-MGBNFQ) </li><li> 0.2 uM S. aureus prob (5-FAM-AGATGTGCACAGTTACTTACACATAT-3-BHQ1) </li><li> 0.2 uM Enterococcus spp. (5-JOE-TCCTTGTTCTTCTCTAACAACAGAG-3-BHQ1) </li></ul></li><li> Dördüncü reaksiyonu içerir: <ul><li> 0.2 uM evrensel bir sonda (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1) </li><li> 0.3 uM Streptococcus spp. Sondaya (5-NED-CCAGAAAGGGACSGCTAACT-3-MGBNFQ) </li><li> 0.2 uM S. pneumoniae prob (5-JOE-CCAAAGCCTACTATGGTTAAGCCA-3-BHQ1) </li></ul></li><li> 20 ul toplam hacimde ulaşmak için steril demineralize H2O ekleyin. Bir 96-kuyulu plakanın PCR kuyucuklara Her reaksiyon karışımı 20 ul ekleyin. </li><li> Her bir kuyucuğa örnek 5 ul ekleyin. </li><li> 96-PCR plakanın damgalanması yapışkan film kullanın. </li><li> Aşağıdaki en iyi termal siklus koşullarını kullanarak ABI PRISM 7900HT Real Time PCR Sistemi plaka çalıştırın: <ul><li> 10 dakika süre ile 50 ° C de ön-ısıtma </li><li> 15 dakika boyunca 95 ° C'de ön denatürasyon </li><li> 42 döngü <ul type="circle"><li> 15 sn 95 ° C 'de denatürasyon </li><li> 1 dakika boyunca 60 ° C'da tavlama </li></ul></li></ul></li></ol> 3. Sonuçların Analizi <ol><li> Sekmesi Analiz Ayarlar 0.1 Ct Analiz eşiği ayarlayın. 6 ve End (Cycle): 15 Başlat temel yapılandırmaları (Cycle) daraltın. </li><li> Tüm numuneler için döngüsü eşiği (Ct) değerini kaydedin. Pozitif bir PCR sonucu dikkate cut-off değeri 35 bir Ct-değere ayarlanabilir. Kan kültürlerinde mevcut bakteri miktarı Ct-değerleri 35 altında üreten, 10 7 10 11 CFU / ml arasında değişmekteydi. </li></ol> BÖLÜM II: ANTİBİYOTİK DUYARLILIK TESTİ 4. Pozitif Kan Kültürleri 9 Bakteri İzolasyonu <ol><li> Pozitif kan kültürü şişe suyu 5 ml aspire ve serum ayırıcı tüpüne aktarın. </li><li> 10 dakika boyunca 2000 x g'de santrifüje serum ayrıştırıcı tüp. </li><li> Serum ayırıcı tüpten atılır. </li><li> Transferi bacTeria steril pamuklu ile tüp jel tabakası den% 0.9 'luk tuzlu su içine bir 0,5 McFarland standart bir süspansiyon elde edilinceye kadar. </li></ol> 5.. Mikro Titre Tabaklar Aşılanması <ol><li> 5 x 10 5 CFU / ml 'lik bir süspansiyon oluşturmak üzere çift konsantre Mueller Hinton II çorbasındaki 0,5 McFarland süspansiyonu ile seyreltilir. </li><li> Antibiyotikler (Tablo 1) bir seçim içeren bir mikro titre plakanın kuyularına Bu süspansiyon ekleyin. </li><li> 6 saat süreyle 37 ° C 'de mikro titre plakası inkübe. </li><li> 4 ° C (negatif büyüme kontrolü gibi) de süspansiyon bir kısım saklayın. </li><li> İnkübasyonun 6 saat sonra, steril bir tüp içinde, her sıra bir içerik transfer gibi olumsuz büyümesini kontrol örneği 4 ° C de muhafaza edildi olduğu </li><li> 5 dakika boyunca 16.000 g'de santrifüje borular. </li><li> Dikkatle bakteriyel pelet bozmadan, süpernatant kaldırın. </li><li> Steril demineralize H pelletini <li> Steril demineralize H 2 O 10 kat örnekleri sulandırınız </li></li></ol> 6. Real-time PCR 16'lar rDNA 10 <ol><li> Aşağıdaki gibi PCR karışımı hazırlandı: <ul><li> 12.50 ul iQ SYBR Green Supermix </li><li> İleri 0,5 uM astar 16S-1 (5-TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3) 11 </li><li> 0.25 uM ters primer 16S-2 (5-TACCGCGGCTGCTGGCAC-3) 11 </li><li> 20 ul toplam hacme steril demineralize H2O </li></ul></li><li> Bir 96-kuyulu plakanın PCR kuyucuklara PCR karışımı 20 ul ekleyin. </li><li> Her bir kuyucuğa örnek 5 ul ekleyin. </li><li> 96-PCR plakanın damgalanması yapışkan film kullanın. </li><li> Aşağıdaki optimum ısı bisiklet şartları kullanarak, MyiQ Tek Renk Real-Time PCR Algılama Sistemi plaka çalıştırın: <ul><li> 4 dakika boyunca 95 ° C'de ön denatürasyon </li><li> İlk ° C'de 30 saniye 65 tavlama </li><li> 35 döngü <ul><li> 9 denatürasyon15 sn için 5 ° C </li><li> 1 dakika boyunca 60 ° C'da tavlama </li></ul></li><li> (° C 0.57 ° C lik artışlarla birlikte 20 dakika içinde 60-95 arası) eğrisi