Name: İnsan Kanı StemCell Teknolojileri RosetteSep Kit ile gelen NK Hücreleri zenginleştirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Öğrenin insan kanından negatif seleksiyonla NK hücreleri izolasyonu. RosetteSep kiti ile yüksek saflıkta ve canlılıkta doğal öldürücü hücreler elde edin. Bu yöntem immünoloji araştırmalarında güvenilir sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Her Rozet Eylül izolasyon kokteyl ile birlikte ayrıntılı bir protokol ve StemCell teknolojileri 1 online olarak mevcuttur.

<ol><li>Procedures and instruction manuals. , 
	
 <a target="_blank" href="http://www.stemcell.com/technical/technicalrsproc.aspx">http://www.stemcell.com/technical/technicalrsproc.aspx</a> Forthcoming.</li>
</ol>

Bu tekniği kullanarak izole hücreler diğer hücre ayırma kitleri kullanılarak farklı popülasyonlar daha ayrılabilir.

PBS% 2 FCS ve Histopaque çözümleri ile desteklenmiş prosedürü başlamadan önce oda sıcaklığına getirilmelidir.

İnsan kanı stemcell teknolojileri rosettesep kit ile gelen nk hücreleri zenginleştirilmesi

Enrichment of NK Cells from Human Blood with the RosetteSep Kit from StemCell Technologies

Doğal öldürücü (NK) hücreleri doğuştan gelen bağışıklık sistemine ait olup, kanser ve enfeksiyonlara karşı mücadelede önemli bir rol oynamak, büyük granüllü sitotoksik lenfositler, ancak, gebelik ve transplant reddini erken aşamalarında da sorumlu tutulmaktadır. Bu hücreler izole edilebilir olan periferik kan, mevcut. Hücreler, pozitif veya negatif seçim kullanılarak izole edilebilir. Olumlu seçimi için biz sadece tüm hücreleri ama ilgi hücreler mevcut yüzey belirteçleri hedefleyen antikor kokteylleri kullanan negatif seçimi için ise ilgi hücreleri mevcut bir yüzey işaretleyici yönelik antikorlar kullanır. Bu son teknik, böylece istenmeyen hücre aktivasyonu ya da farklılaşma riskini azaltarak, hücrelerin antikor serbest ilgi bırakarak avantajı sunuyor. Bu video protokol StemCell teknolojileri RosetteSep kiti kullanılarak, negatif seleksiyon tarafından nasıl insan kanı NK hücreleri ayrı göstermektedir. Bu prosedür, insan periferik kan (insan denekler korumak için bir kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanmış protokol altında) elde ve NK hücreleri yok belirteçlerinin bağlamak antikorların bir kokteyl ile karıştırma, ancak, periferik diğer tüm mononükleer hücreler içerir kan (örneğin, T lenfositleri, monositler ...). Kokteyl bulunan antikorlar, A üzerinde eritrosit glycophorin yönelik antikorlar konjuge. Bu nedenle, tüm istenmeyen hücre ve kırmızı kan hücrelerinin kompleksleri kalmış olacak. Kan ve antikor kokteyli karışımı, daha sonra seyreltilmiş Histopaque degrade üzerine yerleştirilmiştir ve santrifüj edilir. NK hücreleri (&gt;% 80 saf) Histopaque ve seyreltilmiş plazma arasındaki arayüz toplanabilir. Benzer kokteyller, insan T lenfositleri gibi diğer hücre popülasyonlarının, zenginleştirilmesi için kullanılabilir.

Doğal katil hücreler, lenfosit küçük bir nüfus. Burada StemCell Teknolojileri kit kullanarak, bu hücrelerin insan kanı negatif seleksiyon tarafından nasıl izole etmek göstermektedir. Elde edilen hücreler, bu nedenle bir takım prosedürler için kullanılacak hazır antikorlar tarafından uygulanabilir ve bakir, ve.

