Kan örneklerinden Bakteriyel Patojen Algılama ve Antimikrobiyal Direnç Testi için bir günlük iş akışı şeması

Bu prosedürün genel amacı, kan kültürü izolatlarının antibiyotik duyarlılıklarını geleneksel yöntemlere göre daha kısa sürede belirlemek ve değerlendirmektir. Bu, önce kan kültürü izolatının tanımlanmasıyla gerçekleştirilir. Yeni bir 16 s ribozomal, DNA MultiPro PCR testi kullanarak.

Daha sonra izolat, altı saat boyunca bir antibiyotik paneli ile inkübe edilir. Bir sonraki adım, kantitatif bir 16 s ribozomal D-N-A-P-C-R testi kullanarak antibiyotiğin varlığında izolatın inhibisyonundaki büyümeyi veya büyümeyi belirlemektir. Sonuç olarak, sonuçlar, bir kan kültürü izolatının tanımlanması ve antibiyotik duyarlılık testinin, bu kültür ve PCR kombinasyonu yoluyla daha hızlı elde edilebileceğini göstermektedir.

Bu tekniğin, otomatik anka kuşu veya IIC sistemleri kullananlar gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, önceden kültürleme durumuna gerek olmaması ve tanımlama ve antibiyotik duyarlılık testinden elde edilen sonuçların aynı gün içinde elde edilebilmesidir. Prosedürü gösterecek olan Vandy Hanson ve laboratuvarımızdan doktora öğrencileri olan GID ing olacak: 900 mikrolitre% 0.9 sodyum klorür içeren bir reaksiyon tüpünde mikrobiyal büyüme için pozitif 100 mikrolitre kan kültürünü seyreltin. Daha sonra, santrifüjlemeyi takiben bakterileri peletlemek için numuneyi beş dakika boyunca 13.400 kez G'de santrifüjleyin.

Reese, peleti 100 mikrolitre steril demineralize suda askıya alın. Numuneyi daha fazla kullanılana kadar dört santigrat derecede kurun. Tüm numuneler hazır olduğunda, ilgilenilen bakteriden spesifik 16 s ribozomal DNA'yı amplifiye etmek için gerçek zamanlı PCR reaksiyon karışımlarını hazırlayın.

Hacimleri reaksiyon başına 20 mikrolitreye ayarlamak için demineralize su kullanın. 96 oyuklu bir PCR plakasında kuyu başına 20 mikrolitre PCR karışımı alikot. Daha sonra her bir oyuğa beş mikrolitre numune ekleyin ve PCR plakasını kapatın.

Ardından, PCR tamamlandıktan sonra sonuçları analiz etmek için PCR'yi A BI Prism 7, 900 HT gerçek zamanlı PCR sisteminde çalıştırın, önce CT analizini 0.1'e ayarlamak için analiz ayarları sekmesini kullanın. Ardından, altıncı döngüyü başlatmak ve döngü 15'i bitirmek için temel yapılandırmaları daraltın. Her numune için CT değerini kaydedin.

Bir PCR sonucunu pozitif olarak kabul etmek için kesme değeri genellikle 35'lik bir CT değerine ayarlanabilir. Bu örnekte, e coli ile enfekte olmuş bir kan kültürünün tanımlama profili iki reaksiyon karışımında gösterilmiştir. Üniversal 16 s ribozomal DNA primerleri dahil edildi ve CT 25.2 ve 25.95'in iki amplifikasyon eğrisi oluşturuldu.

Üçüncü amplifikasyon eğrisi, Coli'ye özgü probdan türetilir. Diğer spesifik problar tespit edilebilir sinyaller üretmedi. Patojen tanımlandıktan sonra antibiyotik testi yapılabilir.