analizi eritin </li></ul></li></ol> 7. Sonuçların Analizi <ol><li> Aşağıdaki formül (antibiyotik türüne bağlı olarak) birini kullanarak kesme Ct değeri hesaplanır. <ul><li> Genel olarak: Cut-off Ct değeri = Ct değeri pozitif büyüme kontrolü + 0.5 x (Ct değeri negatif büyüme kontrolü - Ct değeri pozitif büyüme kontrolü) </li><li> Piperasilin, piperasilin / tazobaktam ve Gram-negatif çubuklar seftazidim; Amoksisilin, oksasilin ve trimetoprim / sulfametoksazol S.aureus, Enterococcus spp Amoksisilin:. Cut-off Ct değeri = Ct değeri pozitif büyüme kontrolü + 0.25 x (Ct değeri negatif büyüme kontrolü - Ct değeri pozitif büyüme kontrolü) </li></ul></li><li> Pozitif büyüme kontrol olarak steril demineralize H 2 O ile inkübe örnek kullanın.</li><li> Mikroorganizma bağlı olarak, uygun negatif büyüme kontrolü kullanın: <ul><li> Gram-negatif çubukları örnek antibiyotik karışımı ile inkübe </li><li> Enterococcus spp. Örnek 4 ° C'de saklandı </li><li> S.aureus Örnek 4 ° C'de saklandı </li></ul></li><li> Duyarlılığı (S) ya da aşağıdaki gibi test antibiyotik için suşunun direnç (R) belirleyin: <ul><li> Cut-off Ct değeri daha yüksek bir Ct değeri duyarlılık gösterir </li><li> Cut-off Ct değeri daha düşük bir Ct değeri direnç gösterir </li></ul></li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar İki model organizmalar, Gram-negatif E. yani coli ve Gram-pozitif S. aureus, bakteriyel patojenler ve bunların antimikrobiyal profilinin belirlenmesi algılama ve tanımlama için kombine prosedür görselleştirmek için seçilir. Protokolünün birinci bölümü patojen bir tanıtımım içerir. Specific probları sekiz klinik mikroorganizmaların saptanması için tasarlanmıştır. Bakteriyel paneli dahil bir hedef varlığında, amplifikasyon eğrileri olarak oluşturulur ve Ct değerleri (Şekil 2) hesaplanır. Pozitif bir PCR sonucu dikkate cut-off değeri 35 bir Ct değeri ayarlanır. Şekil 2A, bir E.coli-enfekte kan kültür tanımlama profili gösterilmiştir. 16S evrensel prob iki ayrı reaksiyon karışımlarının içerdiği ve dolayısıyla iki amplifikasyon eğrileri (25.20 ve 25.95 Ct) üretir. Üçüncü sinyal E. için belirli bir prob türetilmiştir coli (27.04 Ct). Bir S. tanımlama aureus-enfekte kan kültürü Şekil 2B 'de gösterilmiştir. 16S evrensel prob 33.35 ve 33.71 amplifikasyonu sinyalleri vardır. Kalan iki sinyalleri Staphylococcus spp için özel problar türetilmiştir. ve S. aureus (32.48 ve 30.59 Ct). Şekil 3 de gösterilmiştir E.coli strain temsil eden bir antibiyotik duyarlılık testi amplifikasyon plot, örnek olarak Şekil 2A. Her bir hat bakteriyel örnek ile inkübe edildi olduğu bir antibiyotik temsil eder. Düşük bir Ct değeri ile bir örnek büyüme test antibiyotik için bir antibiyotik, direnç gösteren varlığında oluştu olduğu bir örnektir. Tersine, bir yüksek CT değeri, herhangi bir gelişme, çünkü test antibiyotiğe antibiyotik, hassasiyet gösteren etkili bir çalışma ile meydana gelmiş olan bir örneği gösterir. Tablo 1, E. antimikrobiyal profilini gösterir belirlenmesi coli ve S. aureus izolatlarının. Tüm Ct değerlerini bildirdi ve protokol metni (7.1) 'de belirtilen formülleri kullanarak, iki kesme Ct değerlerini hesaplanan vardır edilirdirenç ve duyarlılık ayırt yonunun. Bildirilen CT değeri hesaplanmıştır cut-off CT değeri (ya da tam tersi) 'den daha düşük olması durumunda deformasyon antibiyotiğe dirençli. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3254/3254fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> RDNA PCR gerçek zamanlı 16S kullanarak patojen tanımlanması ve antibiyotik duyarlılık testi prosedürü Şekil 1. Akış çizelgesi. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3254/3254fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 Tanımlama testi:. Amplifikasyon araziler ve döngüsü eşik değerleri (Ct değerleri) spesifik problar nedensel patojenin tanımlanması için kullanılan ise pozitif kan kültürü, evrensel 16S rDNA sensörü tarafından algılanır.. Kan kültürü A. amplifikasyonu arsa E. içeren coli, S. içeren kan kültüründe B. amplifikasyonu arsa aureus; Pseu ae, Pseudomonaeruginosa gibi; uni, 16S evrensel probu; ecoli, Escherichia coli probu; Pseu sp, Pseudomonas spp. probu; S. pneumoniae, Streptococcus pneumoniae probu; Strep sp, Streptococcus spp. probu; Entero, Enterococcus spp. probu; S. aureus, Staphylococcus aureus probu; Staph sp, Staphylococcus spp. prob. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3254/3254fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Bir E. antibiyotik duyarlılık testi Şekil 3. Amplifikasyon arsa coli (örnek 1) izole eder. Her eğrisi şekil değiştirme ile inkübe edildi olduğu bir antibiyotik temsil eder. Erken bir sinyal suşu test antibiyotik varlığında büyümüş ve antibiyotiğe dirençli ve böylece anlamına gelir yüksek bir bakteri yükü, kaynaklanır. Geç sinyalleri suşu antibiyotik varlığında yetiştirilen olmadığını göstermektedir, diğer bir deyişle, bu hassastır. <table border="1"><tbody><td> Örnek 1: E. coli </td><td></td><td></td><td> Örnek 2: S. aureus </td><td></td><td></td><tr><td> AST </td><td> Ct </td><td> R / S </td><td> AST </td><td> Ct </td><td> R / S </td></tr><tr><td> Amoksisilin 8 mg / L </td><td> 16,83 </td><td> R </td><td> Amoksisilin 0.25 mg / L </td><td> 21,03 </td><td> R </td></tr><tr><td> Amoksisilin-klavulanat 8/4 mg / L </td><td> 17,36 </td><td> R </td><td> Oksasilin 2 mg / L </td><td> 25,80 </td><td> S </td></tr><tr><td> Piperasilin 16 mg / L </td><td> 16,67 </td><td> R </td><td> Vankomisin 2 mg / L </td><td> 25,20 </td><td> S </td></tr><tr><td> Piperasilin-tazobaktama 16 /4 mg / L </td><td> 24,15 </td><td> S </td><td> Gentamisin 4 mg / L </td><td> 25,86 </td><td> S </td></tr><tr><td> Ciprofloxacin 1 mg / L </td><td> 29,72 </td><td> S </td><td> Trimetoprim-sulfametoksazol 2/38 mg / L </td><td> 24,62 </td><td> S </td></tr><tr><td> Seftazidim 1 mg / L </td><td> 24,03 </td><td> S </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Seftazidim 8 mg / L </td><td> 26,58 </td><td> S </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gentamisin 4 mg / L </td><td> 29,83 </td><td> S </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Trimetoprim-sulfametoksazol 2/38 mg / L </td><td> 27,60 </td><td> S </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Negatif büyüme kontrolü (antibiyotik karışımı) </td><td> 30,41 </td><td></td><td> Negatif büyüme kontrolü (örnek 4 ° C'de saklanır) </td><td> 27,42 </td><td></td></tr><tr><td> Pozitif büyüme kontrolü </td><td> 16,90 </td><td></td><td> Pozitif büyüme kontrolü </td><td> 20,22 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cut-off Ct-değeri 1 * </td><td> 21,76 </td><td></td><td> Cut-off Ct-değeri 1 *** </td><td> 23,82 </td><td></td></tr><tr><td> Cut-off değeri Ct-2 ** </td><td> 18,75 </td><td></td><td> Cut-off Ct-değeri 2 **** </td><td> 22,02 </td><td></td></tr><tr><td> * Amoksisilin, amoksisilin-klavulanat, siprofloksasin, gentamic içintrimetoprim-sulfametoksazol, içinde ** Piperasilin, piperasilin-tazobaktama, seftazidim için </td><td></td><td></td><td> Vankomisin ve gentamisin için *** **** Amoksisilin, oksasilin ve trimetoprim-sulfametoksazol için </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1. İki örnek (E.coli ve S.aureus) antibiyotik duyarlılık testi belirlenmesi. PCR testinin Ct değerleri otomatik olarak protokol metninde gösterilen formüller kullanılarak, pozitif ve negatif büyüme kontrolü gelen iki kesim Ct alues ​​hesaplar hangi olarak, bu excel dosyası kopyalandı. Bir antibiyotik cut-off Ct değerinden daha düşük bir değere Ct gösterirse CT değeri cut-off 'den daha yüksek ise, suşu, antibiyotiğe dirençli, strain hassastır.