İnsan Kanı StemCell Teknolojileri RosetteSep Kit ile gelen NK Hücreleri zenginleştirilmesi

Doğal öldürücü (NK) hücreler, doğuştan gelen bağışıklık sistemine ait olan ve kansere karşı mücadelede önemli roller oynayan, büyük granüllü sitotoksik lenfositlerdir...

Merhaba, ben Christine Beaton. California Üniversitesi Irvine'deki Fizyoloji ve Biyofizik Bölümü'nde, George Chen'in laboratuvarında araştırma asistanıyım. Bugün sizlere, Stem Cell Technologies kokteyl kitlerini kullanarak insan kanından doğal öldürücü hücrelerin negatif seleksiyonunun nasıl yapılacağını göstereceğim.Stem Cell Technologies firmasının bu kitini kullanmamızın nedeni, bize çok yüksek hücre saflığı sağlaması ve negatif seçimin, bir antikora bağlanmamış hücreler elde etmemize olanak tanımasıdır. Böylece bu hücrelerle ilgili beklenmedik bir durumla karşılaşmazsınız. TSEP kitinin çalışma prensibi, kandaki ilgilenmediğiniz tüm hücrelere bağlanacak antikorların bulunmasıdır.Bu durumda, T hücreleri, B hücreleri, monositler ve ardından alyuvarlardaki glikoforin A'ya bağlanacak antikorlar mevcuttur; burada yapılan işlem, bir akyuvara karşı olan bir antikoru, bir alyuvara karşı olan bir antikora bağlamaktır. Böylece, istenmeyen tek bir akyuvar ile birden fazla alyuvardan oluşan bir kompleks meydana gelecektir ve alyuvarlar akyuvarlardan daha yüksek yoğunluğa sahip olduğu için, kan ve antikorlarınızı içeren karışım kokteylini bir gradyana yerleştirip santrifüj ettiğinizde, alyuvarlar tüpün dibine çökecek ve istemediğiniz tüm akyuvarları da beraberinde sürükleyecektir. Böylece gradyanın üst kısmında, herhangi bir antikora bağlanmamış, saf veya neredeyse saf doğal öldürücü hücreleri toplayabileceksiniz.Şimdi, bir insan kanı tüpünden NK hücrelerini izole etmeye başlayalım. Bu, sodyum heparinli tüpe yeni alınmış bir kan örneğidir. Gradyan olarak Roset ep, insan NK hücresi zenginleştirme kokteyli kullanacağım.Deneyimin ilerleyen aşamalarında 1.077 yoğunluğuna sahip olan 10 77 histo pack kullanacağım; ayrıca %2 fetal calf serum ile desteklenmiş bir şişe PBS hazırladım. Bu bileşenleri buzdolabında sakladığım için kullanmadan önce oda sıcaklığına geldiklerinden emin oluyorum. Şimdi, kan tüpünün tamamını alıp 50 ml'lik bir fcan tüpüne aktaracağım.Vakum kapları olduğu için, içeriye hava girmesini sağlayarak sıçratmadan açabilmek adına, kapaktaki küçük çentiği buluyorum ve tüpün içine hava girmesi için kapağı dikkatlice kaldırıyorum. Tüpteki vakum bir kez kırıldığında, kapağı daha kolayca çıkarabiliyorum ve ardından 10 mL'lik bir pipet kullanarak tüpteki kanın tamamını pipetliyorum. Bu nedenle, yaklaşık 10 mL kan olması gerektiğini öngörüyorum.Burada 9,5 ml kanım var ve bu 9,5 ml'nin tamamını bu 50 ml'lik falcon tüpüne koyacağım. Ardından, içinde kan bulunan pipet doğrudan biyotehlikeli atık torbasına gider; tüpe ise her zaman biraz çamaşır suyu koyarım, kapatırım ve sonra biyotehlikeli atık torbasına atarım. Antikor kokteyli eklenmeden önce kan bu şekilde görünür.