Pozitif bir kan kültüründen beş mililitre et suyunu bir serum ayırıcı tüpe aktararak başlayın. Numuneyi santrifüjlemeyi takiben 10 dakika boyunca 2000 kez G'de santrifüjleyin, supan ajanını tüpten atın. Daha sonra steril bir pamuklu çubuk kullanarak, bakterileri tüpün jel tabakasından 0.5 McFarland standardında bulanıklığa sahip bir çözelti elde edilene kadar% 0.9 sodyum klorüre aktarın.

Bu, mililitre başına yaklaşık 1.5 çarpı 10 ila sekiz koloni oluşturan birime karşılık gelir. Daha sonra, süspansiyonu çift konsantrasyonlu Muller Hinton'da seyreltin. Mililitre başına birim oluşturan beş koloni için yaklaşık beş kez 10 ila beş konsantrasyon elde etmek için iki et suyu.

Aliquot: Süspansiyonun oyuğu başına 50 mikrolitre, zaten bir dizi antibiyotik kuyusu başına 50 mikrolitre içeren bir mikrotitre plakasında. Antibiyotik yerine su içeren kuyular kullanarak her numune için pozitif büyüme kontrolleri eklediğinizden emin olun. Bittiğinde plakayı örtün.

Daha sonra bakteri üremesine izin vermek için plakayı altı saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Negatif büyüme kontrolü olarak bakteri süspansiyonunun bir kısmını dört santigrat derecede sakladığınızdan emin olun. Altı saatlik inkübasyondan sonra, her bir oyuğun içeriğini ve negatif kontrol numunesini ayrı steril tüplere aktarın.

16.000 kez beş dakikalık bir santrifüjlemenin ardından. G, 80 mikrolitre süpernatanı çıkarın ve peletleri 80 mikrolitre steril demineralize suda tekrar süspanse edin. Numuneleri 16 s ribozomal, DNA gerçek zamanlı PCR için kullanmadan önce bir ila 10 su arasında seyreltin.

IQ siber yeşil süper karışım ve 16 s ribozomal DNA primerleri ve alikot kullanarak PCR karışımını hazırlayın. 96 oyuklu bir PCR plakasında kuyu başına 20 mikrolitre. Daha sonra kuyucuklara her numuneden beş mikrolitre ekleyin ve plakayı kapatın.

Ardından, sonuçları analiz etmek için PCR'yi çalıştırın. İlk olarak, kesme CT değerini hesaplayın. Genel olarak, kesme BT, pozitif büyüme kontrolünün BT'si artı negatif büyüme kontrolünün BT'si eksi büyüme kontrolünün BT'sinin 0.5 katına eşittir.

Bununla birlikte, gram-negatif çubuklarda tazobaktam ve CEF dazadi ile piperasilin için ve ayrıca staphylococcus aureus'ta veya amoksisilin'den sülfametoksazol ile amoksisilin, oksasilin ve trimetoprim için. Enterococcus SPP'de 0.5 olan çarpma faktörü 0.25'e düşürülmelidir. Her bir numunedeki suşların duyarlılığı veya direnci, numunenin BT'si kesme ct ile karşılaştırılarak belirlenebilir.

Kesme noktasının üzerindeki bir CT değeri duyarlılığı gösterirken, kesme noktasının altındaki bir CT direnci gösterir. İşte bir antibiyotik duyarlılık amplifikasyon grafiği örneği. Daha önce tanımlanan e coli suşu, her biri ayrı bir eğri ile temsil edilen birkaç antibiyotiğe duyarlılık açısından test edildi.

Düşük CT değerine sahip numuneler, test edilen antibiyotiğe direnç gösteren bir antibiyotik varlığında büyümenin meydana geldiği numunelerdir. Aksine, yüksek bir CT değeri, bir kez ustalaştıktan sonra test edilen antibiyotiğe duyarlılığı gösteren hiçbir büyümenin meydana gelmediği bir numuneyi temsil eder. Bu teknik, düzgün bir şekilde yapılırsa dokuz saat içinde yapılabilir.