<ol><li>Wallet, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preliminary+clinical+study+using+a+multiplex+real-time+PCR+test+for+the+detection+of+bacterial+and+fungal+DNA+directly+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Infect%22%5BJournal%5D)">Preliminary clinical study using a multiplex real-time PCR test for the detection of bacterial and fungal DNA directly in blood.</a> Clin. Microbiol. Infect. 16, 774(2010).</li>
<li>Beekmann, S. E., Diekema, D. J., Chapin, K. C., Doern, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+rapid+detection+of+bloodstream+infections+on+length+of+hospitalization+and+hospital+charges%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Effects of rapid detection of bloodstream infections on length of hospitalization and hospital charges.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 3119(2003).</li>
<li>Raymaekers, M., Bakkus, M., Boone, E., de Rijke, B., Housni, H. E. l, Descheemaeker, P., De Schouwer, P., Franke, S., Hillen, F., Nollet, F., Soetens, O., Vankeerberghen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Diagnostics+working+group.+Reflections+and+proposals+to+assure+quality+in+molecular+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Clin.+Belg%22%5BJournal%5D)">Molecular Diagnostics working group. Reflections and proposals to assure quality in molecular diagnostics.</a> Acta. Clin. Belg. 66, 33(2011).</li>
<li>Peters, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+developments+in+the+diagnosis+of+bloodstream+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">New developments in the diagnosis of bloodstream infections.</a> Lancet Infect. Dis. 4, 751(2004).</li>
<li>Hansen, W. L., Beuving, J., Bruggeman, C. A., Wolffs, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+probes+for+the+diagnosis+of+clinically+relevant+bacterial+infections+in+blood+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular probes for the diagnosis of clinically relevant bacterial infections in blood cultures.</a> J. Clin. Microbiol. 48, 4432-4432 (2010).</li>
<li>Beuving, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+susceptibility+testing+of+grown+blood+cultures+by+combining+culture+and+real-time+polymerase+chain+reaction+is+rapid+and+effective%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Antibiotic susceptibility testing of grown blood cultures by combining culture and real-time polymerase chain reaction is rapid and effective.</a> PLoS ONE. 6, (2011).</li>
<li>Rolain, J. M., Mallet, M. N., Fournier, P. E., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+for+universal+antibiotic+susceptibility+testing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR for universal antibiotic susceptibility testing.</a> J. Antimicrob. Chemother. 54, 538(2004).</li>
<li>Nadkarni, M. A., Martin, F. E., Jacques, N. A., Hunter, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+bacterial+load+by+real-time+PCR+using+a+broad-range+%28universal%29+probe+and+primers+set%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol%22%5BJournal%5D)">Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad-range (universal) probe and primers set.</a> Microbiol. 148, 257(2002).</li>
<li>Waites, K. B., Brookings, E. S., Moser, S. A., Zimmer, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+susceptibility+testing+with+positive+BacT%2FAlert+blood+cultures+by+using+MicroScan+overnight+and+rapid+panels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Direct susceptibility testing with positive BacT/Alert blood cultures by using MicroScan overnight and rapid panels.</a> J. Clin. Microbiol. 36, 2052( ).</li>
<li>Vliegen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+bacteria+by+real-time+amplification+and+sequencing+of+the+16S+rRNA+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of bacteria by real-time amplification and sequencing of the 16S rRNA gene.</a> J. Microbiol. Meth. 66, 156(2006).</li>
<li>Hall, L., Doerr, K. A., Wohlfiel, S. L., Roberts, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+MicroSeq+system+for+identification+of+mycobacteria+by+16S+ribosomal+DNA+sequencing+and+its+integration+into+a+routine+clinical+mycobacteriology+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the MicroSeq system for identification of mycobacteria by 16S ribosomal DNA sequencing and its integration into a routine clinical mycobacteriology laboratory.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 1447(2003).</li>
</ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Burada açıklanan protokol patojenlerin hızlı bir şekilde tespit sağlar ve böylece kan akımı enfeksiyonu olan hastaların prognozu iyileştirmek yeterli antibiyotik erken verilmesinin yol açabilecek fonksiyonel bir antimikrobiyal profili sunmaktadır. Bir test talep koşullarına bağlı olarak, az yani düşük maliyet, yüksek verim, geri-dönüş süresi, test koşulları ayarlanabilir. Tüm bu işlemleri bir iş günü içinde yapılabilir. Dahası, protokol, iki parça önemli ölçüde dönüş süresine azaltır, eş zamanlı olarak gerçekleştirilebilmektedir. Burada sunulan gibi, tanımlama paneli hastanemizde klinik olarak en uygun bakteri bir seçimdir. Temel ilkesi 16S geninin hedef bölgede olduğundan, diğer mikroorganizmalar için özel olarak tasarlanmış probları ile tahlil eklenebilir. Tüm deney başlangıçta kan kültürlerinin hızlı analiz için amaçlanmıştır, fakat, aynı zamanda o işlenmesi için de kullanılabilirtermal örnek malzemeleri. Bu aynı zamanda antibiyotik duyarlılık testi için kullanılan antibiyotikler için böyledir: Daha fazla veya diğer antibiyotikleri yerel direniş kalıpları ve yönergelere göre eklenebilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Sodyum Klorür (NaCI) </td><td> Merck Kimyasallar </td><td> 106404 </td><td> Su içinde% 0.9 </td></tr><tr><td> Vacutainer SST Serum ayrıştırıcı tüp 5 ml </td><td> BD Diagnostic Systems </td><td> 367986 </td><td></td></tr><tr><td> Mueller Hinton II broth </td><td> BD Diagnostic Dystems </td><td> 212322 </td><td> 44 g / L su içinde </td></tr><tr><td> Rotixa 50 rs santrifüjleyin </td><td> Andreas Hettich GmbH &amp; Co KG </td><td> 4910 </td><td></td></tr><tr><td> 5415 D Santrifüj </td><td> Eppendorf </td><td> Durduruldu </td><td></td></tr><tr><td> Astarlar </td> &lt;td&gt; Sigma-Aldrich </td><td> na </td><td></td></tr><tr><td> Probları </td><td> Sigma-Aldrich/Applied Biyosistem </td><td> na </td><td></td></tr><tr><td> TaqManEnvironmental master miks 2.0 </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4396838 </td><td></td></tr><tr><td> iQ SYBRGreen Supermix </td><td> Bio-Rad Laboratories BV </td><td> 170-8880 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroamper Optik 96-Well Reaksiyon Plaka </td><td> Applied Biosystems </td><td> N8010560 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroamper Optik Yapıştırıcı Film </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311971 </td><td></td></tr><tr><td> iQ 96-Well PCR Tabaklar </td><td> Bio-Rad Laboratories BV </td><td> 223-9441 </td><td></td></tr><tr><td> Microseal B Yapıştırıcı Contalar </td><td> Bio-Rad İşçiatories BV </td><td> MSB-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Real-time PCR Algılama Sistemi </td><td> Applied Biosystems </td><td> ABI PRISM 7900HT </td><td></td></tr><tr><td> Real-Time PCR Algılama Sistemi </td><td> Bio-Rad Laboratories BV </td><td> MyiQ Tek Renk </td><td></td></tr></tbody></table>