Şimdi antikor kokteylini kana ekleyeceğim; yaklaşık 9,5 ml kanım olduğu ve her ml kan için 50 µL kokteyl eklemem gerektiği için, kanıma 450 µL kokteyl ekleyeceğim. Ardından nazikçe karıştıracağım ve neredeyse anında aglütinasyonun gerçekleştiğini göreceksiniz. Şu an gördüğünüz gibi aglütinasyon gerçekleşti.Böylece, istenmeyen beyaz kan hücreleri ile kırmızı kan hücreleri arasındaki çapraz sızıntı şu anda gerçekleşiyor. Bir zamanlayıcıyı 20 dakikaya ayarlayacağım ve tüpü 20 dakika boyunca davlumbazda bu şekilde bekleteceğim. Kan, rosette sub cocktail ile 20 dakika boyunca inkübe edilmiştir.Böylece, karışımı PBS artı fetal calf serum ile bire bir oranında seyrelteceğim. Bu karışımı, 15 ml'lik iki histo pack 10 77 üzerine ekleyeceğim. Bundan sonra, santrifüj cihazında 20 dakika boyunca döndüreceğim.Yaklaşık 10 mL kan ve antikor kokteylim var. Bu nedenle, içine %2 fetal kal serum içeren 10 mL PBS ekleyeceğim. Böylece bire bir seyreltme yapmış olacağım.PBS'i kana eklediğimde gördüğünüz üzere hemen karışmadığı için nazikçe karıştırmam gerekiyor. Bu nedenle sadece nazikçe karıştırıyorum. Şu an elimde PBS ve kanın bire bir karışımı var ve bunu 15 ml'lik histo pack'e ekleyeceğim.Kanın histo pak ile karışmasını önlemek için onu dikkatlice üzerine ekleyeceğim. Bunun için, tüm kanı alacak olan 25 µL pipet yerine, 10 µL pipet kullanarak birkaç adımda ilerleyeceğim. Kolayca ekleme yapabilmek için, histo pak tüpünü neredeyse yatay tutuyorum.Tüpe az miktarda kan damlatacağım ve tüpü histo pakete doğru indireceğim. Ardından, kanı çok yavaş bir şekilde histo paketin üzerine katmanlayacağım. Yeterli bir kan katmanı oluşturduktan sonra, pipetleme işlemini biraz daha hızlandırabilirim ve tüpü yavaşça dikey konuma geri getirebilirim.Şimdi, antikor kokteyli ve PBS içeren 20 ml'lik kan karışımının tamamını, iki adet 15 ml'lik histo pack üzerine ekledim. Tüpün birleşim noktasında görebileceğiniz üzere, kırmızı kan hücrelerinden oluşan küçük agregatların gradiyent içinde yavaşça çökmeye başladığını görüyorsunuz; bu süreci hızlandırmak için santrifüj işlemi uygulayacağız. Böylece 20 dakika içinde tüm kırmızı kan hücreleri tüpün dibine çökmüş olacaktır.Ve santrifüj yaparken çok önemli bir nokta vardır; freni kapatmak istersiniz