kan örneklerinden bakteriyel patojen algılama ve antimikrobiyal direnç testi için bir günlük iş akışı şeması

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Kan dolaşımı enfeksiyonları nedeniyle sepsis muhtemel tezahürü, ağır sepsis ve septik şok 1 yüksek mortalite oranları ile ilişkilidir. Bu nedenle, yeterli bir antibiyotik hızlı bir idare kan dolaşımı enfeksiyonlarının tedavisinde önemli bir öneme sahiptir. Bu süreçte kritik unsur bakteri tanımlama ve antibiyotik duyarlılık testi sonuçlarının büyük ölçüde bağımlı zamanlaması vardır. Bu parametreler her iki rutin zaman alıcı ve ortalama 24-48 saat 2, 4 alır kültürü bazlı testi ile elde edilir. Bu çalışmanın amacı, DNA bazlı enfeksiyonu kan hızlı bir şekilde tespit için testler, hem de hızlı bir antimikrobiyal duyarlılık test geliştirmektir. İlk testi tür veya cins-spesifik problar 5 ile tamamlanmaktadır rDNA tabanlı gerçek zamanlı PCR testi bir eubacterial 16S olduğunu. Bu sondalar, Pseudomonas dahil Gram-negatif bakteriler kullanma., Pseudomonas aeruginosave Escherichia coli gibi Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Streptococcus spp. ve Streptococcus pneumoniae dahil olmak üzere Gram-pozitif bakterilerin ayırt edilebilir. Bu multiprobe deneyi kullanılarak, etken mikro-organizma bir ilk kimlik 2 saat sonra verildi. İkincisi, S. antibiyotik duyarlılık testi için yarı-moleküler testi geliştirdi aureus, Enterococcus spp. ve (fakültatif) aerob Gram-negatif çubuklar 6. Bu test PCR bakteri 7 büyüme ölçmek için kullanılan hangi bir çalışmaya dayanıyordu. Kan kültürlerinde doğrudan hasat bakterilerin antibiyotiklere bir seçim ile 6 saat süreyle inkübasyona ve SYBR Green-tabanlı gerçek zamanlı PCR testi sonrasında büyümesini engellediği tespit edilmiştir. Bu iki yöntem birlikte aynı gün (Şekil 1) uygun bir antibiyotik tedavisinin seçimi yönlendirmek olabilir. Sonuç olarakTanımlama ve antibiyotik duyarlılık hem de, moleküler analizi patojen tespiti için daha hızlı bir alternatif sunar ve kan dolaşımı enfeksiyonu tanısı iyileştirebilir.

Bakteriyel patojen teşhis için basit bir günlük akışı düzeninin tasarım enfeksiyonu kan hızlı tanıma sağlar. Sekiz klinik bakteriyel hedefleri ve antibiyotik direnç profilleri dahil olması daha uygun tedaviye yol açabilir aynı gün klinisyen bir ilk fikir sunuyor.

Kan örneklerinden Bakteriyel Patojen Algılama ve Antimikrobiyal Direnç Testi için bir günlük iş akışı şeması

Kan dolaşımı enfeksiyonları; sepsis, ağır sepsis ve septik şokun olası gelişimi nedeniyle yüksek mortalite oranları ile ilişkilendirilmektedir1. ...

Bu prosedürün genel amacı, kan kültürü izolatlarının antibiyotik duyarlılığını geleneksel yöntemlerden daha kısa sürede tanımlamak ve değerlendirmektir. Bu işlem, öncelikle yeni bir 16 s ribozomal DNA MultiPro PCR testi kullanılarak kan kültürü izolatının tanımlanmasıyla gerçekleştirilir.Ardından izolat, bir dizi antibiyotikle altı saat boyunca inkübe edilir. Bir sonraki adım, kantitatif 16 s ribozomal D-N-A-P-C-R analizi kullanarak, antibiyotiğin varlığında izolatın büyüme durumunu veya büyüme inhibisyonunu belirlemektir. Sonuçlar, bir kan kültürü izolatının tanımlanmasının ve antibiyotik duyarlılık testinin, kültür ve PCR kombinasyonu aracılığıyla daha hızlı bir şekilde elde edilebileceğini göstermektedir.Bu tekniğin, otomatik phoenix veya IIC sistemleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, önceden kültürleme durumunun gerekmemesi ve tanımlama ile antibiyotik duyarlılık testi sonuçlarının aynı gün içinde alınabilmesidir. Prosedürü laboratuvarımızdan PhD öğrencileri Vandy Hanson ve GID gösterecektir. Mikrobiyal büyüme için pozitif olan 100 µL kan kültürünü, 900 µL %0,9 sodyum klorür içeren bir reaksiyon tüpünde seyreltin. Ardından, bakterileri çöktürmek için numuneyi 13.400 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.Reese, peleti 100 µL steril demiyeralize su içerisinde süspande et. Örneği, daha sonra kullanana kadar dört °C'de muhafaza et. Tüm örnekler hazır olduğunda, ilgili bakterilerin spesifik 16 s ribosomal DNA'sını amplifiye etmek için real-time PCR reaksiyon karışımlarını hazırla.Reaksiyon başına hacimleri 20 microliters'a ayarlamak için demisterilize su kullanın. 96 kuyucuklu bir PCR plakasındaki her kuyucuğa 20 microliters PCR karışımı paylaştırın. Ardından her kuyucuğa beş microliters numune ekleyin ve PCR plakasını kapatın.Ardından, sonuçları analiz etmek için PCR'ı ABI Prism 7, 900 HT gerçek zamanlı PCR sisteminde çalıştırın; PCR tamamlandığında önce analiz ayarları sekmesini kullanarak CT analizini 0,1 olarak ayarlayın. Daha sonra baseline yapılandırmalarını altıncı döngüde başlayacak ve 15. döngüde bitecek şekilde daraltın. Her örnek için CT değerini kaydedin.Bir PCR sonucunu pozitif kabul etmek için eşik değer genellikle 35 CT değeri olarak belirlenebilir. Bu örnekte, E. coli ile enfekte olmuş bir kan kültürünün tanımlama profili iki reaksiyon karışımında gösterilmiştir. Evrensel 16s ribozomal DNA primerleri kullanılmış ve sırasıyla 25,2 ve 25,95 CT değerlerinde iki amplifikasyon eğrisi oluşturulmuştur.Üçüncü amplifikasyon eğrisi Coli'ye özgü probdan elde edilmiştir. Diğer spesifik problar tespit edilebilir sinyaller üretmemiştir. Patojen tanımlandıktan sonra antibiyotik testi gerçekleştirilebilir.İşleme, pozitif bir kan kültüründen beş mililitre kan kültürleme ortamını bir serum separatör tüpüne aktararak başlayın. Numuneyi 2000 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin; santrifüj işleminin ardından tüpteki üst fazı atın. Daha sonra, steril bir pamuklu çubuk kullanarak, tüpün jel tabakasındaki bakterileri, 0.5 McFarland standardı bulanıklığında bir çözelti elde edilene kadar %0,9 sodyum klorür içerisine aktarın.Bu, mililitre başına yaklaşık 1,5 × 10⁸ koloni oluşturan birime karşılık gelir. Ardından, yaklaşık 5 × 10⁵ koloni oluşturan birim/ml konsantrasyonu elde etmek için süspansiyonu çift konsantrasyonlu Muller Hinton buyonunda seyreltin.Antibiyotik seçimlerinin her kuyucukta 50 µL bulunduğu bir mikrotitrasyon plağındaki her kuyucuğa, süspansiyondan 50 µL paylaştırın. Antibiyotikler yerine su içeren kuyucukları kullanarak her örnek için pozitif büyüme kontrolleri eklediğinizden emin olun. İşlem bittiğinde plağın üzerini kapatın.Ardından, bakteriyel büyümeye olanak sağlamak için plakayı 37 °C'de altı saat boyunca inkübe edin. Negatif büyüme kontrolü olarak bakteriyel süspansiyondan bir alikotu 4 °C'de sakladığınızdan emin olun. Altı saatlik inkübasyonun ardından, her kuyucuğun içeriğini ve negatif kontrol örneğini ayrı steril tüplere aktarın.16.000 ×g'de beş dakikalık santrifüj işleminin ardından, 80 µL süpernatantı uzaklaştırın ve peletleri 80 µL steril demineralize su içerisinde yeniden süspande edin. Örnekleri, 16S ribozomal DNA real-time PCR için kullanmadan önce su ile 1/10 oranında seyreltin.IQ cyber green super mix ve 16 s ribozomal DNA primerlerini kullanarak PCR karışımını hazırlayın ve 96 kuyucuklu bir PCR plakasına kuyucuk başına 20 µL olacak şekilde paylaştırın. Ardından, her bir örnekten 5 µL'yi kuyucuklara ekleyin ve plağı mühürleyin.Ardından, sonuçları analiz etmek için PCR'yi çalıştırın. İlk olarak, cutoff CT değerini hesaplayın. Genel olarak, cutoff CT değeri, pozitif büyüme kontrolünün CT değeri artı negatif büyüme kontrolünün CT değerinin 0,5 katı eksi büyüme kontrolünün CT değerine eşittir.Bununla birlikte, gram-negatif basilere karşı piperasilin tazobaktam ve seftazidim ile staphylococcus aureus'a karşı amoksasilin, oksasilin ve trimetoprim sülfametoksazol veya enterococcus SPP'de amoksasilin için 0,5 olan multiplikasyon faktörü 0,25'e düşürülmelidir. Her örnekteki suşların duyarlılığı veya direnci, örneğin CT değeri ile cutoff ct değeri karşılaştırılarak belirlenebilir.Kesme değerinin üzerindeki bir CT değeri duyarlılığı, kesme değerinin altındaki bir CT değeri ise direnci gösterir. Burada, bir antibiyotik duyarlılık amplifikasyon grafiği örneği verilmiştir. Daha önce tanımlanan E. coli suşu, her biri ayrı bir eğri ile temsil edilen birkaç antibiyotiğe karşı duyarlılık açısından test edilmiştir.Düşük CT değerine sahip örnekler, test edilen antibiyotiğe karşı direncin olduğunu gösteren, antibiyotik varlığında büyümenin gerçekleştiği örneklerdir. Buna karşılık, yüksek CT değeri, test edilen antibiyotiğe duyarlılığın olduğunu gösteren, büyümenin gerçekleşmediği bir örneği temsil eder. Bu teknik, yeterince uzmanlaşıldığında ve doğru şekilde uygulandığında dokuz saat içinde tamamlanabilir.