çünkü çok hızlı frenleme bileşenlerinizi bozabilir. Bu yüzden freni her zaman kapatırız ve ardından santrifüjü 20 dakika boyunca çalıştırıp işini yapmasına izin vereceğim. Bileşen şu anda 20 dakika boyunca döndürülmüş durumdadır.Böylece farklı hücre katmanlarına sahip olduk. Buradaki tüpün alt kısmından başlıyoruz. Burada tüm alyuvarlar ve ilgilenmediğimiz hücreler yer alıyor.Bunun üzerinde net bir gradyan tabakası ve onun üzerinde ise sarımsı bir plazma tabakası bulunur. Ve bugün ilgilendiğimiz hücreler, yani NK hücreleri, gradyan ve plazma tabakaları arasındaki bu ince beyaz hücre şerididir.Dolayısıyla, NK hücreleri kan hücrelerinin yalnızca küçük bir kısmını oluşturduğu için bu tabaka çok, çok incedir. Şimdi, steril bir past pipeti kullanarak NK hücresi tabakasını kaldıracağım. Bu tabakayı yeni ve boş bir 50 mil Falcon tüpüne aktaracağım.Ardından katmana gidiyorum ve onu pipetle çekiyorum. Tabii ki, çok az hücre var. Çok sayıda hücreniz olduğunda, hücre sayısının bu kadar az olduğu durumlarda katmanı çok daha temiz bir şekilde alabilirsiniz.Üretici firmanın bildiriminde önerildiği üzere, hücre kaybını önlemek için hücrelerle birlikte gradyentin bir kısmını almanız tavsiye edilir. Bu nedenle, orada hala bazı hücreler gördüğüm sürece pipetle çekmeye devam ediyorum. Tüm hücreleri çıkardıktan sonra, berrak reaktif ile sarımsı plazma arasında belirgin bir kontrast görmelisiniz.Böylece tüm hücreleri çıkardığıma inanıyorum. Gradyana baktığınızda, histo pack ile plazma arasındaki ara yüzeyde beyaz ve bulanık herhangi bir yapı görmüyorsunuz. Şimdi gradyanda gördüğüm tüm NK hücrelerini çıkardım, onları yeni bir 50 mil Falcon tüpüne yerleştirdim ve tüpe hemen %2 fetal calf serum ile desteklenmiş PBS ekledim.Hacmi 50 ml'ye tamamladım ve hücreleri çöktürmek için santrifüj edeceğim. Bu, ilk yıkama olacaktır. Hücreleri toplamda iki kez yıkamak için aynı prosedürü ikinci kez tekrarlayacağım.Bundan sonra hücreler, ister kültüre ekme ister akış sitometrisi boyaması için kullanma şeklinde yapmak istediğiniz herhangi bir işlem için hazır olacaktır. NK hücrelerinin saflığı en az %80, hatta daha fazla olmalıdır. Bu prosedürle %98'e kadar saflık elde ettim.Böylece bugün sizlere, StemCell Technologies TS kitlerini kullanarak insan kanından doğal öldürücü hücreleri izole etmek için oldukça hızlı ve güvenilir bir teknik gösterdim. Tabii ki, insan, sıçan veya fareden diğer hücre tiplerini izole etmek isterseniz, T hücre izole kitlerinden herhangi birini kullanabilirsiniz. Örneğin, T hücreleri, B hücreleri ve hatta T hücrelerinin alt tipleri için mevcut kitleri bulunmaktadır.