one-day-workflow-scheme-for-bacterial-pathogen-detection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

In situ hibridizasyon tayininde floresan bir Peptid Nükleik Asit (PNA BALIK) kullanarak bir pozitif kan kültürü, Enterococcus faecalis ve diğer Enterococcus türleri doğrudan tanımlanması için hızlı bir protokoldür.

Belirlenmesi için 1.5 Saat Usulü Enterococcus</emDoğrudan Kan Kültürleri> Türler

Litik faj biyosensörler ve antikor boncuk metisiline dirençli (MRSA) ve duyarlı stafilokok bakterileri ayırt edebiliyoruz. Faj bir kuvars kristal mikro sensörünün bir yüzey üzerine Langmuir-Blodgett yöntemi ile hareketsiz ve geniş stafilokok prob olarak çalışıyordu. Antikor boncuk MRSA tanır.

Antibiyotik Dirençli Stafilokok bakteri tespiti için biyosensör

Pozitif kan kültürü hızlı bir Bakteri taneleri bir preparasyon, MALDI-TOF ile tanımlama, Gram boyama antibiyotik duyarlılık testi ve PCR-esaslı testi gibi uygulamalar için bir numune olarak kullanılabilir. Sonuçlar hızla kan dolaşımı enfeksiyonlarından muzdarip hastaların sonuçlarını iyileştirmek için klinisyenler için tebliğ edilebilir.

Hızlı Bakteriyel Teşhis ve Antibiyotik Duyarlılık Testi için bir Kan Kültürü Peleti hazırlanması

Floresan etiketli antibiyotikler antimikrobiyal direnç birden fazla yönünü incelemek için kullanılabilecek güçlü araçlardır. Bu makalede floresan etiketli antibiyotiklerin hazırlanması ve bakterilerde antibiyotik direnci eğitimi için uygulama açıklanmaktadır. Problar spektrofotometri, akış sitometrisi ve mikroskopi ile bakteriyel direnç (örn. efflux) mekanizmalarını incelemek için kullanılabilir.

Floresan Antibiyotik Probları Kullanılarak Bakteriyel Direncin Görüntülenmesi

Bu protokol, D 2O metabolizmasının tek hücreli uyarılmış Raman saçılma görüntülemesi ile 2.5 saat içinde hızlı antimikrobiyal duyarlılık testi (AST) testi sunar. Bu yöntem, klinikte hızlı tek hücreli fenotipik AST için dönüştürücü olan idrar veya tam kan ortamındaki bakteriler için geçerlidir.

Tek Bir Bakteride Döteryum Birleşmesinin Uyarılmış Raman Saçılma Görüntülemesi ile Hızlı Antimikrobiyal Duyarlılık Testi

Burada, antibiyotiğe dirençli bakterilerin sudan izolasyonu ve tanımlanması ve antibiyotik direnç genlerinin (ARG'ler) moleküler karakterizasyonu için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Kültür temelli ve kültüre dayalı olmayan (metagenomik analiz) tekniklerin kullanımı, toplam bakteri çeşitliliği ve Mumbai, Hindistan'dan tatlı sularda bulunan farklı ARG'lerin toplam havuzu hakkında tam bilgi sağlar.

Su Kaynaklı Antibiyotiğe Dirençli Bakterilerin İzolasyonu ve Tanımlanması ve Antibiyotik Direnç Genlerinin Moleküler Karakterizasyonu

Burada akıllı, yüksek verimli antimikrobiyal duyarlılık testi/faj tarama sisteminin prensibini, yapısını ve talimatını tanıtıyoruz. Uygulaması, örnek olarak Çin'in Shandong kentindeki kümes hayvanlarından izole edilen Salmonella kullanılarak gösterilmiştir. Lar indeksi hesaplanır ve antimikrobiyal direncin değerlendirilmesindeki önemi kapsamlı bir şekilde tartışılır.

Akıllı Yüksek Verimli Antimikrobiyal Duyarlılık Testi / Faj Tarama Sistemi ve Lar Antimikrobiyal Direnç İndeksinin Uygulanması

EUCAST, otomatik kan kültürleri için doğrudan bir antimikrobiyal duyarlılık testi (AST) protokolü geliştirmiştir. Bununla birlikte, kütle spektrometresi tabanlı mikrobiyal tanımlamaya bağımlılığı, otomatik bir mikrobiyal tanımlama sisteminde doğrudan bir aşı hazırlama protokolü kullanılarak ortadan kaldırılabilir. Bu yaklaşım, numune alındıktan sonraki 24 saat içinde AST raporları sağlayabilir.

Kütle Spektrometresi Olmadan EUCAST RAST Yöntemini Kolaylaştırmak için Otomatik Bir Mikrobiyal Tanımlama Sistemi Kullanarak Doğrudan Mikrobiyal Tanımlama

Çeşitli bakteriyel patojenler, doğru bir şekilde tespit edilmez ve derhal tedavi edilmezse solunum yolu enfeksiyonlarına neden olabilir ve ciddi sağlık sorunlarına yol açabilir. Döngü aracılı izotermal amplifikasyon yoluyla bu patojenlerin hızlı ve doğru tespiti, klinik ortamlarda solunum yolu enfeksiyonlarının etkili bir şekilde yönetilmesini ve kontrol edilmesini sağlar.

Mikroakışkan çip bazlı döngü aracılı izotermal amplifikasyon yoluyla alt solunum yolu enfeksiyonlarına neden olan bakteriyel patojenlerin hızlı tespiti

Bu protokol, yoğun bakım ünitesindeki hastalarda alt solunum yolu enfeksiyonlarına yol açan 15 patojenin bir saat içinde hasta başında tespit edilmesini sağlayan, tamamen entegre mikroakışkan çip tabanlı bir LAMP yöntemini açıklamaktadır.

YBÜ Hastalarında Alt Solunum Yolu Enfeksiyonlarına Yol Açan Patojenlerin Hasta Başı Hızlı Tespiti

Öğrenin, kan kültürü izolatlarındaki bakteriyel patojenleri ve antibiyotik duyarlılıklarını hızlıca belirlemek için PCR tabanlı tanı yöntemini. Bu teknik, aynı gün içinde sonuç vererek klinik kararları hızlandırır.

Kan örneklerinden Bakteriyel Patojen Algılama ve Antimikrobiyal Direnç Testi için bir günlük iş akışı şeması

Daha fazla video keşfet