enrichment-nk-cells-from-human-blood-with-rosettesep-kit-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada genişletmek ve verimli bir şekilde arındırmak çok sayıda insan NK hücre ve kendi fonksiyonunu değerlendirmek için bir metodu tanımlar.

Genişleme, Saflaştırılması, ve İnsan Periferik Kan NK Hücrelerinin Fonksiyonel Değerlendirme

Bu video, hücre dışı akı analizörü kullanarak aktive edilmiş insan NK hücrelerinde enerji metabolizmasını analiz etme yöntemini göstermektedir. Elektron taşıma zinciri komplekslerinin farklı inhibitörleri, oksijen tüketim oranı veya OCR ile ölçülen ATP sentezini etkiler ve hücresel metabolizma ve biyoenerjetik hakkında bilgi sağlar.

Hücre dışı akı analizörü kullanılarak insan NK hücrelerinde enerji metabolizmasının gerçek zamanlı izlenmesi

Bu protokol, geliştirme, genişleme ve hESC ve iPSCs türetilen NK hücreleri, in vivo görüntüleme açıklar.

Geliştirme, Genişleme ve<em&gt; In vivo</em&gt; İnsan Embriyonik Kök Hücreleri (hESC) den İnsan NK Hücrelerinin İzleme ve ve Bağlı Pluripotent Kök Hücre (iPSCs)

Basit ve güvenilir bir yöntem, örneğin, farklı NK hücresi alt-gruplar içinde degranülasyonu, sitokin ve kemokin üretimi gibi NK hücresi fonksiyonlarının bir dizi analiz için tarif edilmektedir.

Akış NK Hücre Fonksiyonları İzleme Testi Sitometri tabanlı

Bu çalışmanın amacı hücrelerdeki birincil doğal öldürücü (NK) başarılı gen iletim için izin teknolojileri formüle etmek oldu. İnsan lentiviral iletim dextran aracılı veya fare birincil NK hücreleri sonuçlarında yüksek gen ifade verimliliği. Bu yöntemi, gen iletim NK hücre genetik manipülasyon büyük ölçüde artıracaktır.

Dextran fare ve insan birincil NK hücreleri Lentiviral iletim verimliliğini artırır

Kantitatif insan doğal katil hücrelerin sitotoksik etkinliğini belirlemek için Akış Sitometresi tabanlı yöntemi burada gösterilir.

Akış Sitometresi tabanlı sitotoksisite tahlil insan NK hücre etkinliği değerlendirilmesi için

Burada, mekanik çalışma içinde in vitro ve in vivoiçin bir besleyici-Alerjik farklılaşma sistemi kullanılarak gen susturmak fare NK hücreleri toplu üretim için bir protokol mevcut.

Roman besleyici-Alerjik sistemi fare doğal katil hücreler Vitro seri üretim için

İnsan doğal öldürücü hücrelerindeki terapötik antikorlar tarafından FcφRIIIa güdümlü olayları incelemek için bir protokol burada açıklanmıştır. Bu yapay stimülasyon platformu, degranülasyon, kemokin/sitokin üretimi gibi aşağı akış efektör fonksiyonlarının ve bağlamada yer alan antikorların FcφRIIIa ve Fc bölümlerinin aracılık ettiği sinyal yollarının sorgulenmesine izin verir.

Terapötik Antikorların Varlığında FcφRIIIa Katılımı tarafından Yönlendirilen İnsan Doğal Öldürücü Hücre Olaylarının Değerlendirilmesi

Mevcut protokol, hafif sitotoksisiteye sahip CD3-/CD45+CD56+ hücrelerinin, hem 3D hem de 2D kültür koşulları altında insan genişlemiş potansiyel kök hücrelerinden (hEPSC'ler) nasıl ayırt edileceğini göstermektedir. Bu, karmaşık mikro çevrenin tahrip edilmeden rutin fenotipik doğrulamaya izin verir.

İnsan Genişletilmiş Potansiyel Kök Hücrelerden Doğal Öldürücü Hücrelerin Üretilmesi

Burada, insan iPSC'den türetilmiş kimerik antijen reseptörü (CAR) eksprese eden doğal öldürücü hücreleri çeşitli malignitelere karşı daha iyi öldürme ile ayırt etmek ve genişletmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu protokol, doğal öldürücü (NK) optimize edilmiş iPSC'den türetilmiş CAR-NK hücrelerinin farklılaşmasını ve genişlemesini ve çeşitli tümör hücre hatlarına karşı antitümör aktivitesinin ölçümünü gösterir.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kimerik Antijen Reseptörü İfade Eden Doğal Öldürücü Hücrelerdeki Gelişmeler

Öğrenin insan kanından negatif seleksiyonla NK hücreleri izolasyonu. RosetteSep kiti ile yüksek saflıkta ve canlılıkta doğal öldürücü hücreler elde edin. Bu yöntem immünoloji araştırmalarında güvenilir sonuçlar sağlar.

İnsan Kanı StemCell Teknolojileri RosetteSep Kit ile gelen NK Hücreleri zenginleştirilmesi

Daha fazla video keşfet